桑樹小分子熱激蛋白基因Mn16.8-CⅠ啟動子及其重組表達載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了桑樹小分子熱激蛋白基因Mn16.8?C Ⅰ啟動子及其重組表達載體和應(yīng)用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，該基因在高溫脅迫下能夠上調(diào)下游基因表達，因此可以利用該基因的特性，通過溫度調(diào)控目的基因表達從而調(diào)控植物抗逆性或調(diào)控抗病能力；同時為研究植物抗逆、抗病等提供了重要的啟動子元件，也可以用于植物抗逆基因工程育種，因而具有廣泛的應(yīng)用價值。
【專利說明】
桑樹小分子熱激蛋白基因 Mn16.8-G I啟動子及其重組表達載 體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-c I啟動 子，還涉及含有桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子的重組表達載體及相應(yīng)的應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生長在自然環(huán)境中的植物不可避免地受到各種環(huán)境脅迫的危害。當(dāng)遭受逆境脅迫 后，植物啟動應(yīng)激反應(yīng)，其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和分子水平上發(fā)生一系列變化。在長期進化 過程中，植物發(fā)展和形成了一套復(fù)雜的機制以適應(yīng)周圍環(huán)境的變化。
[0003] 植物在高溫脅迫下能迅速合成一類蛋白質(zhì)一熱激蛋白（HSPs) dSPs作為分子伴 侶，能協(xié)助新生肽鏈折疊、組裝、定位、運輸，修復(fù)脅迫下的變性蛋白及降解錯誤折疊的蛋 白。小分子量熱激蛋白（sHSPs)是一類種類較多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、具有功能多樣性的熱激蛋白。在 高溫脅迫下，sHSPs結(jié)合非天然蛋白防止其發(fā)生不可逆聚集，在植物抵抗高溫脅迫中發(fā)揮重 要作用。
[0004] 桑樹是一種多年生木本植物，除了其桑葉能為家蠶提供食物外，桑樹還具有重要 的藥用、食用價值以及生態(tài)保護功能。桑樹作為優(yōu)良的生態(tài)經(jīng)濟樹種，對高溫、干旱、高鹽、 低溫等逆境脅迫具有一定的抗逆性。但是，目前對桑樹抗逆性的機制研究較少，特別是桑樹 在高溫脅迫下如何調(diào)控下游基因表達未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8_C I啟動 子;本發(fā)明的目的之二在于提供含有桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子的重組表 達載體;本發(fā)明的目的之三在于提供桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子在高溫脅 迫下誘導(dǎo)基因表達中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之四在于提供桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子在調(diào)控植物抗逆性或調(diào)控抗病能力中的應(yīng)用。
[0006] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 1、從桑樹基因組取Mnl6.8-C I基因上游1500bp啟動子序列設(shè)計引物，克隆并測序 驗證，獲得桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-CI啟動子，其核苷酸序列如SEQIDN0.3所 不。
[0008] 2、利用桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子構(gòu)建重組表達載體，優(yōu)選為由 如SEQIDN0.3所示的序列連入植物表達載體pBI121的HindIΠ 和BamHI酶切位點，獲得 pBI121-Mnl6.8-C I 。
[0009] 3、所述桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子在高溫脅迫下誘導(dǎo)基因表達 中應(yīng)用;優(yōu)選的，所述高溫為溫度高于35°C ;更優(yōu)選的，所述高溫為溫度為35~39°C。
[0010] 利用桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子受高溫誘導(dǎo)表達，在啟動子下游 連接功能基因，如抗逆基因或抗病基因，從而調(diào)控植物的抗逆性或調(diào)控抗病能力。
[0011] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明提供的桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-c I啟動 子，可在植物受到高溫脅迫是啟動目的基因表達，當(dāng)逆境脅迫消失時，目的基因的表達量又 會迅速恢復(fù)，因此不會影響植物整個生長發(fā)育過程，可以廣泛應(yīng)用于植物抗逆基因工程育 種中。
【附圖說明】
[0012] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0013] 圖1為桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-c I啟動子和pBI121-PMnl6.8-C I轉(zhuǎn)基因 載體的構(gòu)建（a:載體構(gòu)建示意圖，b:重組質(zhì)粒的電泳檢測及雙酶切驗證。M:Maker，1 : Mnl6.8-C I promoter，2:pBI121，3:pBI121-PMnl6.8-C 1，4:雙酶切pBI121-PMnl6.8-C 1)〇
[0014] 圖2為Mnl6.8-c I啟動子在轉(zhuǎn)基因煙草中的PCR鑒定(M:Maker，WT:野生型煙草，T: 轉(zhuǎn)基因煙草）。
[0015] 圖3為野生型與轉(zhuǎn)基因煙草表型。
[0016]圖4為野生型和轉(zhuǎn)基因煙草在25°C和37°C下的⑶S表達活性分析(WT:野生型煙草， T:轉(zhuǎn)基因煙草）。
[0017] 圖5為轉(zhuǎn)基因煙草高溫脅迫下的GUS表達活性分析(WT:野生型煙草，T:轉(zhuǎn)基因煙 草)。
【具體實施方式】
[0018] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0019]實施例！、桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-C I啟動子獲得 [0020] 從桑樹基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定了 29個sHSPs，對29個sHSPs進行基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控 元件和組織表達譜分析后發(fā)現(xiàn)，Μη 16.8-C I基因啟動子中含有完整的熱激元件(HSE)，在高 溫、低溫、干旱和高鹽脅迫下，基因表達上調(diào)。為研究Mnl6.8-C I啟動子的活性，取Mnl6.8-C I基因上游1500bp啟動子序列設(shè)計引物，克隆并測序驗證。利用植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將其插入 植物表達載體PBI121中，具體方法如下：
