專利名稱：白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及文昌魚熱休克蛋白，特別涉及白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
文昌魚(Amphioxus)隸屬脊索動物門(Chordate)頭索動物亞門 (Cephalochordate)，它處于無脊椎動物進化到脊椎動物一個重要的過渡階段，是現(xiàn)存生物中最類似于脊椎動物亞門直接祖先的類群之一。因其獨特的進化地位，且結(jié)構(gòu)簡單，身體半透明，基因組僅為人類的1/6，呈現(xiàn)出基因倍增前脊椎動物祖先的基因組的特征(1、 Balczarek, K. A.，Lai, Z. C.，Kumar，S.，Evolution of functional diversification of the pair box (Pax)DNA-binding domains. Molecular. Biology and Evolution[J]. 1997. (14)，擬9-842.)。隨著對文昌魚的研究日益深入，佛羅里達文昌魚(Brmchiostoma flloridae)全基因組測序完成，尤其是文昌魚實驗室連續(xù)繁殖的成功(2、Zhmg，Q. J.， Sun，Y.，Zhong，J.，Li，G.，Lii, Χ. Μ.，Wang, Y. Q，Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generation in laboratory. Journal of Experimental Zoology(Molecular and Developmental Evolution)[J]. 2007，308(4)， 464-47 ，極大地推動了文昌魚的模式化進程。在其他模式生物中成功應(yīng)用的生物技術(shù)，如 RNA干擾技術(shù)，顯微注射和細胞培養(yǎng)技術(shù)等同樣在文昌魚中逐步建立。作為一種新型的模式生物，研究其調(diào)控目的基因表達的分子工具是必不可少的，到目前為止，文昌魚中只有 ^οχ D基因啟動子(3、Yu，J· K. ,Holland,N. D.，Holland，L Ζ. ,Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.Development Biology. 2004. (274)， 452-461)，Vent, Goosecoid and Chord 基因啟動子(4、Kozmikova, I.，Smolikova, J.， Vlcek, C. , Kozmik,Ζ. ,. Conservation and diversification of an ancestral chordate gene regulation network for dorsoventral patterning. Public Library of Scicence One. 2011.6(2))被報道。在現(xiàn)有的幾種模式生物中，已建立了一些調(diào)控基因表達系統(tǒng)，如四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)(5、 Gossen, M. ， and Bujard， H. ， Anhydrotetracycline, a novel effector for the tetracycline controlled gene expression systems in eukaryotic cells. Nucleic Acids Research,1993. 21，4411—4412)，Gal/UAS 系統(tǒng)(6、Lewandoski, Μ.，Conditional control of gene expression in the mouse. Nature Reviews Genetics. 2001. 2(10), 743-755)，或是開發(fā)一些組織特異性的啟動子或是增強子，如vasa基因啟動子能使下游目 ^ ^^ ^ ^^ O、Tanaka, M. ，Kinoshita, M. ，Kobayashi, D. ，Nagahama, Y.， Establishment of medaka(Oryzias latipes)transgenic lines with the expression of green fluorescent protein fluorescence exclusively in germ cells :a useful model to monitor germ cells in a live vertebrate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2001. 98 (5)，2544-2549)，腎細胞特異的鈣粘著蛋白基因的啟動子能引導(dǎo)報告基因在腎臟和生殖泌尿道中特異表達(8、Shao, X.L.，Johson, J. E.，Richardson, J. Α. , Hiesberger, Τ. , Igarashi, P. , Aminimal Ksp-Cadhe—rin promoter linked to a green fluorescent protein reporter gene exhibits tissue-specific expression in the developing kidney and genitourinary tract.Journal of American. Sociology. 2002. 13,1824-1836)。然而以上所提到兩種方法存在不可克服的弊端，一是需要開發(fā)數(shù)目眾多的組織特異性的啟動子或是增強子，同時不易調(diào)控靶基因的表達(9、 Rome, C. , Couillaud, F. , Moonen,C. Τ. W. ,Spatial and temporal control of expression of therapeutic genes using heat shock protein promoters. Methods[J]. 