高表達(dá)發(fā)酵單胞菌啟動(dòng)子的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。更具體地，鑒定了用于引導(dǎo)細(xì)菌中嵌合基 因表達(dá)的新型啟動(dòng)子。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物的乙醇生產(chǎn)提供了化石燃料的替代性能源且因此成為當(dāng)前研究的重要領(lǐng) 域。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis)是可用于商業(yè)乙醇生產(chǎn)的天然產(chǎn)乙醇生物。然 而，運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌天然情況下并不利用木糖，其為水解木質(zhì)纖維素物質(zhì)中主要的戊糖。人 們希望產(chǎn)乙醇生物利用木糖W充分利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)材料水解物中的碳水化合物底 物。
[0003] 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌和天然情況下不利用木糖的其它產(chǎn)乙醇生物可通過(guò)引入基因來(lái) 進(jìn)行針對(duì)木糖的基因工程，所述基因編碼1)木糖異構(gòu)酶，其催化木糖至木酬糖的轉(zhuǎn)化;2)木 酬糖激酶，其使木酬糖憐酸化W形成木酬糖-5-憐酸;3)轉(zhuǎn)酬醇酶;和4)轉(zhuǎn)醒醇酶。針對(duì)木糖 代謝對(duì)運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌菌株的工程化化S 5,514,583，US 5,712，133，US 6,566，107，US 5， 726,053，F(xiàn)eldmann等人（1992)Appl Microbiol Biotechnol 38:354-361，Zhang等人 (1995)Science 267:240-243)，W及對(duì)棟桐發(fā)酵桿菌（幻mobacter palmae)菌株的工程化 (化 nase 等人（2007)Appl. Environ.Mirobiol. 73:2592-2599)已有成功。然而，工程化的菌 株在木糖上的生長(zhǎng)W及產(chǎn)生乙醇通常不如葡萄糖一樣良好。
[0004] 對(duì)運(yùn)種工程化，已通過(guò)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌細(xì)胞中有活性的啟動(dòng)子來(lái)表達(dá)編碼用于 木糖代謝的異源蛋白質(zhì)的基因，所述啟動(dòng)子通常為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌甘油醒-3-憐酸脫氨酶 基因的啟動(dòng)子或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌締醇酶基因的啟動(dòng)子。針對(duì)木糖利用進(jìn)行工程化的菌株已 經(jīng)通過(guò)在木糖培養(yǎng)基上連續(xù)傳代而進(jìn)行馴化，產(chǎn)生了具有改善的木糖利用的菌株，如US 7223575和US 7741119中所述。US 7989206和US 7998722公開(kāi)了具有改善活性的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵 單胞菌甘油醒-3-憐酸脫氨酶基因啟動(dòng)子W及其在發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)中表達(dá)木糖異 構(gòu)酶用于木糖利用的用途。
[0005] 對(duì)于另外的強(qiáng)啟動(dòng)子依然有需求，所述另外的強(qiáng)啟動(dòng)子可用于對(duì)發(fā)酵單胞菌W及 其它產(chǎn)乙醇生物的基因工程W表達(dá)賦予改善的木糖利用的基因。所述啟動(dòng)子還可用于其它 基因的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了具有改善活性的合成啟動(dòng)子，其為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌甘油醒-3-憐酸 脫氨酶基因啟動(dòng)子的衍生物。
[0007] 因此，本發(fā)明提供了合成的核酸分子，其包含具有在位置90處T對(duì)C的堿基取代的 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌甘油醒-3-憐酸脫氨酶基因啟動(dòng)子;其中所述位置編號(hào)屬于SEQ ID NO: 1。 與天然運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌甘油醒-3-憐酸脫氨酶基因啟動(dòng)子相比，運(yùn)一堿基取代具有增加所 述啟動(dòng)子強(qiáng)度的效果。
