一種獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚的方法。針對現(xiàn)有斑馬魚品系的綠色熒光蛋白不能在整個原腎小球、小管和導(dǎo)管中同時、均勻表達的缺陷，本發(fā)明提供了一種獲得綠色熒光蛋白在原腎小球、原腎小管和原腎導(dǎo)管中同時表達的斑馬魚的方法。本方法是以Na,K-ATPase?alpha1A4:GFP品系斑馬魚與wt1b:GFP品系斑馬魚互為親本的雜交育種方法。本發(fā)明方法依照雜交親本選育、配組繁殖、雜交性狀篩選、雜交子代培育、雜交性狀固定與保留幾個步驟加以實施。本發(fā)明方法是一種分離元件雜交穩(wěn)定整合的方法，實施過程簡單易控，能夠獲得綠色熒光蛋白在原腎小球、原腎小管與原腎導(dǎo)管中同時且均勻高效表達的斑馬魚品系，產(chǎn)品可以滿足對斑馬魚原腎功能研究的整體性與完整性要求。
【專利說明】—種獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種斑馬魚育種方法，特別是涉及一種獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚的育種方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]1962年，Shimomura等首次在維多利亞多管水母(Aequoria victoria)中發(fā)現(xiàn)了生物發(fā)光蛋白質(zhì)即水母蛋白(aequorin)，并觀察到一種在紫外線照射下發(fā)淺綠色熒光的副產(chǎn)物-綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)。1974 年，Shimomura 等完成了GFP純化，18年后Prasher等克隆出其基因，之后1994年Chalfie等在大腸桿菌細胞和秀麗隱桿線蟲中實現(xiàn)了 GFP的表達。GFP作為一種重要的生物標(biāo)記蛋白，能夠自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并在紫外或藍光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光。由于GFP具備熒光穩(wěn)定、安全無毒害、易于檢測和易于得到突變體等眾多優(yōu)勢，從而被廣泛應(yīng)用于細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和微生物等研究領(lǐng)域。
[0003]斑馬魚原腎的發(fā)育與人類基本一致，其腎單位或腎小球的細胞組成極其相似，且具有結(jié)構(gòu)簡單的優(yōu)勢，因此研究者經(jīng)常將斑馬魚作為理想的模式生物來研究人類腎臟發(fā)育與功能。斑馬魚的原腎由2個腎單位組成，2個腎小管分別將位于兩側(cè)的前腎導(dǎo)管和融合在一起的腎小球相連，前腎導(dǎo)管在尾部匯合連通至泄殖腔。受精后2~3天，斑馬魚胚胎中已具有能夠完成滲透調(diào)節(jié)功能的原腎結(jié)構(gòu)。為了更好地研究斑馬魚腎臟發(fā)育過程，研制GFP腎臟特異性表達的斑馬魚品系具有重要意義。2007年，Yan Liu等人制作出Na，K-ATPasealphalA4:GFP轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚，實現(xiàn)了 GFP在斑馬魚原腎小管和原腎導(dǎo)管中的特異性表達，但是在該品系斑馬魚的原腎小球中并沒有特異綠色熒光表達。同年，Perner等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研制出wtlb:GFP品系斑馬魚。在該轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系受精后35h，能夠觀察到其原腎小球和近端部分的原腎導(dǎo)管中發(fā)出`綠色熒光，但是在遠端導(dǎo)管不能觀察到特異的GFP表達。將上述兩種品系斑馬魚用于原腎研究時，GFP不能在整個原腎小球、小管和導(dǎo)管中同時均勻地表達，從而影響了斑馬魚原腎功能研究的整體性和完整性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種獲得綠色熒光蛋白在原腎小球、原腎小管和原腎導(dǎo)管中同時表達的斑馬魚的方法。