2005.35, 188-198)，二是化學(xué)藥物誘導(dǎo)，對機體有害或有潛在的副作用(10、Oda, S.，Mikami, S.， Urushihara,Y. ,Murata,Y. ,Kamei,Y. ,Deguchi,Τ. ,Kitano,Τ. ,Fujimori,K. Ε. ,, Yuba,S., Todo,Τ. ,Mitani,H. ,Identification of a functional medaka heat shock promoter and characterization of its ability to induce exogenous gene expression in medaka in vitro and in vivo. Zoological Science. 2010. 27 (5)，410-415)。因而，在新型模式生物文昌魚中需要建立更好的表達調(diào)控系統(tǒng)。 近年來，熱休克蛋白基因啟動子被廣泛用于調(diào)控外源基因表達(ll、aioji，W. ,and Sato-Madda,M. ,2008. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development Growth & Differentiation. 50，401-406)。在醫(yī)療中，人的 Hsp70B 啟動子被用于腫瘤細胞的靶向治療。正常條件下，下游基因在熱休克蛋白基因控制下不表達或表達量很低，應(yīng)激后表達急劇上調(diào)。該啟動子不僅受熱誘導(dǎo)，還受所處環(huán)境的重金屬鹽，氨基酸類似物，滲透壓等刺激。熱休克蛋白基因啟動子在在果蠅，斑馬魚，小鼠等都得到了很好的研究和應(yīng)用，但不清楚這些報道的熱休克蛋白基因啟動子是否也能在文昌魚中很好的發(fā)揮作用。除此之外，自身啟動子應(yīng)該比其他物種來源的要更合適文昌魚的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子。本發(fā)明的第二目的在于提供白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子在調(diào)控白氏文昌魚基因表達中的應(yīng)用。所述白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子的核苷酸序列為caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60
cggtattaacgttatatcaaggactgtgttacctaggcttgagatactgtgttttagatt120
atttagctagacatgtcctcgattacatgtatatatagctgaagcaggctctttccagat180
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tcacaggaataattcttggtacgatttcaggacaacagacgcagacgtctgcacgtgttt300
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ttcggaaaaa ttgtagatct tgggagaagg ttcttccgag tggtttataa gcgccgcaga 720agcgaactct ggtcattcag tttccagaga agcgaagcaa agttatccag agtgagaacg 780tagagcgatt g791。所述白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子可有效調(diào)控下游基因表達。其受熱誘導(dǎo)的特性對研究某些對生物機體產(chǎn)生毒性的基因非常重要，可避免毒性基因持續(xù)表達導(dǎo)致的對生物體造成的有害影響。也可以白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子對感興趣的基因功能展開不同時間上，不同空間上(即不同組織器官)的研究。將該啟動子介導(dǎo)的目的基因整合到文昌魚基因組中，建立轉(zhuǎn)基因文昌魚，即可對文昌魚的不同發(fā)育時期或是不同部位的目的基因進行研究。由此可見，白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子可用于調(diào)控白氏文昌魚基因的表達。白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子熱誘導(dǎo)效果明顯，基礎(chǔ)性表達活力低。且因生物機體都有一定程度的耐熱能力，不會對對機體造成損傷，熱處理操作簡單，使得白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子的應(yīng)用廣泛。本發(fā)明成功克隆了文昌魚熱休克蛋白70基因的上游791bp序列，并將該片段載入帶有綠色熒光蛋白(GFP)的報告載體，在斑馬魚胚胎及鯉魚上皮瘤細胞系(EPC細胞系)進行功能檢驗，已證明該片段確實是熱誘導(dǎo)的啟動子，可作為調(diào)控文昌魚基因時空表達的分子開關(guān)。


圖1為轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的鯉魚上皮瘤細胞在不同溫度刺激后的GFP表達情況電鏡圖。在圖1中，上方為白光下的電鏡圖，下方為熒光下的電鏡圖，溫度分別為25°C，31°C， 34°C，37°C。
