一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法，以及其在殼寡糖生產中的應用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]殼聚糖是由D-氨基葡萄糖通過β-1，4_糖苷鍵連接的一類陽離子型氨基多糖，是幾丁質部分或完全脫乙?；难苌?，在過去的幾十年里殼聚糖作為潛在的生物活性物質被廣泛研究，但是殼聚糖的應用仍存在一些缺陷，如在生理條件下的低溶解性和高粘度導致其有效應用受到阻礙。殼寡糖是殼聚糖經水解后產生的一類聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖類化合物，具有獨特的生理活性和優(yōu)越的功能性質，在食品、農業(yè)、醫(yī)藥和化工領域具有重要應用，如可以作為功能性食品添加劑和防腐劑，在農業(yè)上作為植物調節(jié)劑和生物防治劑，在醫(yī)藥上可以作為抗癌和免疫系統(tǒng)的藥物等。
[0003]殼寡糖的制備方法有酶法、氧化法和酸降解法，其中酶法制備殼寡糖具有反應條件溫和、可人為控制降解速率和產物相對分子質量、不產生二次污染等優(yōu)點。在酶法制備殼寡糖中，具有突出應用前景的是專一性酶(殼聚糖酶)轉化法制備，其相對于非專一性酶(如纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶和果膠酶等)來說，具有催化效率高、產物聚合度適中且具有高生理生化活性等突出優(yōu)點。殼聚糖酶(Chit0SanaSe，EC 3.2.1.132)作為一類催化氨基葡萄糖間的β-1，4_糖苷鍵斷裂，專一性降解殼聚糖的糖苷水解酶，是在催化殼聚糖底物水解轉化制備殼寡糖的產業(yè)化領域具有重要應用前景的酶類，尤其是在低分子量且高生理活性的殼寡糖制備方面的應用引人注目。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法及其應用，本發(fā)明是在篩選獲得一株用于番茄和葡萄根結線蟲害防治的淡紫擬青霉(發(fā)明專利CN104818216 Α)的基礎上，研究表明該菌株高產殼聚糖酶，以此優(yōu)化其培養(yǎng)工藝，并確立了簡單易行的殼聚糖酶制備及純化方法，所述純化方法采用成本較低且操作簡單的一次柱純化工藝制備精純殼聚糖酶，有別于以往的二次層析制備工藝，所述純化后的殼聚糖酶可通過高效水解殼聚糖來生產高生理活性的殼寡糖。
[0005]本發(fā)明是通過如下技術方案來實現(xiàn)的:
[0006]淡紫擬青霉ΥΤ08菌株，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期:2014年11月26日，保藏號為CGMCC N0.10026，分類命名:淡紫擬青霉(Paecilomyces Iilacinus)。
[0007]—種淡紫擬青霉殼聚糖酶的制備方法，包括如下步驟:I)粗酶制備:淡紫擬青霉YT08發(fā)酵液經lOOOOr/min離心5min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經微孔過濾膜過濾除淡紫擬青霉YT08菌體，即為粗酶液；
[0008](2)淡紫擬青霉殼聚糖酶純化:在步驟(I)獲得的粗酶液中加入固體硫酸銨至30 %的飽和度，4°C冰箱冷藏靜置5?1h后，離心去除雜蛋白，并收集上清液;離心去雜蛋白后的上清液上再加入固體硫酸銨至80 %的飽和度，4°C冰箱冷藏靜置過夜，離心，收集沉淀；用pH5.0的0.2mol/L HAc-NaAc緩沖液溶解沉淀，在透析袋中透析除鹽，透析后的酶液經PEG4000濃縮后經Sephadex G-100柱層析純化，用0.2mol/L pH5.0HAc-NaAc緩沖液洗脫，流速在0.5?I m L / m i η ;檢測每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后經PEG4000濃縮，即得純化后的淡紫擬青霉殼聚糖酶，冷凍干燥后制得固態(tài)淡紫擬青霉殼聚糖酶。
[0009]進一步，淡紫擬青霉殼聚糖酶粗酶液的制備方法為(I)菌種活化:取保存淡紫擬青霉ΥΤ08菌種接種于活化培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm下培養(yǎng)至菌體渾濁，制得活化種子液；
[0010](2)發(fā)酵生產殼聚糖酶:按照0.2?0.8% (v/v)的接種量在滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基中接入步驟(I)活化種子液，在180rpm的旋轉搖床中培養(yǎng)，控制溫度為30?34°C，發(fā)酵3-5d后培養(yǎng)完畢，發(fā)酵液經離心過濾除菌后直接作為殼聚糖酶液使用；或者在發(fā)酵罐中以70%的體積比例裝入發(fā)酵培養(yǎng)基，經118°C蒸汽滅菌20min后，按照0.2?0.8% (v/v)的比例接入活化的菌種，控制發(fā)酵過程中的pH始終維持在pH 5?6.5，調節(jié)培養(yǎng)溫度在30?34°C，溶解氧維持在10% (mg/ml)以上，經發(fā)酵2-4d后發(fā)酵完畢，經離心過濾除菌后直接作為殼聚糖酶液使用。
