一種水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子safes2及其分離方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2及其分離方法與應(yīng)用。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻中一段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的DNA序列,命名為啟動(dòng)子SAFES2或SAFES2。該啟動(dòng)子的核苷酸序列為序列表中SEQ ID No.1中所示序列或?yàn)樵撔蛄械耐囱苌铩1景l(fā)明利用作物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1391,將啟動(dòng)子SAFES2構(gòu)建于GUS報(bào)告基因上游,構(gòu)建重組表達(dá)載體,通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織再生水稻植株,GUS染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)該啟動(dòng)子是胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子。采用本發(fā)明的啟動(dòng)子與具有提高植株生長(zhǎng)特性的基因配合使用,可以在提高植株根、莖、葉等軀干部位性狀的同時(shí),避免對(duì)植株胚乳部分帶來任何不良影響,具有顯著的應(yīng)用價(jià)值和遠(yuǎn)期前景。
【專利說明】
一種水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2及其分離方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和作物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言,本發(fā)明涉及一種水稻 胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在植物轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中,被導(dǎo)入的外源基因需要借助植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯和修飾體 系,產(chǎn)生有活性的目標(biāo)蛋白,使目的基因發(fā)揮作用,實(shí)現(xiàn)作物的遺傳改良。精確控制目的基 因產(chǎn)物生成的時(shí)間、位置或數(shù)量,對(duì)提高目標(biāo)基因表達(dá)的針對(duì)性和時(shí)效性非常重要,也是提 高轉(zhuǎn)基因植物風(fēng)險(xiǎn)防控能力的重要方面。在植物基因工程中,通過啟動(dòng)子直接控制目標(biāo)基 因的轉(zhuǎn)錄,是調(diào)控目的基因表達(dá)最為經(jīng)濟(jì)有效的手段,也是控制表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)的可行路徑。因 此,充分了解不同類型植物啟動(dòng)子的功能和特點(diǎn),對(duì)構(gòu)建合適的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)是非常重 要的。
[0003]組織特異型啟動(dòng)子又稱為器官特異型啟動(dòng)子,僅在特定的組織器官或細(xì)胞類型中 具有驅(qū)動(dòng)能力。在基因工程中限定了目的基因的作用范圍,避免了組成型啟動(dòng)子在非必要 組織中泛式表達(dá)造成的物質(zhì)能量浪費(fèi),特別適于有組織針對(duì)性的遺傳改良和生物反應(yīng)器的 應(yīng)用。已發(fā)現(xiàn)的組織特異型啟動(dòng)子主要包括:種子特異型啟動(dòng)子、果實(shí)特異型啟動(dòng)子、葉肉 細(xì)胞特異型啟動(dòng)子、根特異型啟動(dòng)子。已經(jīng)應(yīng)用于水稻分子育種的一些組織特異型啟動(dòng)子 包括:花藥特異啟動(dòng)子BnBp 10 (Cheng等,1998 ),花藥特異型啟動(dòng)子Po I (Peng等,2010 ),綠色 組織特異啟動(dòng)子0srbcS(Ye等,2009),葉片特異啟動(dòng)子ZmPepc(Datta等,1998),胚乳特異啟 動(dòng)子Gtl(Beyer等,2002),GluB4(He等,2011 ),根特異啟動(dòng)子OsAntl(Shrawat等,2008), OsRCcs (Jeong 等,2010)等等。
[0004] 但是,胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子的發(fā)明還鮮有報(bào)道。水稻的胚乳即可食用的精米部位,胚 乳不表達(dá)啟動(dòng)子使外源基因只在非食用部分表達(dá),保證食用部分不含有外源基因表達(dá)的產(chǎn) 物,降低其對(duì)人類健康帶來的潛在風(fēng)險(xiǎn),是促進(jìn)轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化進(jìn)程的一條有效途徑。 目前需要大力開展功能基因組的研究,大量挖掘和分離具有實(shí)用價(jià)值的胚乳不表達(dá)啟動(dòng) 子,消除公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的偏見和顧慮,并利用胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子的特性,充分發(fā)揮轉(zhuǎn)基 因育種的優(yōu)勢(shì),培育出更多更好的新品種。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是分離克隆一種水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2,利用該啟動(dòng) 子一方面驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在水稻植株中表達(dá),改善其生產(chǎn)性能;另一方面在胚乳中不表達(dá)目 標(biāo)基因,以此降低轉(zhuǎn)基因稻米的食用安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0006] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供啟動(dòng)子SAFES2在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。所涉及的 "作物"是指禾谷類作物,例如水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等,優(yōu)選為水稻。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的,一方面,本申請(qǐng)的發(fā)明人從日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中分離克隆得到一段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的DNA序列,命名為SAFES2或啟動(dòng) 子SAFES2。啟動(dòng)子SAFES2包含下述序列之一或者下述序列的互補(bǔ)序列之一:
[0008] (a)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列;
[0009] (b)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲 得的核苷酸序列;
[0010] (c)與序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序 列;
[0011] (d)在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲 得的核苷酸序列;
[0012] (e)序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲得的 核苷酸序列。
[0013] 優(yōu)選地,所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2由序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序 列構(gòu)成。
[0014] 需要說明的是:序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA序列,序列5'端的22bp,BP "gcggtaatag aaatgtggag gg"其為獲得啟動(dòng)子過程中使用的正向引物的留存序列;序列3' 端的22bp,即"cactttaaac acataattaa cc",其為獲得啟動(dòng)子過程中使用的反向引物的留 存序列(該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ))。需要強(qiáng)調(diào)的是,本文中所提到的啟動(dòng)子 既可以指上述整個(gè)DNA序列,也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。即便本領(lǐng)域技 術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上,采用其他引物獲得了類似序列,其也落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0015] 另一方面,本發(fā)明還提供一種包含上述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2的表達(dá)盒。
[0016] 又一方面,本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體,所述重組表達(dá)載體包含上述的水稻 胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2。在所述重組表達(dá)載體中,所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2連 接于待表達(dá)的基因序列的上游,待表達(dá)基因可以為任何對(duì)水稻的生長(zhǎng)特性具有改善能力的 基因,通過本發(fā)明的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)該基因在胚乳以外的組織特異性地集中表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)改 善水稻生長(zhǎng)性能而不影響胚乳生長(zhǎng)性能的功能;優(yōu)選地,所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因。
[0017] 另一方面,本發(fā)明還提供一種利用所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2獲得相應(yīng) 宿主菌的方法,所述方法包括將所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2、所述的表達(dá)盒或者 所述的重組表達(dá)載體,利用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌。
[0018] 另一方面,本發(fā)明提供一種利用所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2獲得相應(yīng)轉(zhuǎn) 化子的方法,所述方法包括將上面所獲得的宿主菌通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法對(duì)目標(biāo)細(xì)胞、愈傷 組織或植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化,獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)化子。其中,所述轉(zhuǎn)化子優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、愈傷組織 或植株。
[0019] 再一方面,本發(fā)明提供上述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2在培育轉(zhuǎn)基因作物中的 應(yīng)用。所述應(yīng)用包括:
[0020] A)、將所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2連接于目的基因的上游;
[0021 ] B)、將含有所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2與目的基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到 根癌農(nóng)桿菌中;
[0022] C)、利用轉(zhuǎn)入了所述重組表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌對(duì)目標(biāo)植物愈傷組織進(jìn)行農(nóng)桿菌 轉(zhuǎn)化;
[0023] D)、利用轉(zhuǎn)化后的愈傷組織培育相應(yīng)植株,在所述植株中,所述的水稻胚乳不表達(dá) 啟動(dòng)子SAFES2能夠驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá),而在胚乳中不驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)。
[0024]此外,本發(fā)明提供一種所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2的分離方法,其特征在 于,所述方法包括:
[0025] 步驟(1)、根據(jù)所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物;