[0008] 在其它方面，本發(fā)明提供了包含合成的核酸分子的嵌合基因 W及包含其的載體， 所述合成的核酸分子具有上述堿基取代。
[0009] 在另外的方面，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞的方法，所述細(xì)菌細(xì)胞選自發(fā)酵單胞 菌細(xì)胞和發(fā)酵桿菌(Zymobacter)細(xì)胞，所述方法包括將本發(fā)明的合成核酸分子引入到所述 細(xì)胞中。
[0010] 在另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的合成核酸分子的重組細(xì)菌菌株，所述重 組細(xì)菌菌株選自發(fā)酵單胞菌和發(fā)酵桿菌。
[0011] 在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供用于生產(chǎn)改善的合成甘油醒-3-憐酸脫氨酶基因 啟動(dòng)子的方法，該方法包括：
[0012] a)從來(lái)自發(fā)酵單胞菌和發(fā)酵桿菌的甘油醒-3-憐酸脫氨酶基因分離包含甘油醒- 3-憐酸脫氨酶基因啟動(dòng)子區(qū)域的核酸片段；
[0013] b)將在位置90處T對(duì)C的堿基取代引入到a)的分離片段，從而產(chǎn)生改善的合成甘油 醒-3-憐酸脫氨酶基因啟動(dòng)子。
【附圖說(shuō)明】 [0014] 和序列描述
[0015] 圖1示出了 PZP13的質(zhì)粒圖譜。
[0016] 根據(jù)下面的詳細(xì)描述W及構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的附帶的序列描述可更充分地理解 本發(fā)明。
[0017] 下列序列符合37C.F.R. 1.821-1.825Γ對(duì)含核巧酸序列和/或氨基酸序列公開(kāi)內(nèi) 容的要求-序列規(guī)則并且符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIP0)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(2009)及EP0和PCT的 序列表要求(規(guī)則5.2和49.5(a-bis)，W及行政性指示的208節(jié)和附錄C)。用于核巧酸和氨 基酸序列數(shù)據(jù)的符號(hào)和格式遵循在37C. F. R. §1.822中示出的規(guī)定。
[0018] SEQ ID N0:1為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4菌株的天然ZmPgap的核巧酸序列。[4236中#1]
[0019] SEQ ID ^:2為在位置90處具有(：到1'變化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌〔?4菌株的2111?旨曰口的 核巧酸序列。
[0020] SEQ ID N0:3為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的ZM4菌株的天然ZmPgap的核巧酸序列。[4236中# 2]
[0021] SEQ ID ^:4為在位置90處具有(：到1'變化的運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌214菌株的2111?旨曰口的 核巧酸序列。
[0022] 沈Q ID N0:5為pZB4的ZmPgap的核巧酸序列。
[0023] [4236 中 T 缺失 #3]
[0024] SEQ ID N0:6為在位置90處具有巧ljT變化的pZB4的ZmPgap的核巧酸序列。
[0025] SEQ ID ^:7為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌214菌株的2111?旨曰9的核巧酸序列，其在位置285處 具有T缺失(如在pZB4中）并且在位置90處具有C到T的變化。
[0026] 沈Q ID N0:8為l，951-bp DP1341-U片段的核巧酸序列。
[0027] 沈Q ID N0:9為l，255-bp DP1341-U片段的核巧酸序列。
[002引 SEQ ID NO: 10為GUS編碼序列的核巧酸序列。
[00巧]沈Q ID N0:11為大腸桿菌化.coli)araD 3'UTR的核巧酸序列。
[0030] SEQ ID ^:12為596(3-1?表達(dá)盒的核巧酸序列。
[0031] 沈Q ID NO: 13為pZPl332的核巧酸序列。
[0032] 沈Q ID備：14為92?1337的核巧酸序列。
[0033] 沈9 10^:15為1〇義?巧片段的核巧酸序列，其位于所述596(3-1?表達(dá)盒的5/。