[0011 ]進一步，所述的活化培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氫鉀I，硫酸鎂0.5，pH 7.0，121°C滅菌20min備用。
[0012]進一步，所述得發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油10?20，大豆蛋白胨20?35，MnS04 0.5?2.5，粉末殼聚糖(85%以上的脫乙酰度)12?20，NaCl 2.5?4，CaCl2 0.5?1.5，MgS〇4 1.5?3.5，F(xiàn)eS〇4 0.5?2，pH 5?6.5。
[0013]本發(fā)明還提供一種利用上述純化后的淡紫擬青霉殼聚糖酶生產殼寡糖的方法:取90 %以上脫乙酰度的殼聚糖，按照殼聚糖與水的質量比為1:10比例加水混合，逐漸滴加乙酸使殼聚糖完全溶解，然后滴加乙酸鈉溶液調溶液PH至5.5?6.0，按照殼聚糖:溶液實際體積= 1:25?1:40比例加水定容，并于35°C?50°C保溫10?15min;向保溫的殼聚糖底物溶液中按照50?80U/g的比例加入純化后的淡紫擬青霉殼聚糖酶，混合均勻后進行酶解反應，整個反應過程中控制酶解反應溫度為35°C?50°C;當酶解反應進行8?15h，殼寡糖含量不再增加時終止反應;酶解產物溶液經過截留分子量1kDa的超濾膜過濾，收集膜透過液組分，濃縮后冷凍干燥制備殼聚糖。
[0014]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比的有益效果:
[0015](I)殼聚糖酶的活力高，制備方法簡單。
[0016]本發(fā)明中的發(fā)酵酶液，經簡單的離心過濾除菌后，即可直接作為酶催化劑使用，用于制備殼寡糖。
[0017](2)精純酶的制備步驟簡單高效。
[0018]本
【發(fā)明內容】
中精純酶的制備，僅涉及硫酸錢沉淀后再經一步Sephadex G-100柱層析純化后即可獲得電泳純的殼聚糖酶，相比以往文獻報道的，需要2步甚至是3步以上的柱層析純化工序來說，本發(fā)明中的精純酶制備方法簡單高效，生產成本低。
[0019](3)酶解高效，產物殼寡糖得率高。本發(fā)明涉及的是淡紫擬青霉來源殼聚糖酶，目前尚未見淡紫擬青霉來源殼聚糖酶的產業(yè)化報道，是一新型殼聚糖酶，酶解高效，適合工廠化生產。
【附圖說明】
[0020]圖1為實施例1中淡紫擬青霉殼聚糖酶活力測定的標準曲線。
[0021]圖2為實施例2中淡紫擬青霉殼聚糖酶的純度鑒定。
[0022]圖3為實施例2中SDS-PAGE確定淡紫擬青霉殼聚糖酶的分子量。
【具體實施方式】
[0023]以下結合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細描述，這些實施例用于理解而不是限制本發(fā)明的保護范圍。
[0024]實施例1:淡紫擬青霉殼聚糖酶的粗酶制備
[0025]從試管斜面保存菌種中挑取I環(huán)接種于活化培養(yǎng)基中，在28°C、200rpm下培養(yǎng)36h至菌體渾濁，制得活化種子液?；罨囵B(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氫鉀I，硫酸鎂
0.5,pH 7.0，5001111三角燒瓶中分裝501111活化培養(yǎng)基，121°(:滅菌201^11。采用如下發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):甘油 15，大豆蛋白胨 25，MnS04 I，粉末殼聚糖 15，NaCl 3,CaCl2 I, MgSO4 I, FeSO4
0.5。1L發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的裝液量為7L，經118 °C蒸汽滅菌20min后，按照0.8 % (v/v)的比例接入活化的菌種，控制發(fā)酵過程中的PH始終維持在pH6.5，調節(jié)培養(yǎng)溫度在32°C，溶解氧參數(shù)始終維持在10%以上，在發(fā)酵70h時發(fā)酵完畢并放罐收集發(fā)酵液。
[0026]發(fā)酵液經10000r/min離心5min，去除菌體后收集保留上清液，然后再經0.22um的微孔過濾膜過濾除菌，即為淡紫擬青霉YT08來源殼聚糖酶的液體粗酶，經DNS顯色法測定其殼聚糖酶活力為135.20U/mL。
[0027]在殼聚糖酶的液體粗酶中添加硫酸銨至80%的飽和度，在4°C下鹽析沉淀24h，然后再經10000r/min冷凍離心(5 °C ) 1min，收集沉淀的酶蛋白。濃縮沉淀的酶蛋白經透析脫鹽處理，并濃縮后進行冷凍干燥，即可獲得淡紫擬青霉殼聚糖酶固態(tài)制劑，經DNS顯色法測定其殼聚糖酶活力為1543.12U/g。
[0028]所述殼聚糖酶酶活的測定方法:發(fā)酵液經5000rpm離心1min得發(fā)酵上清液。取
0.2mL發(fā)酵上清液加水至lml