專利名稱：桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肌動(dòng)蛋白是真核生物中普遍存在的一種古老的蛋白質(zhì)，它是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要成分。在高等植物中，有肌動(dòng)蛋白組成的微絲參與細(xì)胞分裂、胞質(zhì)環(huán)流、延長(zhǎng)生長(zhǎng)等重要的生理活動(dòng)。細(xì)胞器表面的肌球蛋白與微絲接觸，肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白相互作用，ATP化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械能，推動(dòng)細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)。單體肌動(dòng)蛋白一般由375-377個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為42kDa。由于肌動(dòng)蛋白基因非常保守，所以被作為一種進(jìn)化研究中的分子標(biāo)記廣泛采用。大部分肌動(dòng)蛋白基因在植物各種組織中都有高效且穩(wěn)定的表達(dá)，所以其啟動(dòng)子具有高效，穩(wěn)定的啟動(dòng)活性。現(xiàn)有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)基因研究都是采用植物通用的組成型啟動(dòng)子，如CMV35s、玉米Ubi 啟動(dòng)子等，由于植物中存在對(duì)外部DNA的識(shí)別及防御機(jī)制，所以在研究中經(jīng)常出現(xiàn)基因沉默或者表達(dá)量過(guò)低的現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子核酸序列，以及核酸序列延長(zhǎng)、截短或具有80%以上同源性的具有啟動(dòng)活性的核酸序列。針對(duì)外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中存在的基因沉默及表達(dá)量過(guò)低的問(wèn)題，以及在植物中的報(bào)告基因需要有強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng)的需要，提供桑樹(shù)中的一個(gè)內(nèi)源性強(qiáng)啟動(dòng)子及其在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子，通過(guò)下列步驟克隆得到
一、桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子5’端調(diào)控序列的分離
1)桑樹(shù)基因組的提取；
2)桑樹(shù)基因組酶切消化；
3)桑樹(shù)基因組酶切產(chǎn)物純化；
4)銜接頭連接到消化的桑樹(shù)基因組上；
5)采用槽式PCR方法獲得基因片段；
二、擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)切膠回收并連接到pMD19-TVector (Takara)，挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。本發(fā)明同時(shí)提供桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子的應(yīng)用，S卩利用獲得的MaACT3啟動(dòng)子構(gòu)建啟動(dòng)子_目的基因_終止序列的表達(dá)盒，構(gòu)建成植物表達(dá)載體，并采用農(nóng)桿菌感染方法進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)，具體操作如下
一、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
1)采用PCR法分別獲得MaACT3啟動(dòng)子、EGFP以及Nos片段，切膠回收備用；
2)融合PCR擴(kuò)增構(gòu)建MaACT3啟動(dòng)子-EGFP-Nos表達(dá)盒；3)含三個(gè)元件的融合片段經(jīng)切膠回收、雙酶切消化及乙醇沉淀回收等步驟，插入植物表達(dá)載體PCMBIA1300的酶切位點(diǎn)損ο I和幻7/ I之間；
二、瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)
1)利用凍融法將植 物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，采取PCR法鑒定陽(yáng)性克?。?br> 2)瞬時(shí)表達(dá)具體方法采用農(nóng)桿菌感染桑樹(shù)成熟葉片的方法，熒光顯微鏡觀察熒光蛋白在桑樹(shù)葉片中的表達(dá)情況。上述植物表達(dá)載體的構(gòu)建中，EGFP為增強(qiáng)型的綠色熒光蛋白基因，常用作植物轉(zhuǎn)基因的報(bào)告基因。Nos片段為胭脂堿合成酶的終止子，在植物啟動(dòng)子活性研究中用作表達(dá)終止元件。載體PCMBIA1300是目前廣泛采用的植物雙元表達(dá)載體，其中含有潮霉素抗性的表達(dá)框，可以在植物轉(zhuǎn)基因中作為篩選標(biāo)記。桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子可應(yīng)用于外源基因的真核表達(dá)，同時(shí)可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物。