[0026] 步驟(2)、以水稻品種日本晴的DNA為模板,利用所述引物通過PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增所 述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2;
[0027]步驟(3)、回收PCR擴(kuò)增的目的片段,并將其連接到PGEM-T-Easy載體上;
[0028]步驟(4)、利用連接產(chǎn)物按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue感受態(tài)細(xì)胞;
[0029]步驟(5)、對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行PCR篩選,獲得陽(yáng)性克隆,挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒,用 相應(yīng)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證;
[0030]步驟(6)、將經(jīng)過鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲取測(cè)序正確的核苷酸序列,作為目 標(biāo)序列。
[0031]綜上所述,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻(Oryza sativa L cv.Nipponbare)中一段具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的DNA序列,并將其命名為SAFES2(序列表中的 SEQ ID N〇:l)。具體而言,發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該序列具有驅(qū)動(dòng)基因在水稻植株中表達(dá)而不在胚乳 中表達(dá)的能力,提取出該序列并對(duì)上述能力進(jìn)行了鑒定。發(fā)明人將該序列經(jīng)酶切后連接到 作物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1391上,獲得相應(yīng)的重組質(zhì)粒(即重組表達(dá)載體),利用該重組質(zhì) 粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105,然后用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化,得到轉(zhuǎn)基因水 稻植株。對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),GUS基因在根、莖、葉、葉鞘、胚及種皮 中具有較強(qiáng)活性,但在胚乳細(xì)胞中不表達(dá)。從而證明該序列具有驅(qū)動(dòng)基因特異的在水稻植 株中表達(dá)而不在胚乳表達(dá)的活性。
[0032]技術(shù)效果
[0033]本發(fā)明所述的啟動(dòng)子SAFES2可與作物雙元表達(dá)載體連接,用于取代組成型啟動(dòng) 子。并且,該啟動(dòng)子可以與所需的目標(biāo)基因連接,構(gòu)建重組表達(dá)載體,經(jīng)轉(zhuǎn)化后,可在水稻植 株中表達(dá)而不在胚乳表達(dá),即改善了水稻的生產(chǎn)性能,也保證了稻米的食用安全性,具有重 要的理論及實(shí)際意義。
【附圖說明】
[0034]以下,結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案,其中:
[0035] 圖1為將SAFES2啟動(dòng)子構(gòu)建于pCAMBIA1391載體質(zhì)粒中的示意圖,其中圖1中A為 PCAMBIA1391示意圖,B為pCAMBIA1391-SAFES2示意圖,其中示出了利用SAFES2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 位于其下游的⑶S基因表達(dá);
[0036] 圖2為對(duì)本發(fā)明的啟動(dòng)子進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果示意圖。
[0037] 圖3為根(a)、莖(b)、葉鞘(c)、葉(d)、種子(e)中⑶S染色結(jié)果。藍(lán)色為⑶S組織化學(xué) 染色,代表組織中有⑶S表達(dá)。標(biāo)尺=2.5_
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解,這些實(shí)施例僅 用于說明本發(fā)明,其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0039] 下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的生 化試劑,載體耗材等,如無特殊說明,均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。
[0040] 實(shí)施例1分離克隆啟動(dòng)子SAFES2 [0041]步驟1、引物的設(shè)計(jì)
[0042] 根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴(Oryza sativa L cv.Nipponbare)全基因組 序列,依據(jù)水稻SAFES2基因的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物,并根據(jù)選用的載體及靶標(biāo)基因的特點(diǎn),設(shè) 計(jì)引物的酶切位點(diǎn)。
[0043] 本實(shí)施例中以水稻雙元表達(dá)載體pCAMBIA1391 (圖1中A部分,來自于CAMBIA,公開 使用載體,安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心水稻組保存) 為例,靶標(biāo)基因?yàn)镚us基因,具體設(shè)計(jì)的引物為:正向引物(SEQ ID No: 2)5 '端帶HindIII,酶 切位點(diǎn)(AAGCTT),反向引物(SEQ ID No : 3)5 '端帶EcoRI,酶切位點(diǎn)(GAATTC),引物序列如 下:
[0044] 正向引物:AAGCTTGCGGTAATAGAAATGTGGAGGG HindIII
[0045] 反向引物:GAATTCGGTTAATTATGTGITTAAAGTG EcoRI
[0046] 由深圳華大基因公司合成。
[0047]步驟2、啟動(dòng)子SAFES2的分離克隆
[0048]以水稻品種日本晴DNA為模板,利用正向引物、反向引物擴(kuò)增啟動(dòng)子SAFES2,按常 規(guī)PCR體系,采用如下擴(kuò)增程序:
[0049] 95 °C 預(yù)變性 5min; 95 °C 變性 30s,58 °C 退火 30s,72 °C 延伸 2min30s,35 個(gè)循環(huán);最后 72°C 延伸 lOmin。