[0005]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
[0006]一種獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚的方法，其特征在于:是以Na，K-ATPasealphalA4:GFP品系斑馬魚與wtlb:GFP品系斑馬魚互為親本的雜交育種方法。
[0007]Na, K-ATPase alphalA4:GFP品系斑馬魚是一種經(jīng)由人工培育得到的前腎小管和前腎導(dǎo)管中呈現(xiàn)出綠色熒光蛋白特異性表達的斑馬魚品系，wtlb:GFP品系斑馬魚是一種經(jīng)由人工培育得到的前腎小球、前腎小管中有部分綠色熒光蛋白表達的斑馬魚品系。本技術(shù)方案是利用Na，K-ATPase alphalA4啟動子和wtlb啟動子組織特異性表達互補，通過分離元件雜交穩(wěn)定整合，將其不同的綠色熒光蛋白表達性狀加以集中整合，從而獲得具有新性狀特征的斑馬魚品系。所獲得的斑馬魚品系在原腎小球、原腎小管與原腎導(dǎo)管中同時具備綠色熒光蛋白表達性狀。
[0008]根據(jù)常規(guī)的雜交育種操作方法，本發(fā)明方法依照雜交親本選育、配組繁殖、雜交性狀篩選、雜交子代培育、雜交性狀固定與保留幾個步驟加以實施。在親本選育中，挑選已達性成熟且具有良好綠色熒光蛋白表達性狀的親本斑馬魚，加以人工飼養(yǎng)作為親本雌雄魚。在配組繁殖中，采用常規(guī)配組繁殖方法獲得斑馬魚受精卵。在雜交性狀篩選中，于熒光顯微鏡下觀察受精卵綠色熒光蛋白基因的表達情況，挑選出前腎小球、小管和導(dǎo)管中均有熒光顯示的斑馬魚胚胎，采取進一步的雜交子代培育。在雜交子代培育中，采用人工飼養(yǎng)方法獲得雜交子一代F1。在雜交性狀固定與保留中，通過雜交子代自交獲得穩(wěn)定遺傳的全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚，再將其與普通斑馬魚測交，篩出100%全腎表達綠色熒光蛋白胚胎對應(yīng)的親本斑馬魚作為雙整合純系留種保存。
[0009]上述技術(shù)方案可以采取優(yōu)化的人工繁殖手段，對雜交親本選育、配組繁殖、雜交子代培育等步驟加以優(yōu)化，以獲得綠色熒光蛋白均勻高效地在全腎中特異性表達的斑馬魚品系。具體包括:
[0010]雜交親本選育:將斑馬魚在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，光周期為白晝14h、黑暗10h，水溫26V~29°C ;每日投喂活體豐年蟲或蝦片3次，投食5min后清理與魚糞、雜物及過量食物。飼養(yǎng)一定時間后作為親本雌雄魚。
[0011]配組繁殖:獲得斑馬魚受精卵方法是:數(shù)量2:1的親本雌雄魚放入交配盒中隔離培養(yǎng)，交配盒置于26 °C~29 °C恒溫環(huán)境中進行黑暗過夜培養(yǎng)，光周期為白晝14h、黑暗IOh ;培養(yǎng)結(jié)束，混合雌雄親魚，將底部有柵欄的內(nèi)層交配盒傾斜放置在外層交配盒上并置于26°C~29°C恒溫水浴中，待親魚產(chǎn)卵；親魚產(chǎn)卵25min~35min后，取出親魚，挑選收集交配盒底部的受精卵。
[0012]雜交性狀篩選:受精卵在26°C~29°C恒溫曝氣水中培育24h~28h后檢測綠色熒光蛋白斑基因的表達效果，挑選前腎小球、小管和導(dǎo)管中均有熒光的斑馬魚胚胎進行雜交子代培育。
[0013]雜交子代培育:受精后第Id~4d:所述斑馬魚胚胎在26°C~29°C環(huán)境恒溫培育，獲得幼魚；受精后第5d~9d:幼魚喂食卵黃水，每日喂食2次；受精后第IOd~16d:幼魚混合喂食豐年蟲與濾網(wǎng)研磨的卵黃水，具體方法是先向幼魚飼養(yǎng)容器中投入少量豐年蟲，25min~35min后再加入濾網(wǎng)研磨的卵黃水，每日喂食至少2次；受精后第17d以后:幼魚喂食豐年蟲，每日喂食2次，每日更換一半養(yǎng)魚水。培養(yǎng)至受精后3個月獲得雜交子一代Fl。
[0014]雜交性狀固定與保留:雜交子一代Fl經(jīng)自交傳代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚，自交傳代培養(yǎng)時采用與雜交子代培育相同的培育飼養(yǎng)方法獲得自代子代；自交子三代斑馬魚與普通斑馬魚測交，篩選出100%全腎表達綠色熒光蛋白胚胎對應(yīng)的親本斑馬魚作為雙整合純系留種保存。