圖ι為槽式PCR擴(kuò)增桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子，1-5泳道為第一輪PCR的結(jié)果，6_10 為第二輪PCR的結(jié)果，其中8，9擴(kuò)增的片段含有922bp的啟動(dòng)子區(qū)域和肌動(dòng)蛋白基因的5’ 端區(qū)域。圖2為綠色熒光蛋白EGFP在桑樹(shù)葉片中的瞬時(shí)表達(dá)，圖中亮綠色的區(qū)域代表綠色熒光蛋白EGFP表達(dá)的區(qū)域，黑色的區(qū)域代表沒(méi)有熒光蛋白表達(dá)的區(qū)域。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是
本發(fā)明采用桑樹(shù)內(nèi)源性的強(qiáng)啟動(dòng)子代替植物通用型啟動(dòng)子，可以避免外源基因轉(zhuǎn)入桑樹(shù)中產(chǎn)生的基因沉默及表達(dá)量過(guò)低的問(wèn)題。利用農(nóng)桿菌T-DNA區(qū)將啟動(dòng)子-目的基因-終止序列表達(dá)盒導(dǎo)入植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效穩(wěn)定表達(dá)，獲得組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物，尤其在驅(qū)動(dòng)篩選標(biāo)記及報(bào)告基因的表達(dá)中具有重要意義，也為植物基因工程技術(shù)的研究和應(yīng)用提供了重要價(jià)值的啟動(dòng)子和調(diào)控元件。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子的克隆一、桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子5’端調(diào)控序列的分離
1)采用CTAB法提取桑樹(shù)基因組，并用核酸蛋白儀及0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組 DNA ；
2)分別取20μg用2μ L限制性內(nèi)切酶Pn/ U、Dra I, Sma I, Stu I禾口 V (Takara )，酶切過(guò)夜；
3)乙醇沉淀法回收酶切產(chǎn)物在酶切產(chǎn)物中加入等體積酚氯仿(V:V=1:1)充分混勻，12 OOOx g，常溫離心5分鐘，取上清；加入1/10體積的NaAc (3M，PH5. 2)以及2. 5-3倍體積的無(wú)水乙醇，室溫靜置10分鐘，13 OOOx g常溫或者4°C離心15分鐘，棄上清；用80% 乙醇溶液清洗沉淀2次，室溫干燥，加入TE緩沖液或無(wú)菌水溶解備用；
4)銜接頭由兩條鏈(長(zhǎng)鏈5，-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGG GCTGGT-3’ ；短鏈5’ -NH2-ACCAGCCC-P04-3')退火形成，將銜接頭與酶切產(chǎn)物相連接，連接體系(40 μ L)基因組酶切產(chǎn)物 8μ L ；接頭 4μ L ； 40%PEG4000 20 μ L ；IOxLigation Buffer4 μ L，T4連接酶(Fermentas)2 μ L，無(wú)菌水2 μ L，22°C保溫4小時(shí)；連接產(chǎn)物在70°C保溫10 分鐘，并用上述乙醇沉淀法回收連接產(chǎn)物作為PCR的模板；
5)根據(jù)報(bào)道的MaACT3的mRNA設(shè)計(jì)兩條基因特異引物GSPl (5’ -CCACTGGCATAGAGGGA AAG-3，)和 GSP2 (5，-GCATCCTTTTGGCCCATAC-3’ )，根據(jù)長(zhǎng)接頭設(shè)計(jì)兩條引物 APl (5' -TCTGTGAGGTCACG TCCAGC-3‘)和 AP2(5' -TTGCCTTGGACTACGAGCAGG-3‘)；先采用 GSPl和APl進(jìn)行第一輪擴(kuò)增，然后采用GSP2和AP2進(jìn)行第二輪擴(kuò)增獲得特異片段；采用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，片段與Takara公司的pMD19_T Vector載體相連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑選陽(yáng)性克隆，送到南京金斯瑞公司測(cè)序；
二、擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)回收并連接到pMD19-T Vector (Takara)，挑選陽(yáng)性克隆并測(cè) 序。實(shí)施例2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建
一、MaACT3啟動(dòng)子與熒光蛋白基因EGFP的融合
采用PCR法擴(kuò)增分別回收獲得MaACT3啟動(dòng)子、EGFP以及Nos的片段作為融合PCR材料；擴(kuò)增片段所用引物如下
