植物種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSee1的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種水稻 種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel及其應(yīng)用，該啟動(dòng)子能夠在水稻轉(zhuǎn)基因調(diào)控體系中特異性的 驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因的在種子中的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物基因表達(dá)受生物體內(nèi)各種理化因素的調(diào)節(jié)控制，植物能夠根據(jù)自身需要及環(huán) 境的改變，定時(shí)、定位及定量地表達(dá)所需要的基因產(chǎn)物?；虮磉_(dá)在DNA水平、轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn) 錄后水平、翻譯水平、翻譯后加工、運(yùn)輸及定位等各個(gè)層次都進(jìn)行著精細(xì)的調(diào)控?；蜣D(zhuǎn)錄 水平表達(dá)調(diào)控是基因表達(dá)調(diào)控中最主要的調(diào)控方式，在這一系列過程中涉及到啟動(dòng)子、終 止子、UTR序列等調(diào)控元件，在這些調(diào)控元件中，啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄頻率，作用尤 為重要。
[0003] 啟動(dòng)子是RNA聚合酶能夠識(shí)別并與之結(jié)合，從而起始基因轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列，通 常位于基因上游，其長度因生物種類而異?；虻膯?dòng)子區(qū)基本上是由兩部分組成：一部 分是形成普通性轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)所需要的，通常稱為核心啟動(dòng)區(qū)，包括轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及鄰近的TATA 框；另一部分是決定基因轉(zhuǎn)錄特異性和活性的區(qū)域。兩部分都參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，但后一 部分起主要的控制作用。核心啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄的準(zhǔn)確起始，而啟動(dòng)子上游順式調(diào)控元件則 決定時(shí)空差異表達(dá)的有序進(jìn)行。經(jīng)序列分析研究發(fā)現(xiàn)，組織特異啟動(dòng)子的順式調(diào)控元件有 一定的保守性，而這些特異序列元件也正是基因特異表達(dá)所必須的。
[0004] 種子特異性啟動(dòng)子具有基本啟動(dòng)子、起始子和上游元件。其中，基本啟動(dòng)子和起始 子是行使轉(zhuǎn)錄所必要的。基因表達(dá)時(shí)間、表達(dá)部位需要啟動(dòng)子上的順式調(diào)控元件與相應(yīng)的 轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用。種子特異性啟動(dòng)子區(qū)別于其它類型啟動(dòng)子的顯著特點(diǎn)是啟動(dòng)子上游 存在一些特異的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件與調(diào)控種子特異性基因的特異表達(dá)有關(guān)。
[0005] 在組成型啟動(dòng)子的控制下，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的所有部位和所有發(fā)育階段表 達(dá)，不但造成植物能量和養(yǎng)分的消耗，可能導(dǎo)致宿主植物性狀的改變，影響植物的生長發(fā) 育。而種子特異性啟動(dòng)子可以控制外源基因在植物種子中高效表達(dá)，避免外源基因在植物 的其它部位表達(dá)所造成的能量、營養(yǎng)浪費(fèi)，減少對(duì)植物的不利影響。
[0006] 此外，我們的主要糧食作物和油料作物例如小麥、水稻、玉米和油菜等，其主要的 食用部位均為種子。因此，種子特異性啟動(dòng)子的研究對(duì)植物基因工程的發(fā)展和人們生產(chǎn)生 活水平的提高具有十分重要的意義。但是，很明顯目前人們對(duì)種子特異啟動(dòng)子方面的研究 并不夠，目前所公開的種子特異啟動(dòng)子并不能滿足研究和生產(chǎn)的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種分離鑒定本底信號(hào)低、特異性高的新型 啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子對(duì)作物基因工程將有著重要的意義。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel，該 水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel包含：
[0009] 1)序列表中SEQNo:1所不的DNA分子；或者
[0010] 2)在嚴(yán)格條件下與1)中的DNA序列雜交且具有啟動(dòng)子功能的DNA分子；或者