[0015]本發(fā)明是一種分離元件雜交穩(wěn)定整合的方法，其技術(shù)效果與傳統(tǒng)雜種優(yōu)勢有所區(qū)另IJ。傳統(tǒng)雜交優(yōu)勢常指兩種遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動物進行雜交后，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親。本發(fā)明方法則是將啟動子組織特異性表達加以互補，通過分離元件雜交穩(wěn)定整合，獲得組織特異性同時表達的子代。這種方法同樣可以適用于其他多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚轉(zhuǎn)基因性狀的集中與整合。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:(I)方法實施過程簡單易控；(2)方法能夠獲得綠色熒光蛋白在原腎小球、原腎小管與原腎導(dǎo)管中同時且均勻高效表達的斑馬魚品系；(3)所得斑馬魚品系用于斑馬魚原腎功能的研究，利用綠色熒光蛋白在活體魚中的表達可以隨時觀察在任何時期的原腎綠色熒光蛋白表達特征，可以滿足對斑馬魚原腎功能研究的整體性與完整性要求。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是親本Na，K-ATPase alphalA4:GFP品系斑馬魚在受精后48小時熒光圖片。
[0018]圖2是親本wtlb:GFP品系斑馬魚在受精后48小時熒光圖片。
[0019]圖3是本發(fā)明獲得的雜交子代斑馬魚在受精后48小時熒光圖片。
[0020]圖4是本發(fā)明獲得的雜交子代斑馬魚在受精后48小時白光場圖片。
[0021]圖5是ApexIMorph0Iin0(MO)注射后對斑馬魚原腎的發(fā)育影響熒光圖片。(上斑馬魚是對照MO注射，下斑馬魚是ApexlMO注射)
[0022]圖6是ApexlMorpholino (MO)注射后對斑馬魚原腎的發(fā)育影響白光場圖片。(上斑馬魚是對照MO注射，下斑馬魚是ApexlMO注射)
【具體實施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例作進一步的描述。
[0024]實施例一
[0025]如圖1~圖4所示，采用本發(fā)明方法獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚。
[0026]1、雜交親本選育
[0027]選用Na，K-ATPase alphalA4: GFP品系斑馬魚與wtlb: GFP品系斑馬魚作為雜交用親魚。作為親本的斑馬魚在胚胎期或幼魚期已經(jīng)過突光篩選，保證Na, K-ATPasealphalA4:GFP品系親魚的腎小管與前腎導(dǎo)管中呈現(xiàn)出綠色熒光蛋白的特異性表達，wtlbiGFP品系親魚前腎小球、前腎小管中有部分綠色熒光蛋白的表達。圖1是親本Na, K-ATPase alphalA4:GFP品系斑馬魚在受精后48小時熒光圖片；圖2是親本wtlb:GFP品系斑馬魚在受精后48小時滅光圖片。
[0028]選擇Na, K-ATPase alphalA4:GFP品系斑馬魚雄、雌性各10條、wtlb:GFP品系斑馬魚雌、雄性各10條作為親魚。親魚均已達性成熟，且應(yīng)該具備成魚體形正常、體色發(fā)亮、魚鱗和魚鰭沒有破損、游動靈活捕食敏捷、沒有異常行為等良好特征。
[0029]將選擇好的40條親魚飼養(yǎng)于循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，保證光周期為:白晝14h、黑暗IOh ;水溫26°C~29°C;每日投喂活體豐年蟲或蝦片3次，投食5min~IOmin后將未吃完的食物及魚糞等雜物及時清理吸出 。
[0030]2、配組繁殖
[0031 ] 分兩組進行繁殖:第一組中，Na，K-ATPase alphalA4: GFP斑馬魚作為父本，wtlb:GFP品系斑馬魚作為母本；第二組中，Na, K-ATPase alphalA4:GFP斑馬魚作為母本，wtlb:GFP品系斑馬魚作為父本。
[0032] 在產(chǎn)卵前夜，分別在兩組中選擇2條雌魚與I條雄魚(雌雄魚比例2:1)放入交配盒中，插入透明擋板，使得雌雄魚分別位于擋板兩側(cè)。之后將交配盒置于26°C~29°C恒溫環(huán)境中進行黑暗過夜飼養(yǎng)，光周期為白晝14h，黑暗10h。