MaACT3 啟動(dòng)子上游引物5' -CCGCTCGAGACGCGTCATGGGGTCCCTAAATCAG-3‘ MaACT3 啟動(dòng)子下游引物5' -TCCTCGCCCTTGCTCACCATTTTCTATTGTATTTCTGCAG-3‘ EGFP 上游引物5 ‘ -CTGCAGAAATACAATAGAAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ‘ EGFP 下游引物5 ‘ -ATTCGAGCTGGTCACCAATTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3 ‘ No s 上游引物5 ‘ -ATGGACGAGCTGTACAAGTAAATTGGTGACCAGCTCGAAT-3 ‘ No s 下游引物5 ‘ -AAAGGGCGGCCGCTATTAATTAACCCGATCTAGTAACATAGATGA-3 ‘ 融合 PCR 擴(kuò)增體系(25 μ L) IOxPCR Buffer 2. 5 μ L、MgCl2 2 μ L、MaACT3 啟動(dòng)子上游引物和Nos下游引物各1 μ L、模板總體積2 μ L (三個(gè)片段摩爾數(shù)相等)、LA Taq酶0. 2 μ L (5U/ μ L)和無(wú)菌水14. 8 μ L ；擴(kuò)增程序94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，70°C退火5分鐘，72 °C延伸2分鐘；94 V變性30秒，70 V退火30秒，72 °C延伸2分鐘，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；72 °C 延伸10分鐘；4°C保存；
二、含三個(gè)元件的融合PCR片段經(jīng)切膠回收、雙酶切消化及乙醇沉淀等步驟，插入農(nóng)桿菌植物表達(dá)載體PCMBIA1300的酶切位點(diǎn)損ο I和幻w I之間，雙酶切及測(cè)序證實(shí)瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建成功。實(shí)施例3 瞬時(shí)表達(dá)檢測(cè)
利用凍融法將植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，采取PCR法鑒定陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆在YEB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至OD=L 5-2. 4之間，離心收集菌體，利用感染培養(yǎng)基(1/4MS培養(yǎng)基 +100 μ m乙酰丁香酮)重懸沉淀2次，最后稀釋成OD=O. 5 ；將桑樹(shù)成熟葉片切成Icm2大小， 在0. 1%升汞中消毒5分鐘，無(wú)菌水漂洗3次以上；然后將消毒后的葉片浸泡在菌液中保持 30分鐘，放在用感染培養(yǎng)基浸濕的濾紙上，22°C黑暗培養(yǎng)3天，采用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白在桑樹(shù)葉片中的表達(dá)情況。
權(quán)利要求
1.桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子，其特征在于如說(shuō)明書(shū)序列表所示的核酸序列，以及核酸序列延長(zhǎng)、截短或具有80%以上同源性的具有啟動(dòng)活性的核酸序列。
2.權(quán)利要求1所述的桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子的克隆方法，其特征在于包括以下步驟1)桑樹(shù)基因組的提?。?)桑樹(shù)基因組酶切消化；3)桑樹(shù)基因組酶切產(chǎn)物純化；4)銜接頭連接到消化的桑樹(shù)基因組上；5)采用槽式PCR方法獲得基因片段；6)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)切膠回收并連接到pMD19-TVector (Takara)，挑選陽(yáng)性克隆并測(cè)序。
3.權(quán)利要求1所述的桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于，利用該啟動(dòng)子構(gòu)建啟動(dòng)子_目的基因_終止序列的表達(dá)盒，構(gòu)建成植物表達(dá)載體。
4.權(quán)利要求1所述的桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子應(yīng)用于外源基因的真核表達(dá)。
5.權(quán)利要求1所述的桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物。
全文摘要
本發(fā)明涉及桑樹(shù)肌動(dòng)蛋白MaACT3啟動(dòng)子及其克隆、植物表達(dá)載體構(gòu)建方法及應(yīng)用?？寺》椒òㄉ?shù)基因組的提取、酶切消化、酶切產(chǎn)物純化、銜接頭連接到消化的桑樹(shù)基因組上、采用槽式PCR方法獲得基因片段、回收擴(kuò)增的片段，連接到pMD19-TVector載體(Takara)上并測(cè)序等步驟。本發(fā)明采用桑樹(shù)內(nèi)源性的強(qiáng)啟動(dòng)子代替植物通用型啟動(dòng)子，可以避免外源基因轉(zhuǎn)入桑樹(shù)中產(chǎn)生的基因沉默及表達(dá)量過(guò)低的問(wèn)題。利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將啟動(dòng)子-目的基因-終止序列表達(dá)盒導(dǎo)入植物基因組中，可以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效穩(wěn)定表達(dá)，獲得組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102220328SQ20111015424
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月9日
發(fā)明者余茂德, 呂蕊花, 吳存容, 張瓊予, 李軍, 李鎮(zhèn)剛, 王茜齡, 趙愛(ài)春, 金筱耘, 魯成 申請(qǐng)人:西南大學(xué)