具體實施例方式實施例1白氏文昌魚熱休克蛋白70(Hsp70)基因啟動子序列獲取1、分離含有Hsp70的BAC克隆通過人(GenebankID :NM_005345),小鼠(Genebank ID :ΝΜ_010479)，斑馬魚(Genebank ID :NM_131397)，及佛羅里達文昌魚 Hsp70 (JGI protein ID :277443)序列比對后，在保守位點設(shè)計一對特異引物，Hsp70-F CGGCTTACTTCAACGACT，Hsp70_R GACGACAGCGTCCTCTT。該引物首先在白氏文昌魚基因組水平上進行PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)) 擴增，能有效擴增到391b的序列，經(jīng)測序驗證為目的基因片段。因此采用這對引物到白氏文昌魚基因組 BAC 文庫(Wang，W. ,Xu,H. L.，Lin，L. P. ,Su B. ,Wang, Y. Q. ,Construction of a BAC library for Chinese amphioxus Branchiostoma belcheri and identification of clone containing Amphi-Pax genes. Genes & Genetic Systems.2005. 80(3), 233-236.)篩選包含有Hsp70的BAC克隆，共篩選了 94塊384孔板，其中在69，77號板上篩選到陽性克隆。選取69號板進一步篩選，21B位置的克隆為陽性克隆。2、Hsp 70上游區(qū)域序列分析將篩選到的含有Hsp 70的BAC克隆69-21B (所在文庫的編號)質(zhì)粒進行測序(由深圳華大基因完成)。序列注釋采用Genscan Qittp://genes, mit. edu/GENSCAN. html)和 Genwise (http://www. ebi. ac. uk/Tools/ffise2/index. html)在線軟件。截取 Hsp70 基因
5起始密碼子ATG上游1200bp序列進行在線軟件(http://www. fruitfly. org/seq_tools/ promoter, html)預(yù)測潛在的啟動子及其轉(zhuǎn)錄元件搜尋(http://www. cbil. upenn. edu/ cgi-bin/tess/tess)。預(yù)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)起始密碼上游的非編碼區(qū)預(yù)測出一個核心啟動子，最重要的是，該區(qū)域包含了三個熱休克元件(heat shock element HSE)，針對這些重要的調(diào)控元件所在的區(qū)域設(shè)計一對特異引物，引物序列為Hsp70-pro-F -.CTCGAG CAATGGCTAACACGACATCAC,下劃線斜體部分為 Β ο I 酶切位點；Hsp70-pro-R GAATTC CAATCGCTCTACGTTCTCACT,下劃線斜體部分為 EcoR I 酶切位點，對潛在的啟動子區(qū)域(791bp)進行PCR擴增，獲得白氏文昌魚熱休克蛋白70基因
啟動子。所得白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子的核苷酸序列為caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60
cggtattaacgttatatcaaggactgtgttacctaggcttgagatactgtgttttagatt120
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tagagcgattg791。實施例2白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子1、構(gòu)建重組表達質(zhì)粒將擴增啟動子區(qū)域的PCR經(jīng)Xho IjEcoR I雙酶切處理，載入經(jīng)過同樣雙酶切處理的pAcGFPl-l(該載體無啟動子，Clontech)載體中，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，經(jīng)PCR及酶切鑒定后得到陽性克隆進行測序，證明插入片段無誤，然而進行功能驗證。2、顯微注射斑馬魚胚胎因文昌魚胚胎顯微注射技術(shù)暫時還不夠穩(wěn)定，申請人將所構(gòu)建好的重組質(zhì)粒注射到斑馬魚胚胎中進行驗證。注射的斑馬魚胚胎處于單細胞時期，從胚胎的動物級注入，每個胚胎注射量約為1 2nl，注射的重組質(zhì)粒濃度約為lOOng/μ 1，顯微操作儀為Narishige IM-30型。200枚胚胎用于注射組，分為2組，一組用于熱激，一組不熱激，作為對照，每組 100枚。24h后，由于機械損傷，熱激的胚胎剩下95枚存活，對照的胚胎剩下94枚。將熱機組的胚胎置于預(yù)熱好的37°C水浴中，處理0.證，對照組不處理，一直處于培養(yǎng)箱中。熱激4h后，檢測各胚胎熒光表達情況。最后熱激組一共觀察到39條魚出現(xiàn)熒光，對照組出現(xiàn) 12條，即熱激組有41. (39/95)的胚胎檢測到報告基因的表達，沒有經(jīng)過熱激處理的有12.8% (12/94)的胚胎檢測到GFP的表達。經(jīng)過熱誘導(dǎo)的胚胎，檢測到發(fā)熒光的胚胎比率明顯上調(diào)，證實了克隆的序列為誘導(dǎo)型的啟動子。2. 3轉(zhuǎn)染細胞鯉魚上皮瘤細胞EPC培養(yǎng)于含5%胎牛血清的L15培養(yǎng)基(Gibco)中，25°C生化培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，細胞更換無血清的新鮮培養(yǎng)基中，本實驗采取脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。分別將Iyg 質(zhì)粒DNA及5 μ L的脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 (Invitrogen)稀釋到250 μ L的無血清培養(yǎng)基中，各自混勻靜止5min后，再將兩種溶液混合均勻，室溫靜置20min。待DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物形成后，緩慢均與加入到各細胞培養(yǎng)皿中。輕輕來回晃動，然后置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。他后，跟換新鮮含有5%胎牛血清的培養(yǎng)基。為考察不同溫度，31°C，34°C，37°C對對啟動子Pl的誘導(dǎo)效果，細胞更換培養(yǎng)基4h 后，開始熱激處理，將細胞培養(yǎng)皿置于31°C，34°C，37°C溫度的水浴鍋中，各處理0. 5h，然后放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，陰性對照組轉(zhuǎn)染無啟動子的pAcGFPl-Ι質(zhì)粒，持續(xù)25°C培養(yǎng)。24h后觀在倒置熒光顯微鏡(Nikon TE-2000S)觀察熒光表達情況，轉(zhuǎn)染含啟動子的重組質(zhì)粒在不同溫度刺激后，報告基因得到了不同程度的表達，對照組沒有觀察到GFP，正常溫度(25°C ) 培養(yǎng)的EPC細胞中也觀察不到GFP的表達，31°C處理的細胞開始有較弱的報告基因的表達， MO熱激的EPC細胞可以觀察到較強的GFP表達，37°C表達最強烈(參見圖1)。再將細胞消化下來，懸浮于冰冷的PBS中，采用流式細胞儀EPICS XL (Beckman Coulter)檢測GFP的表達量。通過流式細胞儀檢測GFP的表達情況，結(jié)果見表1。37°C刺激后表達GFP的細胞約為10. 90%，相比較25°C培養(yǎng)細胞(2. 20% )，GFP表達上調(diào)約5倍，同時看出溫度對啟動子有十分顯著的熱誘導(dǎo)效果(AN0VA，P < 0. 01)。表1不同溫度刺激后流式細胞儀檢測GFP陽性細胞的表達
刺激溫度(°c ) GFP陽性細胞比例(％ )
25 (對照)2.20±0.26
313.76±0.23344.55±0.213710.88±0.39 數(shù)據(jù)充分說明這段791bp的序列具有啟動子的功能，并且是熱誘導(dǎo)的啟動子?？衫闷渑c其它基因建立轉(zhuǎn)基因文昌魚，開展發(fā)育過程中的過表達研究，探討其功能及其發(fā)揮作用的時期，為研究文昌魚基因功能提供一個有力的工具。
權(quán)利要求
1.白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子，其特征在于其核苷酸序列為caatggctaacacgacatcacattatttcattattagatgctgttatcatagtattcata60cggtattaacgttatatcaaggactgtgttacctaggcttgagatactgtgttttagatt120atttagctagacatgtcctcgattacatgtatatatagctgaagcaggctctttccagat180tgacacacatagtattatagactaattacaacgcaatattcatatcatgtgcatatgata240tcacaggaataattcttggtacgatttcaggacaacagacgcagacgtctgcacgtgttt300gaaaacacccccctccccctctggactttttacacgctcataatgctacatatgaatggc360tagatactatcacataacgcccaatcgtgcacatgatatt3.3.3.3.3. C 3. 3.aagaaccttt420gtcgccggagaagggacatcttgaaatcggaggacactggagactttctacatctttcca480gaagaaactttccgccatcttgaatgtttacattctcccatggaccagcccattttgcgg540caggtatttacgacacgacgtgacgtcctactgcacgggcggttccagaaagctctggaa600ggtgcgcgcaagttctcgtgttatcctggatgttgtagaagcctagattgttcctgaatg660ttcggaaaaattgtagatcttgggagaaggttcttccgagtggtttataagcgccgcaga720agcgaactctggtcattcagtttccagagaagcgaagcaaagttatccagagtgagaacg780tagagcgattg791。
2.如權(quán)利要求1所述的白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子在調(diào)控白氏文昌魚基因表達中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述基因是下游基因。
全文摘要
白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其應(yīng)用。涉及文昌魚熱休克蛋白，提供白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子及其在調(diào)控白氏文昌魚基因表達中的應(yīng)用。所述白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子可有效調(diào)控下游基因表達。其受熱誘導(dǎo)的特性對研究某些對生物機體產(chǎn)生毒性的基因非常重要，可避免毒性基因持續(xù)表達導(dǎo)致的對生物體造成的有害影響。也可以白氏文昌魚熱休克蛋白70基因啟動子對感興趣的基因功能展開不同時間上，不同空間上的研究。將該啟動子介導(dǎo)的目的基因整合到文昌魚基因組中，建立轉(zhuǎn)基因文昌魚，即可對文昌魚的不同發(fā)育時期或是不同部位的目的基因進行研究。
文檔編號C12N15/113GK102199604SQ20111006886
公開日2011年9月28日 申請日期2011年3月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者李光, 李定亮, 王義權(quán) 申請人:廈門大學(xué)