[0033]培養(yǎng)結(jié)束，于次日上午取出透明擋板，將底部有柵欄的內(nèi)層交配盒傾斜放置在外層交配盒上并置于26°C~29°C恒溫水浴中，保持周圍環(huán)境安靜，讓雌雄魚進行自行追逐產(chǎn)卵。魚卵經(jīng)過內(nèi)層交配盒的柵欄掉入外層交配盒底部。
[0034]追逐過程進行30min左右，將親魚取出，挑選收集交配盒底部的受精卵，并將其置于放有干凈曝氣水的培養(yǎng)皿中于26°C~29°C恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)；早、晚各換水一次，并將死去的胚胎及時清除。
[0035]3、雜交性狀篩選
[0036]受精卵在26°C~29°C恒溫曝氣水中培育24h后使用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白斑基因的表達效果；挑選前腎小球、小管和導(dǎo)管中均有熒光的斑馬魚胚胎進行雜交子代培育。將沒有熒光或者已死去的胚胎從培養(yǎng)皿中去除。
[0037]4、雜交子代培育
[0038]將雜交性狀篩選獲得的理想胚胎進行正常培育，具體步驟如下:
[0039]受精后第Id~4d:
[0040]將死去的胚胎或幼魚剔除并更換干凈曝氣水，新鮮水的溫度應(yīng)與原水一致，確保斑馬魚胚胎在26°C~29°C恒定水溫的穩(wěn)定環(huán)境中進行培育直至獲得幼魚。
[0041]受精后第5d~9d:
[0042]此時期幼魚能夠在水中游`動并開口，可開始喂食卵黃水。卵黃水是將煮熟的雞蛋剝殼取出卵黃，研磨后過細目濾網(wǎng)(0.2mm孔徑)加水制成。用膠頭滴管吸取適量滴入幼魚飼養(yǎng)容器中，每日喂食2次。喂食卵黃水后，幼魚生存的水質(zhì)容易變化，因此每日至少換水一次,并清理容器底部多余卵黃。
[0043]受精后第IOd~16d:
[0044]從受精后第IOd起開始混合投喂豐年蟲和卵黃水。投食時，先喂少量豐年蟲，等候30min左右再喂少量卵黃水，確保所有幼魚均能進食。每日喂食至少2次。每日換水I~3次，每次更換一半飼養(yǎng)水。
[0045]受精后第17d以后
[0046]從受精后第17d，可以只喂食豐年蟲，每日2次。每日更換一半飼養(yǎng)水。
[0047]幼魚能夠成功進食豐年蟲，且身體成長迅速、抵抗力增強，可將其移入循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，與成魚一起飼養(yǎng)。
[0048]5、雜交性狀固定與保留
[0049]雜交子代培育至受精后3月齡后，采用自交傳代培養(yǎng)固定雜交性狀，獲得穩(wěn)定遺傳的雜交子代。采用自交傳代培養(yǎng)中采用與前述雜交子代培育方法一致的方法獲得子代。圖3為本發(fā)明獲得的雜交子代斑馬魚在受精后48小時熒光圖片；圖4為本發(fā)明獲得的雜交子代斑馬魚在受精后48小時白光場圖片。
[0050]自交3代及以后，將穩(wěn)定遺傳的全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚與普通斑馬魚測交，篩選出100%全腎表達綠色熒光蛋白胚胎對應(yīng)的親本斑馬魚作為雙整合純系留種保存。
[0051]實施例二
[0052]采用本發(fā)明方法獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚。其與實施例一相同之處不再重復(fù)，其不同之處在于:
[0053]3、雜交性狀篩選
[0054]受精卵在26°C~29°C恒溫曝氣水中培育28h后使用熒光顯微鏡檢測綠色熒光蛋白斑基因的表達效果；挑選前腎小球、小管和導(dǎo)管中均有熒光的斑馬魚胚胎進行雜交子代培育。將沒有熒光或者已死去的胚胎從培養(yǎng)皿中去除。
[0055]實施例三
[0056]采用本發(fā)明方法獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚。其與實施例一相同之處不再重復(fù)，其不同之處在于:各階段培養(yǎng)水溫條件26°C~29°C調(diào)整為28.5°C。
[0057]實施例四
[0058]采用本發(fā)明方法獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚。其與實施例二相同之處不再重復(fù)，其不同之處在于:各階段培養(yǎng)水溫條件26°C~29°C調(diào)整為28.5°C。
