一種同時(shí)檢測(cè)血液樣品中多種脂溶性維生素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于維生素的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)血液樣品中多種脂溶性維 生素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 維生素是生物生長和代謝所必需的微量營養(yǎng)物質(zhì)，分為脂溶性和水溶性維生素兩 類，缺乏時(shí)生物不能正常生長，并導(dǎo)致維生素缺乏癥的發(fā)生。維生素 A、25 (OH) D2、25 (OH) D3、 E、K1、K2均屬于脂溶性維生素，人體缺乏該六種維生素時(shí)會(huì)表現(xiàn)出不同的癥狀：維生素 A缺 乏會(huì)導(dǎo)致夜盲癥、眼部炎癥等；維生素 D缺乏會(huì)導(dǎo)致兒童佝僂病、成人骨質(zhì)軟化病、老人骨 質(zhì)疏松癥等；維生素 E缺乏會(huì)導(dǎo)致新生兒溶血性貧血、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等；維生素 K缺乏會(huì)導(dǎo) 致凝血功能障礙、血液凝固時(shí)間延長和出血等。
[0003] 在國外，維生素是最主要的營養(yǎng)保健品，維生素對(duì)維持人體健康的作用有充分的 科學(xué)依據(jù)，深入人心。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，維生素在美國保健品市場(chǎng)占有主要份額。隨著國際維生素 市場(chǎng)對(duì)中國乃至亞洲市場(chǎng)的不斷沖擊，以及國內(nèi)科研單位和企業(yè)在維生素行業(yè)取得的科研 成果和技術(shù)突破，我國公民自身的保健意識(shí)不斷增強(qiáng)。但是，由于缺乏科學(xué)的指導(dǎo)，維生素 產(chǎn)品的使用現(xiàn)狀很混亂，一些人群為了提高身體各項(xiàng)技能，不惜花重金在保健品上，盲目補(bǔ) 充維生素，補(bǔ)充過量對(duì)身體也是一種傷害。如何了解人體是否需要補(bǔ)充所必需的四類脂溶 性維生素，只有通過檢測(cè)體內(nèi)各種維生素的真實(shí)狀態(tài)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果有針對(duì)性的調(diào)整需要 的維生素，檢測(cè)是科學(xué)評(píng)估和個(gè)性化使用維生素唯一的依據(jù)。
[0004] 目前，常用的維生素檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)免疫發(fā)光法、高效液 相色譜法（HPLC)和超高效液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS/MS)等。免疫法檢測(cè)時(shí)所用的抗體， 也可識(shí)別其它維生素衍生物，且抗體抗原反應(yīng)通常不足100%，因此結(jié)果差異較大，特異性 較差，應(yīng)用于臨床檢測(cè)可靠性不高，尤其是對(duì)于檢測(cè)含量較低的維生素。液相色譜法由于檢 出限有限，主要用于維生素含量較高的樣品測(cè)定，一般只能進(jìn)行單組份或含量較高的幾個(gè) 組分的同時(shí)測(cè)定。目前的液相色譜-質(zhì)譜法只能對(duì)一種或兩種維生素做定性分析，由于血 漿/血清成分復(fù)雜，且維生素含量較低，在進(jìn)行定量分析時(shí)，雜質(zhì)嚴(yán)重影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確 性，所以為了降低檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，使用者都是對(duì)不同的維生素逐個(gè)檢測(cè)分析，這樣存在 以下的缺點(diǎn)：檢測(cè)成本較高，而且操作復(fù)雜，耗費(fèi)的時(shí)間較長，檢測(cè)需要的血量較多。目前還 沒有一種能夠同時(shí)檢測(cè)血清/血漿中多種脂溶性維生素的有效方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種同時(shí)檢測(cè)血液樣品中多種脂溶性 維生素的方法。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種同時(shí)檢測(cè)血液樣品中多種脂溶性維生素的方法，采用LC-MS方法。
[0008] 優(yōu)選所述血液樣品是血漿或血清，更優(yōu)選為血清。
[0009] 優(yōu)選所述的多種脂溶性維生素為維生素4、25(0!1)02、25(0!1)034、1(1或1(2中的任 意兩種或兩種以上。
[0010] 更優(yōu)選所述的多種脂溶性維生素為維生素4、25(0!1)02、25(0!1)034、1(1和1(2。
[0011] 本發(fā)明中LC-MS的條件為：
[0012] 色譜條件：流動(dòng)相為A :甲醇，B :含甲酸的水；梯度洗脫。
[0013] 質(zhì)譜條件：正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)。
[0014] 優(yōu)選色譜條件：色譜柱：C18 柱（Kinetex C18 50 X 2. 1mm，2. 6 μ m，phenomenex)， 柱溫：45°C ;流動(dòng)相A:甲醇，流動(dòng)相B :體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸的水；梯度洗脫條件（如表1): 0 ~2min，60% A，2 ~3min，75% A，3 ~3. 5min，98% Α，3· 5 ~4. 0min，98% A，4 ~4. 8min， 60% A，流速(λ 5mL/min，進(jìn)樣量，20 yL。
[0015] 表1梯度洗脫條件
[0016]
[0017] 優(yōu)選質(zhì)譜條件：采用正離子電噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，霧化氣： 60kPa，加熱氣：50kPa，氣簾氣：20kPa，噴霧電壓：5000V，去溶劑溫度：550°C。
[0018] MRM質(zhì)譜參數(shù)如表2 :
[0019] 表2 MRM質(zhì)譜參數(shù)
