一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法，具體 是一種通過檢測血管特異表達綠色熒光的轉基因斑馬魚的尾靜脈網(wǎng)的相對面積來快速評 價外源性藥物或環(huán)境異物對斑馬魚血管生成的促進作用的方法，屬于藥物篩選領域。
【背景技術】
[0002] 血管生成與多種疾病相關。血管生成不僅存在于胚胎發(fā)育時期，在整個生命周期 均有重要的生理、病理意義。在成人，其涉及腫瘤、炎癥、缺血性疾病、糖尿病視網(wǎng)膜病、創(chuàng)傷 愈合等諸多病理過程而成為研究的重點。血管生成是連續(xù)、復雜的過程，是細胞-細胞（內(nèi)皮 細胞、周細胞、平滑肌細胞、纖維細胞)之間，細胞和細胞因子之間在不同時空協(xié)同作用的結 果。
[0003] 治療性血管生成的概念，最早由Hockel于1993年提出，與傳統(tǒng)的治療手段(血管搭 橋)不同，它是利用成血管誘導因子或內(nèi)皮祖細胞，模擬體內(nèi)血管生成的機制，達到促血管 新生，改善側支循環(huán)的目的，即通過刺激和誘導新生血管的形成來治療和預防以局部缺血 為特征的臨床各類疾病。實際上就是指以增加新生血管、改善血運為主要措施來治療臨床 上缺血性及其相關疾病的方法的總稱。現(xiàn)已經(jīng)廣泛應用于缺血性及其相關疾病:心臟缺血、 肢體缺血、皮瓣愈合、周圍神經(jīng)損傷、傷口愈合等。
[0004] 目前研究血管生成的動物模型主要有:大鼠模型、雞胚尿囊膜模型和斑馬魚模型。 研究表明，斑馬魚與人類在血管發(fā)育過程中的基因、信號通路具有高度同源性，其結構、生 理、分子水平等方面與人類都很接近，而且與大鼠、雞胚尿囊膜模型相比，斑馬魚具有成本 低、飼養(yǎng)條件要求低、個體小適合于高通量篩選、幼魚身體透明易于觀察血管發(fā)育的特點， 具有明顯的優(yōu)勢，因此，采用斑馬魚進行血管生成的研究具有凸顯的優(yōu)勢。
[0005] 在斑馬魚評價血管生成促進作用的實驗中，目前使用指標主要是節(jié)間血管、腸下 靜脈，利用節(jié)間血管或腸下靜脈的數(shù)量、長度、棘突數(shù)量等作為評價依據(jù)。但是在實際的實 驗過程中各自存在不足之處；1、利用節(jié)間血管作為指標的方法中，需要事先加入血管生成 抑制劑損傷節(jié)間血管，再觀察藥物的促進再生作用。受試藥物的作用體現(xiàn)受制于血管生成 抑制劑的作用，受試藥物逆轉的是采用的抑制劑的作用靶點和通路，篩選的范圍受抑制劑 選擇的局限。2、以腸下靜脈為指標的方法中，由于腸下靜脈本身為籃球網(wǎng)狀結構，對其拍照 非常困難，斑馬魚拍攝時的體位嚴重影響腸下靜脈的成像，進而影響結果的計算和統(tǒng)計。
[0006] 中國專利文獻CN101179935公開了一種缺血性視網(wǎng)膜組織的血管再生和為此目的 的篩選方法，該篩選方法使用小鼠為模型，以潛在治療劑向所述小鼠的眼給藥;使所述小鼠 安樂死并從給予所述推定治療劑的所述眼中取出基本上整個視網(wǎng)膜;對給予了所述推定治 療劑的所述眼的所述視網(wǎng)膜血管系統(tǒng)進行染色并制備顯微圖像，圖像顯示所述染色視網(wǎng)膜 中血管閉塞面積和視網(wǎng)膜前新生血管叢面積；同時做對照試驗，并將所述染色視網(wǎng)膜中的 視網(wǎng)膜前新血管叢面積與小鼠對照眼的染色視網(wǎng)膜中可觀察到的視網(wǎng)膜前血管叢面積進 行比較，該方法受試藥物的作用體現(xiàn)受制于血管生成抑制劑的作用，受試藥物逆轉的是采 用的抑制劑的作用靶點和通路，篩選的范圍受抑制劑選擇的局限，且步驟繁瑣。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成 促進作用的方法，該方法采用血管特異表達綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚，通過直接在斑 馬魚培養(yǎng)用水中加入待測藥物，檢測斑馬魚尾靜脈網(wǎng)的相對面積，成功地建立了一種快速、 定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進的方法，具有操作簡單、快速、穩(wěn)定可靠和重復性好 的優(yōu)點。
[0008] 術語說明：
[0009] 尾靜脈（tPCV)網(wǎng)面積：指的是斑馬魚軀干泄殖孔至尾尖區(qū)域的靜脈叢構成的面 積，特指血管轉基因斑馬魚的tPCV外圍輪廓范圍內(nèi)的面積，圖1中虛線圈定的范圍為尾靜脈 (tPCV)網(wǎng)面積。