[0050] 回收PCR擴(kuò)增的目的片段,將其連接到PGEM-T-Easy載體(購(gòu)自Promega公司,按載 體說明書中的比例混合)上,按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue感受態(tài)細(xì)胞后,經(jīng)菌落PCR篩 選獲得陽(yáng)性克隆,挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒,用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,目的片段 長(zhǎng)度2018bp,如圖2所示。將經(jīng)過鑒定的陽(yáng)性克隆送交Invitrogen公司測(cè)序。驗(yàn)證正確的克 隆即為所要獲得的啟動(dòng)子SAFES2,其核酸序列如SEQ ID No: 1所示。
[0051 ]實(shí)施例2啟動(dòng)子SAFES2的功能驗(yàn)證及應(yīng)用 [0052] 1.遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
[0053] 所用載體為作物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1391,用HindIII和EcoRI進(jìn)行雙酶切,回收 線性化處理的PCAMBIA1391。同時(shí)用HindIII和EcoRI對(duì)克隆得到的啟動(dòng)子SAFES2進(jìn)行酶切, 回收目的片段。將上述的PCAMBIA1391片段和SAFES2片段用T4DNA連接酶(購(gòu)于TaKaRa公司) 進(jìn)行連接,得到啟動(dòng)子SAFES2與Gus基因融合的重組表達(dá)載體pCAMBIA1391-SAFES2(圖1B), 利用凍融法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽 省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物產(chǎn)品成分監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心水稻組保存)。
[0054] 2啟動(dòng)子SAFES2的功能驗(yàn)證及應(yīng)用
[0055]步驟1:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化
[0056] 成熟水稻種子去掉穎殼后,用70%酒精浸泡種子lmin,倒掉酒精。用含有I-Tween 20的50%次氯酸鈉(原液有效氯濃度大于4% )溶液浸泡種子40min(150r/min)。倒掉次氯酸 鈉,無菌水洗5遍至溶液澄清,無次氯酸鈉味道。無菌水浸泡種子過夜。用解剖刀沿種子的糊 粉層將胚剝下,將胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。30°C下暗培養(yǎng)11天后將愈傷與胚乳及胚芽 分離,將去芽的狀態(tài)良好、分裂旺盛的初級(jí)愈傷組織進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)3~5天后用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。 [0057]采用上述"作物表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化"過程中轉(zhuǎn)入了重組表達(dá)載體的 根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,該遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生等參 照Yongbo Duan(Yongbo Duan,Chenguang Zhai,et al. An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.) [J].Plant Cell Report,2012.D0I 10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。獲得轉(zhuǎn) 基因再生植株。
[0058] 步驟2、⑶S組織化學(xué)染色
[0059] 參照 Jefferson(Jefferson RA 等人.GUS fusion:0-Glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plant[J].EMBO J.,1987,6: 3901-3907)等提出的方法,將從上面獲得的轉(zhuǎn)基因再生植株中分離的需要染色的組織浸入 染色液中,37°C保溫箱中放置24-36小時(shí),加入無水乙醇浸泡直至完全脫色,在顯微鏡下拍 照記錄。結(jié)果見圖3(需要說明的是,鑒于專利文本中不接受彩色圖片,因此,本申請(qǐng)的發(fā)明 人將彩色的圖3修改為灰度圖像,但是,即便這樣,基于圖3中的顏色深淺度,也可以清晰地 分辨出各部位是否發(fā)生染色),圖中示出了根(a)、莖(b)、葉鞘(c)、葉(d)、種子(e)中GUS染 色結(jié)果,藍(lán)色為GUS組織化學(xué)染色,代表組織中有GUS表達(dá)。染色結(jié)果表明SAFES2啟動(dòng)子在 根、莖、葉、葉鞘、胚及種皮中具有較強(qiáng)活性,能夠引導(dǎo)Gus基因表達(dá),但在胚乳細(xì)胞中不表 達(dá)。
[0060] 因此,基于該染色結(jié)果可以明確判斷,本發(fā)明的胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子在胚乳中不表 達(dá),而在胚乳之外的其他主要組織中表達(dá)。
[0061] 為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性,本發(fā)明進(jìn)行了三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與上面實(shí)施 例類似,這里不再累述。
[0062] 雖然本發(fā)明以水稻為例進(jìn)行描述,但是
【申請(qǐng)人】認(rèn)為,本發(fā)明所獲得啟動(dòng)子的應(yīng)用 場(chǎng)景不限于水稻,本發(fā)明啟動(dòng)子可以用于各種禾本科作物,例如水稻、小麥、玉米、大麥、高 梁或燕麥,優(yōu)選為水稻。