[0011] 3)與1)或2)限定的DNA序列具有90%以上的同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA 分子;或
[0012] 4)在SEQIDNO: 1中所示的核苷酸序列中添加、缺失或取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸后 所獲得的具有啟動(dòng)子功能的核苷酸序列。
[0013] 2)、3)和4)中水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子序列與SEQIDNo: 1所示的DNA序列具有 相同的功能，即驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因在植物中表達(dá)。
[0014] 序列表中SEQIDNo: 1所示的DNA序列為來源于日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)的水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子，本文中稱為OsSeel或啟動(dòng)子OsSeel。具體 而言，本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)日本晴水稻（OryzasativaLcv.Nipponbare)基因上游包括轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1960bp的DNA序列，具有驅(qū)動(dòng)目標(biāo)基因水稻種子中特異性表達(dá)的功能， 并且分離克隆、并鑒定了該DNA序列的功能。
[0015] 另一方面，本發(fā)明提供一組擴(kuò)增所述DNA片段或其部分片段的引物對(duì)。
[0016] 另一方面，本發(fā)明提供一種含有所述DNA片段的重組載體或表達(dá)盒。
[0017] 另一方面，本發(fā)明提供一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為在植 物表達(dá)載體PCAMBIA1391的多克隆位點(diǎn)插入所述的DNA片段得到的重組質(zhì)粒，在所述重組 表達(dá)載體中，所述水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSee1連接于載體中待表達(dá)的基因序列的上 游
[0018] 優(yōu)選地，所述待表達(dá)基因?yàn)榫哂懈纳扑痉N子性狀功能的基因。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供一種宿主菌或轉(zhuǎn)化子，其特征在于，所述宿主菌或轉(zhuǎn)化子包 含所述的水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel、所述的重組表達(dá)載體、或所述的表達(dá)盒。
[0020] 另一方面，本發(fā)明提供一種所述水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel在培育轉(zhuǎn)基因 植物中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：將所述的水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel連 接于載體中待表達(dá)的基因序列上游，從而構(gòu)建重組表達(dá)載體；將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到 水稻細(xì)胞、組織或器官中進(jìn)行培育，優(yōu)選地，所述待表達(dá)基因?yàn)榫哂懈纳扑痉N子性狀功能 的基因。
[0021] 在一種實(shí)現(xiàn)方式中，在所述重組表達(dá)載體中，所述水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子 OsSeel連接于待表達(dá)的基因序列的上游；所述待表達(dá)的基因?yàn)镚us基因，所述重組表達(dá)載 體為pCAMBIA1391-〇sSeel，該重組表達(dá)載體為將SEQIDNo:1所示的序列即OsSeel或啟動(dòng) 子OsSeel構(gòu)建于pCAMBIA1391中得到的重組表達(dá)載體，本文中稱為pCAMBIA1391-〇sSeel。
[0022] 另一方面，本發(fā)明提供一種所述水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel在培育高產(chǎn)水 稻中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括：將所述的水稻種子特異表達(dá)啟動(dòng)子OsSeel與目 標(biāo)基因相連，并構(gòu)建于載體中獲得重組表達(dá)載體，然后，將所述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到水稻細(xì) 胞、組織或器官中進(jìn)行培育。
[0023] 本發(fā)明中所提供的啟動(dòng)子的DNA序列為（與序列表中SEQIDNo: 1中相同）：