[0021] 根據(jù)川?；蚪M序列，截取Mnl6.8-C I基因上游1500bp序列設(shè)計引物作為克隆 Mnl6.8-C I啟動子(Mnl6.8-C I pro)的引物，具體引物如下：
[0022] Mnl6.8-C I pro 上游引物：5 ' -cccaagcttGGTCCGGCCGTGGTGCGT-3 '（ SEQ ID NO. 1)，下劃線表示Hindm酶切位點；
[0023] Mnl6.8-C I pro下游引物：5'-cgggatccTTCTATGATTATTAGCCTTGCTGTG_3'（SEQ ID NO.2)，下劃線表示Bam Η I酶切位點；
[0024] 然后以川?；蚪MDNA為模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示序列為引物進行 PCR擴增，PCR擴增體系為：10XEx-taq buffer 2.5yL，25mM MgCl2 2yL，2.5mM dNTP 2yL， 川桑基因組DNA 30ng，10μΜ上、下游引物各lyL，5U/yl Ex-taq聚合酶0.2yL，滅菌水補足至 25yL; PCR擴增條件為94°C預(yù)變性4分鐘；94 °C變性40秒，60 °C退火40秒，72 °C延伸2分鐘，進 行30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘，4°C保存。擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1中b 所示。結(jié)果顯示，擴增獲得約1500bp的條帶，即Mnl6.8-C I pro,經(jīng)測序獲得Mnl6.8-C I pro序列如SEQ ID NO.3所示。
[0025] 然后將擴增獲得的Mnl6.8-C I pro經(jīng)Hindm和Bam Η I酶切后連入同樣經(jīng)Hind ΙΠ 和Bam Η I酶切的植物表達載體pBI121中，獲得含有Mnl6.8-C I pro的重組表達載體，命 名為pBI121-PMnl6.8-C I，載體結(jié)構(gòu)如圖1中a所示。
[0026] 實施例2、Mnl6.8_C I啟動子轉(zhuǎn)基因煙草的獲得與鑒定
[0027] 利用葉盤轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的pB1121 -Μη 16.8-C I表達載體轉(zhuǎn)化煙草，經(jīng)過kan抗性篩 選，共獲得5株轉(zhuǎn)基因煙草植株，分別命名為T1~5。取5株轉(zhuǎn)基因煙草的葉片，提取基因組 DNA作為模板，同時以野生型煙草基因組作為對照，用Mnl6.8-C I啟動子上游引物和⑶S基 因特異性引物進行PCR擴增，其中GUS基因特異性引物的序列如下：
[0028] 5'_cgaggtacggtaggagttgg_3'（SEQ ID N0.4);
[0029] PCR擴增條件為94 °C預(yù)變性4分鐘;94 °C變性40秒，60 °C退火40秒，72 °C延伸2分鐘， 進行30個循環(huán);最后72°C延伸10分鐘，4°C保存;擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2 所示。結(jié)果顯示，野生型煙草無擴增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)基因煙草擴增產(chǎn)物均與預(yù)期大小一致，表明 Mnl6.8-C I啟動子均插入到轉(zhuǎn)基因煙草基因組中。
[0030] 隨機選擇T1、T3和T5為功能研究對象，然后同時將野生型和轉(zhuǎn)基因煙草移栽至土 中，4周后觀察表型，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草表型無明顯差異。
[0031] 如圖3所示，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草移栽至土中4周后，表型無明顯差異。然后分析3 株轉(zhuǎn)基因煙草TUT3和Τ5啟動子的表達活性，具體如下:取在正常生長條件25°C下和37°C處 理后的WT、T1、T3和T5的離體葉圓片，進行⑶S組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示，37 °(：處理后，WT仍無藍斑，而ΤΙ、T3和T5明顯觀察到藍斑，表明Mnl6.8-C I啟動子能驅(qū)動下游 GUS基因表達。
[0032]取 T1、T3 和 T5 的離體葉圓片，分別在 35°(：、36°(：、37°(：、38°(：、39°(：下處理211后，61]3 組織化學(xué)染色，觀察表達活性，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，WT無藍斑(無⑶S基因的表達），而 轉(zhuǎn)基因煙草Τ1、Τ3和Τ5明顯觀察到藍斑，而且GUS表達活性隨溫度的增加而升高，表明 Mnl6.8-C I啟動子能在高溫處理下誘導(dǎo)下游GUS基因表達，并且在溫度高于38°C條件下表 達活性更強。
[0033]最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-CI啟動子，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。2. 含有權(quán)利要求1所述桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-CI啟動子的重組表達載體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達載體，其特征在于：所述重組表達載體由如SEQ ID NO. 3所示的序列連入植物表達載體pB 1121的Hind ΙΠ 和BamHI酶切位點而得。4. 權(quán)利要求1所述桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-CI啟動子在高溫脅迫下誘導(dǎo)基因 表達中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于:所述高溫為溫度高于35 °C。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于:所述高溫為溫度為35~39 °C。7. 權(quán)利要求1所述桑樹小分子熱激蛋白基因 Mnl6.8-CI啟動子在調(diào)控植物抗逆性或調(diào) 控抗病能力中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/113GK105838716SQ201610283570
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】何寧佳, 盧承瓊, 曾其偉
【申請人】西南大學(xué)