[0020]
[0021] 同時(shí)檢測(cè)血清中六種脂溶性維生素的方法，步驟如下：
[0022] (1)樣品處理：向血清樣本中加入無水乙醇，再加入正己烷，震蕩后離心，取正己 烷層至樣品瓶中，吹干，將樣品復(fù)溶于70 % v/v甲醇水溶液中，0. 2 μ m濾膜過濾，獲得待測(cè) 樣本；所述的血清、無水乙醇、正己烷體積比為1:2:5或1:1. 5:5，血清與70 %甲醇水溶液的 體積比為2:1 ;
[0023] (2)標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：以甲醇配制100 μ g/mL各維生素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，然后用 5%m/v BSA(牛血清白蛋白）甲醇溶液制備6個(gè)梯度（維生素 A:50、100、200、400、800、 1600ng/mL ;維生素 25(0H)D2、25(0H)D3 :2. 5、10、20、50、100、200ng/mL ;維生素 E :1、5、10、 15、20、25以8/1^;維生素1(1、1(2:0.05、0.1、0.5、1、2、41^/1^)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分裝于1.51^ 棕色瓶中，-20 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0024] (3)LC-MS檢測(cè)：將待測(cè)樣本通過梯度洗脫模式進(jìn)入色譜柱分離后，采用正離子電 噴霧離子化的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，對(duì)待測(cè)物質(zhì)進(jìn)行定性與定量檢測(cè)；
[0025] 所述脂溶性維生素為：維生素4、25(0!1)02、25(0!1)03』、1(1和1(2。
[0026] -種同時(shí)檢測(cè)血液樣品中多種脂溶性維生素試劑盒，具有6個(gè)梯度（維生素 A : 50、100、200、400、800、1600ng/mL ;維生素 25(0H)D2、25(0H)D3 :2. 5、10、20、50、100、200ng/ mL ;維生素 E :l、5、10、15、20、25yg/mL ;維生素 K1、K2 :0· 05、0· 1、0· 5、l、2、4ng/mL)的混合 標(biāo)準(zhǔn)溶液，無水乙醇，正己烷，70%甲醇水溶液，甲醇，體積分?jǐn)?shù)0.1 %甲酸的水、質(zhì)控品。
[0027] 所述試劑盒在血清中同時(shí)檢測(cè)維生素 A、25(0H)D2、25(0H)D3、E、Kl和K2中的應(yīng) 用。
[0028] 應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為Y軸；進(jìn)行線 性回歸分析得回歸方程。將相應(yīng)維生素峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別計(jì)算血清樣品中六 種脂溶性的濃度。
[0029] 上述方法中包括質(zhì)控品：含有三個(gè)水平的低、中、高濃度質(zhì)控血清，質(zhì)控品由人工 血清添加混合維生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制得，并通過檢測(cè)確定靶值。
[0030] 本發(fā)明的有益效果：
[0031] 本發(fā)明通過對(duì)樣本前處理方法和超高效液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立了一種 同時(shí)檢測(cè)血液樣品中多種脂溶性維生素的方法，特別是同時(shí)測(cè)定血清中維生素 A、25(0H) D2、25(0H)D3、E、KU K2的方法。采用本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)人血清中六種脂溶性維生素 A、 25 (OH) D2、25 (OH) D3、E、KU K2的含量，并進(jìn)行精確的定性和定量分析，是一種樣本處理簡 單、通量高、結(jié)果可靠的檢測(cè)方法。
[0032] 本發(fā)明中使用的提取方法，可以較多的去除雜質(zhì)，降低檢測(cè)時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，且操作 簡單快捷，可以靈敏的檢測(cè)出各種維生素的含量，尤其是人體內(nèi)含量較低的維生素 Κ。
[0033] 維生素 Α、25 (OH) D2、25 (OH) D3、E、KU Κ2是人體內(nèi)重要的脂溶性維生素，任何一種 維生素的缺乏都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的疾病。本發(fā)明可以同時(shí)檢測(cè)這六種維生素，一是降低了檢測(cè) 成本，二是節(jié)省時(shí)間，三是減少采集被檢測(cè)人的血量，四是可以對(duì)多種維生素的補(bǔ)充提供依 據(jù)。
[0034] 本發(fā)明用超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)血清中六種脂溶性維生素，特異性強(qiáng)，靈 敏性高，通量高，結(jié)果客觀易于分析，尤其適合臨床普及應(yīng)用。基于該方法的試劑盒不僅可 以對(duì)營養(yǎng)性疾病患者進(jìn)行病因診斷，還可以對(duì)潛在的維生素缺乏者進(jìn)行用藥指導(dǎo)，減少盲 目補(bǔ)充維生素的現(xiàn)象發(fā)生。
[0035] 本發(fā)明的方法針對(duì)每種維生素分別選擇一對(duì)定性離子和一對(duì)定量離子，以各種維 生素的相對(duì)保留時(shí)間和定性離子對(duì)作為定性依據(jù)，以標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。同時(shí)，本方 法應(yīng)用三個(gè)水平的質(zhì)控品考察方法的準(zhǔn)確性、有效性，避免檢測(cè)結(jié)果失真。
[0036] 本發(fā)明首次實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用LC-MS技術(shù)對(duì)一份血清樣本中的六種脂溶性維生素同時(shí) 檢測(cè)的目的