[0024] AATCACTACGCAATATGTTTGTAGCCCAATTTCAAGACTTACCGATCATTTGTGCA GGAGGGTGTGAAACATGGGATCTCTTGCTTGTCTCAAGACTCGTATGGTGCCTATATTGCTGCGTCATGCATGGATA ACAGGTATAACCGCAATCAACCACACTGCCTCAGACTTAATATGCCATTTGTGAAGGCTGCCTTTGACTTTATAAGC CTTTCAGGATCTATTTGTACAGTGCTCTTCATATGGATAAAGGCCCAATTAAGGCTTACACTGGCAGCAAAATTGAA TCTTTTTTTGTCAAGGTCAGTGAGTGAACAAGCTGAGTTGATTTCCATTTTTCAAACCGCATGCCTGCTTGTTCTTA GGTAGTTTTATCTGCTATGTTTTATAACACCTGATATGTTGGTCAAATGCAGTCTGCTATCAGCCCTGATGGAACTC ACATTCTTGGTGGTTCGAGTGATGGCAACGTGTACTTATGGCAGGTAGTTGTTGGATCATGTTATCATTTCGCACAC GCATTAGCTGCTCTTTTACTTTCTATTCATGCCACTACTTTTTCACTGACATAGGTGGATCAGCCTGAAAGAGGTCC TATAATTTTGGAAGGCCATGAAGGTGAAGCTACTTCAGTTGACTGGTATGTTCTACATACAATTGTAGTTTTTTTTT GTGTAAATCTTATCAACCATCCAATGTTCAGATTTCAGTACGATTTTTTCACAATTTTCAGGTGTGCATCAGAGGTC GGGAAGATCGCAACGTCATCTGACGATTCCAAGGTGAGTATGTGATTAACCTTGCAAATTTTGTTCATTCAACTTTC ATGAATCTTATGAGAATGAGATCCTTTTCTTTTTCTATTACACACCTACATGTTGCAAGCGAATTTAAATGCCTGTT TTGGTATGTAGAAAGGGGAGCTGCTGATATTCAGTATTTTTTTTAAGAAAACCACTGATAACAACACTTTATGATGT GTATCTATCAGGTTCGCGTATGGAATACTGAGAGAAGGGTGTTCCCAAACACAAGTTCCCCAACGGTCATCCGCAAG AGAATAACCGCACCAAACACTGGAAGCCGGTCTGCTAGCCATGAGCTAGCTACTACCTCAAGAGATGTAGGAGTAGC AGCCTGCACCAGTGCAGATGGTGAATTGCCAACTGGTTCACGCTCTCCCCTTCAGCCCAGAGTACTGGAGTTTGGCA CACCGGAGTCAGCGAAGAAGAGAGCCTTTAGGTTGTTTCAGGAGGACTCATTGGACATAAGGAAAAGCCCAGAGGCT CAAATGAACAGCCCTTCTTCGGTTCTAAGCCCCCCACATTCACTGAAGAGGAGAACAATTCGGGACTACTTTGCTAG TAGCTCATCTTGTGAGCACACCAAGCATGTCCATGACCTTGCACTCTTGGCTCACTCGTCAACTGTGAAGAACCTCA AAAATGCTCAATATAGCTACAGGTGCCTGAAAAAATAACTTTAAAGTTTTGAACATCGATTTCACTAAACAACAATT ATTATCTCCCTCTGAAATGTTGCTACCTAAGATGATAGTTTAGAACTCTAGAATCATTGTCGGCGGAGAAAGTAAAT TATTTTCCCCAAATTTCCAGCTATGAAAAAACCCTCACCAAACACCATCAAACAAGAGTTCACCAAACCGCCCATGC GGCCATGCTGTCACGCAACGCACCGCATTGCCTGATGGCCGCTCGATGCATGCATGCTTCCCCGTGCACATATCCGA CAGACGCGCCGTGTCAGCGAGCTCCTCGACCGACCTGTGTAGCCCATGCAAGCATCCACCCCCTCCACGTACACCCC CTCCTCCTCCCTACGTGTCACCGCTCTCTCCACCTATATATGCCCACCTGGCCCCTCTCCTCCCATCTCCACTTCAC CCGATCGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCGTTGCATTCATCTTGCMGCTAGCTTAGCA
[0025] 需要說明的是：上述啟動(dòng)子的DNA序列中，序列開頭以斜體并加粗表示的序列 "AATCACTACGCAATATGTTTGT"為獲得啟動(dòng)子過程中使用的正向引物的留存序列，共計(jì)22bp; 序列末尾以斜體并加粗表示的序列"CATCTTGCTAGCTAGCTTAGCA"為獲得啟動(dòng)子過程中使用 的反向引物的留存序列（該留存序列與反向引物的相應(yīng)序列互補(bǔ)），共計(jì)22bp;該DNA序列 中剩余的部分則為獲自日本晴水稻中的DNA序列。需要強(qiáng)調(diào)的是，本文中所提到的啟動(dòng)子 既可以指上述整個(gè)DNA序列，也可以指去除上述引物留存序列后的DNA序列。需要說明的 是，即便本領(lǐng)域技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，采用其他引物獲得了類似序列，其也落入本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0026] 綜上所述，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)、提取并鑒定了日本晴水稻（OryzasativaL cv.Nipponbare)OsSeel基因上游包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在內(nèi)的1960