[0034] 沈9 10^:16為1〇義?巧片段的核巧酸序列，其位于所述596(3-1?表達(dá)盒的3/。
[0035] 包括1〇義?巧位點(diǎn)和限制位點(diǎn)的側(cè)翼1〇義?巧序列為569 10^:15和16。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 可使用下列定義闡釋權(quán)利要求書(shū)和說(shuō)明書(shū)：
[0037] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"包含"、"包含的"、"包括"、"包括的"、"具有"、"具有的"、"含 有"或"含有的"，或者它們的任何其它變型旨在涵蓋非排他性的包括。例如，包含元素列表 的組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備不必僅限于那些元素，而可W包括其他未明確列 出的元素，或此類(lèi)組合物、混合物、工藝、方法、制品或設(shè)備固有的元素。此外，除非明確指明 相反，"或"是指包含性的"或"而非排他性的"或"。例如，條件A或B滿足下列任一項(xiàng):A為真實(shí) 的（或存在的）且B為虛假的（或不存在的），A為虛假的（或不存在的）且B為真實(shí)的（或存在 的），W及A和B均為真實(shí)的(或存在的）。
[0038] 此外，設(shè)及元素或組分的實(shí)例（即出現(xiàn))的數(shù)目在本發(fā)明元素或組分前的不定冠詞 "一個(gè)"或"一種"旨在為非限制性的。因此，應(yīng)將"一個(gè)"或"一種"理解為包括一個(gè)(種)或至 少一個(gè)(種），并且元素或組分的詞語(yǔ)單數(shù)形式也包括復(fù)數(shù)指代，除非有數(shù)字明顯表示單數(shù)。
[0039] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"發(fā)邸'或"本發(fā)邸'是非限制性術(shù)語(yǔ)，并且不旨在意指本發(fā)明的 任何單獨(dú)實(shí)施例，而是涵蓋如本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求所述的所有可能的實(shí)施例。
[0040] 如本文所使用，修飾本發(fā)明的成分或反應(yīng)物的量使用的術(shù)語(yǔ)"約"是指可發(fā)生的用 數(shù)字表示的量的變化，例如:在真實(shí)世界中，通過(guò)用于制備濃縮物或使用溶液的一般測(cè)量和 液體處理操作;通過(guò)運(yùn)些操作中非故意的誤差;通過(guò)用于制備組合物或執(zhí)行方法的成分的 制造、來(lái)源或純度中的差異;等等。術(shù)語(yǔ)"約"還包括由于相對(duì)于由特定起始混合物所得的組 合物的不同平衡條件而不同的量。無(wú)論是否由術(shù)語(yǔ)"約"來(lái)修飾，權(quán)利要求包括量的等同量。 在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)"約"指在報(bào)告數(shù)值10 % W內(nèi)，優(yōu)選地在報(bào)告數(shù)值5 % W內(nèi)。
[0041] 術(shù)語(yǔ)"木糖異構(gòu)酶"是指催化D-木糖和D-木酬糖的互變的酶。木糖異構(gòu)酶(XI)屬于 歸類(lèi)為EC 5.3.1.5的酶的組。
[0042] 術(shù)語(yǔ)"木酬糖激酶"指憐酸化木酬糖形成木酬糖-5-憐酸的酶。
[0043] 術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)酬醇酶"和"轉(zhuǎn)醒醇酶"指戊糖憐酸化途徑中的兩種酶，其將木酬糖-5-憐 酸轉(zhuǎn)化成連接戊糖代謝與化tner-Douderof f糖酵解途徑的中間體，該途徑使木糖代謝成乙 醇。
[0044] 術(shù)語(yǔ)"基因"指表達(dá)特定蛋白質(zhì)或功能性RNA分子的核酸片段，其可任選地包括位 于編碼序列之前（5/非編碼序列）和之后的調(diào)控序列（3/非編碼序列）。"天然基因"或"野生 型基因"指具有其自身調(diào)控序列的天然存在的基因。"嵌合基因"指不是天然基因的任何基 因，包含在天然情況下不是一起存在的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可包括源于不 同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或者包括源于同一來(lái)源但W不同于天然存在的方式排列的 調(diào)控序列和編碼序列。"內(nèi)源基因"是指在生物基因組中處于其天然位置的天然基因。"外來(lái) 基因"指正常情況下不存在于宿主生物中的基因，但是它通過(guò)基因轉(zhuǎn)移引入到宿主生物中。 外來(lái)基因可包含插入到非天然生物內(nèi)的天然基因，或