[0063] 以上對(duì)本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的描述并不限制本發(fā)明,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本 發(fā)明作出各種改變或變形,只要不脫離本發(fā)明的精神,均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2,其特征在于,所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子 SAFES2包含下述序列之一或者下述序列的互補(bǔ)序列之一: (a) 序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列; (b) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲得的 核苷酸序列; (c) 在序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列中取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲得的 核苷酸序列; (d) 序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸后所獲得的核苷 酸序列; (e) 與序列表中SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列具有至少90%同源性的核苷酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2,其特征在于,所述水稻胚乳不 表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2在胚乳部位不表達(dá),在其他部位均有表達(dá)。3. -種表達(dá)盒,其特征在于,所述表達(dá)盒包含權(quán)利要求1所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子 SAFES2〇4. 一種重組表達(dá)載體,其特征在于,所述重組表達(dá)載體包含權(quán)利要求1所述的水稻胚乳 不表達(dá)啟動(dòng)子或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒;在所述重組表達(dá)載體中,所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng) 子SAFES2連接于載體中待表達(dá)的基因序列的上游。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體,其特征在于,所述重組表達(dá)載體為 PCAMBIA1391-SAFES2,其中pCAMBIA1391為作物雙元表達(dá)載體;所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基 因,或者所述待表達(dá)的基因是具有改善胚乳以外組織性狀功能的基因。6. -種利用權(quán)利要求1中所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2獲得相應(yīng)宿主菌的方 法,其特征在于,所述方法包括將權(quán)利要求1中所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2、權(quán)利 要求3所述的表達(dá)盒或者權(quán)利要求4或5所述的重組表達(dá)載體,利用凍融法轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌。7. -種利用權(quán)利要求1中所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)化子的方 法,其特征在于,所述方法包括利用權(quán)利要求6所獲得的宿主菌通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法對(duì)目標(biāo) 細(xì)胞、愈傷組織或植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化,獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)化子。8. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2在培育轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng) 用,其特征在于,所述應(yīng)用包括:將權(quán)利要求1所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2連接于 載體中待表達(dá)的基因序列上游,從而構(gòu)建重組表達(dá)載體;將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到作物 細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育,進(jìn)而獲得相應(yīng)轉(zhuǎn)基因植株,優(yōu)選地,所述待表達(dá)的基因?yàn)楦?良作物生長(zhǎng)特性的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)芐基因或者結(jié)構(gòu)基因的反義基因。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用,其特征在于,所述應(yīng)用用于改良作物生長(zhǎng)特性,所述作 物為禾谷類作物:水稻、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等。10. -種權(quán)利要求1中所述的水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2的分離方法,其特征在于, 所述方法包括: 步驟(1 )、根據(jù)所述水稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2的序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物; 步驟(2)、以水稻品種日本晴的DNA為模板,利用所述引物通過PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增所述水 稻胚乳不表達(dá)啟動(dòng)子SAFES2; 步驟(3)、回收PCR擴(kuò)增的目的片段,并將其連接到PGEM-T-Easy載體上; 步驟(4)、利用連接產(chǎn)物按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL-Blue感受態(tài)細(xì)胞; 步驟(5)、對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行PCR篩選,獲得陽(yáng)性克隆,挑取單克隆搖菌液提質(zhì)粒,用相應(yīng) 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證; 步驟(6)、將經(jīng)過鑒定的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,獲取測(cè)序正確的核苷酸序列,作為目標(biāo)序 列。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK105861506SQ201610389751
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】李 浩, 楊劍波, 李莉, 魏鵬程, 李娟 , 楊亞春, 秦瑞英, 許蓉芳
【申請(qǐng)人】安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所