一種基于光纖免疫傳感檢測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鄰苯二甲酸酯類化合物的檢測(cè)，具體涉及一種基于光纖免疫傳感檢測(cè) 鄰苯二甲酸酯類化合物濃度的方法，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 鄰苯二甲酸酯類化合物(phthalateesters，PAEs)又名酞酸酯，作為增塑劑被廣 泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和塑料制品中，可提高塑料制品的塑性和強(qiáng)度。PAEs-般為無色透明的 油狀粘稠液體，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇和乙醚等有機(jī)溶劑，屬于難揮發(fā)、中等極性、高 脂溶性物質(zhì)。在塑料制品中PAEs與塑料分子的相容性較好，二者間不能形成有效的化學(xué)鍵 合，而是通過氫鍵或范德華力連接，彼此保持各自獨(dú)立的化學(xué)性質(zhì)。PAEs是環(huán)境內(nèi)分泌干擾 物，進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生類雌激素作用，阻止與動(dòng)物生殖和發(fā)育有關(guān)的激素的合成、分泌、 貯存、運(yùn)輸、結(jié)合和清除等過程，干擾血液維持正常的激素水平，具有致癌性、致畸性和致突 變性。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)PAEs的主要方法有氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用(GC-MS)、高效液相色譜法(HLPC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。儀器分析方法的樣品前處理步 驟復(fù)雜、操作繁瑣，導(dǎo)致檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，無法滿足批量樣品的快速篩查和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的 實(shí)際要求。ELISA法存在重現(xiàn)性較低、穩(wěn)定性較差等問題，測(cè)定結(jié)果容易受外部環(huán)境和人為 因素的影響，并且不能用于現(xiàn)場(chǎng)快速分析。將熒光免疫分析與光纖傳感技術(shù)結(jié)合的光纖免 疫傳感技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、易于儀器化和可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)等特點(diǎn)，能夠彌補(bǔ)ELISA法的不足。
[0005] 現(xiàn)有免疫分析方法的線性范圍較窄、靈敏度較低，制備的抗體只能檢測(cè)單一PAEs， 不能滿足同時(shí)檢測(cè)多種PAEs的實(shí)際需要。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于光纖免疫傳感檢 測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物濃度的方法，本方法可以同時(shí)檢測(cè)多種PAEs，即能夠得到試樣中 所有PAEs的總濃度，且具有較高的靈敏度和精密度，樣品僅需簡(jiǎn)單提取，檢測(cè)快速。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下： 一種基于光纖免疫傳感檢測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物濃度的方法，步驟如下， 1)光纖免疫傳感檢測(cè)系統(tǒng)的構(gòu)建； 光纖免疫傳感檢測(cè)系統(tǒng)包括激光發(fā)射裝置、用于光路傳遞的非對(duì)稱光纖耦合器、光纖 探頭、樣品池、焚光濾光片、光電二極管、鎖相放大器和計(jì)算機(jī)，非對(duì)稱光纖親合器由單模光 纖和多模光纖構(gòu)成;非對(duì)稱光纖耦合器的多模光纖一端通過光纖連接器接光纖探頭，多模 光纖另一端朝向熒光濾光片;光纖探頭置于樣品池中，光纖探頭表面附著有包被原； 2) 光纖免疫傳感檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的建立； 2.1) 將600yL濃度為0.5yg.1111/1的熒光標(biāo)記抗體溶液與600yL某已知濃度的鄰苯 二甲酸酯類化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，其中抗體為可與多種鄰苯二甲酸酯類化合物特異性結(jié)合 的廣譜性抗體，預(yù)反應(yīng)5min;再用懦動(dòng)栗將該混合液以0.3mL?π?ΓΓ1的速度輸入到樣品 池，持續(xù)2min，繼續(xù)反應(yīng)6min，使得光纖探頭表面抗原與焚光標(biāo)記抗體結(jié)合；啟動(dòng)激光發(fā) 射裝置，發(fā)出的激光依次通過非對(duì)稱光纖耦合器的單模光纖和多模光纖、光纖連接器，進(jìn)入 光纖探頭，在光纖探頭表面產(chǎn)生倏逝波，倏逝波激發(fā)探頭表面的熒光物質(zhì)產(chǎn)生熒光;部分熒 光耦合回光纖探頭，經(jīng)光纖連接器進(jìn)入非對(duì)稱光纖耦合器的多模光纖，并從多模光纖的另 一端射出；射出的熒光經(jīng)熒光濾光片濾除反射的激發(fā)光后，絕大部分熒光透過，透過的熒光 經(jīng)雪崩光電二極管探測(cè)并將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，電信號(hào)經(jīng)鎖相放大器放大后，由計(jì)算機(jī) 采集并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，從而得到與已知濃度的該鄰苯二甲酸酯類化合物對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)； 2.2) 改變鄰苯二甲酸酯類化合物濃度，重復(fù)步驟2.1)，得到不同已知濃度下的該鄰苯 二甲酸酯類化合物對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)； 