[0010] 尾靜脈網(wǎng)對應的節(jié)間血管（ISV)區(qū)域面積：是指沿泄殖孔畫垂直后主動脈(DA)的 直線，直線尾尖側的部分中，以DA為界，腹側為tPCV網(wǎng)，背側為ISV區(qū)，圖1中實線圈定的范圍 為節(jié)間血管（ISV)區(qū)域面積。
[0011 ]hpf(hourspostfertilization):生物學專用術語，指受精后的時間，如24hpf指 受精后24小時的胚胎。
[0012] 本發(fā)明的技術方案如下：
[0013] -種快速、定量評價化合物對斑馬魚血管生成促進作用的方法，包括步驟如下：
[0014] (1)將受精后21~24h的發(fā)育正常斑馬魚胚胎移入培養(yǎng)孔中，對培養(yǎng)孔中的斑馬魚 胚胎連續(xù)給藥孵育，記為待測化合物組；同時在相同條件下以不給藥孵育設置對照，記為對 照組；
[0015] (2)麻醉孵育后對照組、待測化合物組的每條斑馬魚，采集每條斑馬魚的熒光顯微 圖像，記錄斑馬魚尾部血管熒光情況，測量每組斑馬魚的尾靜脈(tPCV)網(wǎng)面積以及尾靜脈 網(wǎng)對應的節(jié)間血管（ISV)區(qū)域面積，按照如下公式計算tPCV網(wǎng)相對面積：
[0016] tPCV網(wǎng)相對面積=tPCV網(wǎng)面積/對應的節(jié)間血管（ISV)區(qū)域面積；
[0017] ⑶定量分析
[0018] 計算得到的每組斑馬魚tPCV網(wǎng)相對面積以表示，分析比較對照組、待測化合 物組之間差異的顯著性；
[0019] 當待測化合物組斑馬魚的s大于對照組斑馬魚的g:±s，且達到統(tǒng)計學上的顯著 性水平(P〈0.05)，待測化合物組斑馬魚的節(jié)間血管（ISV)無缺失，說明待測藥物對斑馬魚的 血管生成具有促進作用。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述斑馬魚胚胎為血管熒光標記的轉基因斑馬魚胚胎。血管 熒光標記的轉基因斑馬魚胚胎可采用本領域普通市售產(chǎn)品，如血管熒光轉基因斑馬魚Tg (VEGFR2:GFP)，山東省科學院斑馬魚藥物篩選中心提供。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟（1)中，斑馬魚胚胎為21-24hpf的斑馬魚胚胎，最為優(yōu)選 的，斑馬魚胚胎為24hpf的斑馬魚胚胎。21-24hpf的斑馬魚胚胎魚尾部血管網(wǎng)尚未形成，為 最理想的給藥時間，48hpf的斑馬魚胚胎及以后觀察結果，斑馬魚48hpftPCV網(wǎng)的面積在經(jīng) 過數(shù)據(jù)處理之后，與藥物或環(huán)境異物對新生血管的促進作用具有一定相關性。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(1)中，所述的給藥方式為將斑馬魚胚胎不間斷浸泡在藥 液中，直至觀察結果。
[0023]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，待測化合物組、對照組每組斑馬魚胚胎總數(shù)不少于8枚，孵育 溫度為26~30°C，避光孵育，優(yōu)選的，孵育溫度為28°C，孵育時間為1天~1天23h。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中斑馬魚的麻醉為采用質量濃度為0.3%。的三卡因浸 泡40~90s進行麻醉。
[0025]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中采集圖像為將斑馬魚胚胎固定側面體位固定，在熒 光顯微鏡下觀察、拍照，獲得斑馬魚胚胎的側位圖像。
[0026]進一步優(yōu)選的，步驟(2)中，采集的圖像是在同一的放大倍數(shù)下獲得的，圖像格式 為jpg格式。
[0027]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，步驟(2)中測量面積為利用圖像處理軟件ImageJ對采集的圖 像進行測量，測量前先校準標尺，得到準確的面積。
[0028]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(3)中的定量分析，是在待測化合物組斑馬魚的節(jié)間 血管（ISV)無缺失條件下進行。
[0029]也就是說，本發(fā)明采用tPCV網(wǎng)的相對