[0059]試驗例一
[0060]如圖5、圖6所示，本發(fā)明方法獲得的全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚胚胎應(yīng)用于腎臟基因功能研究試驗。
[0061]利用實施例四繁殖獲得的利用全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚胚胎(受精后3d)為材料，開展影響腎臟發(fā)育的相關(guān)基因功能研究。圖5、圖6是ApexlMorpholino (MO)注射后對斑馬魚原腎發(fā)育產(chǎn)生畸形的圖片。圖5、圖6顯示對照組斑馬魚原腎發(fā)育正常，Apexl敲低組腎管變短且畸形，這表明Apex l基因?qū)δI臟的發(fā)育具有重要作用。
【權(quán)利要求】
1.一種獲得全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚的方法，其特征在于:是以Na，K-ATPasealphalA4:GFP品系斑馬魚與wtlb:GFP品系斑馬魚互為親本的雜交育種方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在受精卵在26°C~29°C恒溫曝氣水中培育24h~28h后檢測綠色熒光蛋白基因的表達效果，挑選前腎小球、小管和導(dǎo)管中均有熒光的斑馬魚胚胎進行雜交子代培育。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:受精卵在26°C~29°C恒溫曝氣水中培育24h后檢測綠色熒光蛋白基因的表達效果。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述雜交子代培育方法是: 受精后第Id~4d:所述斑馬魚胚胎在26°C~29°C環(huán)境恒溫培育，獲得幼魚， 受精后第5d~9d:幼魚喂食卵黃水，每日喂食2次， 受精后第IOd~16d:幼魚混合喂食豐年蟲與卵黃水，具體方法是先向幼魚飼養(yǎng)容器中投入少量豐年蟲，25min~35min后再加入濾網(wǎng)研磨的卵黃水，每日喂食至少2次， 受精后第17d以后:幼魚喂食豐年蟲，每日喂食2次，每日更換一半飼養(yǎng)水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)水溫條件是28°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:雜交子代培育獲得的雜交子代斑馬魚經(jīng)自交傳代培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述穩(wěn)定遺傳的全腎表達綠色熒光蛋白斑馬魚與普通斑馬魚測交，篩選出100%全腎`表達綠色熒光蛋白胚胎對應(yīng)的親本斑馬魚作為雙整合純系留種保存。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:受精卵獲取方法是: 數(shù)量2:1的親本雌雄魚放入交配盒中隔離培養(yǎng)，交配盒置于26°C~29°C恒溫環(huán)境中進行黑暗過夜培養(yǎng)，光周期為白晝14h、黑暗10h， 培養(yǎng)結(jié)束混合雌雄親魚，將底部有柵欄的內(nèi)層交配盒傾斜放置在外層交配盒上并置于26°C~29°C恒溫水浴中，待親魚產(chǎn)卵， 親魚產(chǎn)卵25min~35min后，取出親魚，挑選收集交配盒底部的受精卵。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:作為親本的斑馬魚在循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中飼養(yǎng)，光周期為白晝14h、黑暗10h，水溫26 V~29°C ;每日投喂活體豐年蟲或蝦片3次，投食5min后清理魚糞、雜物及過量食物。
10.權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)水溫條件是28°C。
【文檔編號】A01K67/027GK103493768SQ201310481487
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月15日
【發(fā)明者】裴得勝, 戴玉潔, 馬彥博, 邊萬平, 李勤凱, 陳艷玲 申請人:重慶綠色智能技術(shù)研究院