2.3) 以該鄰苯二甲酸酯類化合物的濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 抑制曲線;抑制率指該鄰苯二甲酸酯類化合物抑制時(shí)的響應(yīng)信號(hào)值與無抑制時(shí)的響應(yīng)信號(hào) 值之比；無抑制時(shí)的響應(yīng)信號(hào)值即步驟2.1)中鄰苯二甲酸酯類化合物的濃度為0時(shí)的響應(yīng) 信號(hào)值； 3) 待測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物濃度的檢測(cè)； 3.1) 將已知濃度的鄰苯二甲酸酯類化合物替換為待測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物，然后重 復(fù)步驟2.1 )，得到待測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)，計(jì)算獲得抑制率； 3.2) 根據(jù)光纖免疫傳感檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線上橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，找到與待測(cè) 鄰苯二甲酸酯類化合物抑制率對(duì)應(yīng)的濃度對(duì)數(shù)值，即可獲得待測(cè)鄰苯二甲酸酯類化合物的 濃度。
[0009] 所述激光發(fā)射裝置的光源波長(zhǎng)為650nm、輸出功率為8mW;光纖探頭與非對(duì)稱光 纖耦合器的多模光纖為同種光纖;激光發(fā)射裝置為脈沖激光發(fā)射裝置，其脈沖信號(hào)由脈沖 信號(hào)發(fā)生器提供，該脈沖信號(hào)同時(shí)為鎖相放大器提供相同頻率的參考信號(hào)。
[0010] 所述光纖探頭按如下方法制作得到， 1.1) 去除多模石英光纖一端的涂覆層，將去除涂覆層的裸露光纖放入質(zhì)量濃度為30% 的HF溶液中腐蝕適當(dāng)時(shí)間，以得到所需錐角度的組合型探頭，錐型部分的長(zhǎng)度約為0.5cm， 錐角度為45°; 1.2) 將步驟1.1)得到的組合型探頭浸入濃H2S〇4:H2〇2體積比為3:1的Piranha溶液中 0.5h后，放入超聲波清洗儀中清洗，再用超純水充分清洗，直至清洗液的pH為中性，最后在 室溫下用氮?dú)獯蹈?，保存于真空干燥箱中備用?1.3 )將1.2 )清洗干燥的探頭放入質(zhì)量濃度為2%的3-巰基丙基三甲氧基硅烷溶液(MTS， 溶于甲苯）中反應(yīng)2h，用甲苯清洗3次;然后將探頭置于濃度為0.02mol?I/1的N-琥珀酰亞 胺基-4-馬來酰亞胺-丁酸酯溶液(GMBS，溶于乙醇）中反應(yīng)1h，用乙醇沖洗3次;再用pH為 7.4、濃度為0.01mol·I/1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗干凈；將硅烷化后的探頭放入0.05 mg·ml/1的包被原中反應(yīng)2h，用磷酸鹽緩沖溶液沖洗后，再放入2mg·ml/1牛血清蛋白 (BSA)溶液中20min，以封閉非特異性吸附位點(diǎn)，得到表面附著有包被原的光纖探頭，最后 在4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0011] 在按步驟2.1)進(jìn)行光纖探頭響應(yīng)檢測(cè)時(shí)，所述光纖探頭檢測(cè)一次后進(jìn)行再生處 理，以用于下次檢測(cè)；再生處理過程為:將0.25yg·ml/1的熒光標(biāo)記抗體以0.3mL.mirT1 流速輸入樣品池，反應(yīng)6min;再用濃度為2mg.1111/1的胃蛋白酶溶液(pH1.9)以0.3mL· mirT1流速輸入樣品池，沖洗4min;再用體積比50:50:1的乙腈、超純水和丙酸混合液沖洗30 s，最后用磷酸鹽緩沖溶液沖洗2min; 重復(fù)上述過程一次，再生后的光纖探頭即可用于下次檢測(cè)。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)光波在光纖內(nèi)以全反射方式傳輸時(shí)，在光纖免疫傳感探頭接觸的介質(zhì) 中產(chǎn)生倏逝波，激發(fā)探頭表面標(biāo)記在抗體或抗原分子上的熒光物質(zhì)，結(jié)合免疫反應(yīng)原理，可 實(shí)現(xiàn)待測(cè)物質(zhì)的定量檢測(cè)。本發(fā)明利用可與多種PAEs特異性結(jié)合的廣譜性抗體，建立光纖 免疫傳感檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中PAEs的快速靈敏檢測(cè)。
[0013]本發(fā)明在最佳的免疫傳感檢測(cè)條件下，獲得鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)的半數(shù)抑制 濃度（IC5〇)為9.54ng.mL-S檢出限為0.147ng.mL-S線性范圍為0.22~145ng.mL-、抗 體對(duì)鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DnOP)、鄰苯 二甲酸丁基芐基酯（BBP)、鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯 (DCHP)和鄰苯二甲酸二壬酯（DNP)具有較高的交叉反應(yīng)率（16.63%~71.94%)，抗體對(duì)7種 PAEs具有較寬的識(shí)別范圍，滿足同時(shí)檢測(cè)多種PAEs的要求。本發(fā)明光纖免疫傳感檢測(cè)方法 的平均加標(biāo)回收率為61.5%~106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)〈 13.41%;GC-MS法（國(guó)標(biāo)方法）的 平均加標(biāo)回收率為66.1 %~104.5%，RSD〈 11.63%，兩種方法取得了一致的結(jié)果。由此可見， 本發(fā)明光纖免疫傳感檢測(cè)技術(shù)具有較高的靈敏度和精密度，且樣品僅需簡(jiǎn)單提取，在15 min內(nèi)完成測(cè)試，本方法已成功應(yīng)用于設(shè)施菜地土壤中PAEs的檢測(cè)。
[0014]
【附圖說明】
[0015]圖1-本發(fā)明光纖免疫傳