一種提取、分離三斑海馬脂溶性成分的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物提取技術領域，涉及一種提取、分離三斑海馬脂溶性成分的方法。
【背景技術】
[0002] 炎癥是機體對感染、病原菌侵入或細胞損傷做出的防御反應。它的基本生物過程 是疾病最常見的信號。在大多數情況下炎癥是通過內源抗炎介質和細胞內負調節(jié)因子的積 累而得到緩解。然而，持續(xù)的積累和激活時慢性炎癥的標志，將會導致這些負調節(jié)機制的功 能紊亂。因此，加強和加速炎癥的限制和解決是開發(fā)抗炎藥物的關鍵。
[0003] 近年來，從天然產物中提取抗炎活性物質因為來源安全和廣泛、副作用小而得到 越來越多的關注。海洋生物居住在復雜的棲息環(huán)境，產生次生代謝產物等，含有獨特的一系 列生物分子，因而海洋資源是尋求抗炎藥物的巨大寶庫。
[0004] 三斑海馬是包括中國在內一些亞洲國家名貴藥材，據中國古典藥籍記載其具有補 腎壯陽、溫通血脈、鎮(zhèn)靜安神、散結消腫、舒筋活絡功效等功效。現代藥理學研究表明其具有 抗氧化、抗腫瘤、抗菌等生理活性，其與磷脂、留醇、氨基酸、微量元素等有關。其中，脂溶性 組分是主要的功效組分，但其中含有不少膽固醇。目前市場上主要的三斑海馬產品是海馬 酒、海馬追風油等，動物組織的脂溶性組分普遍存在膽固醇。
[0005] 膽固醇存在于動物的所有組織中，是動物體維持正常生理活動所必需的。但人體 攝入過多的膽固醇將引起高血脂，并進而引發(fā)一系列心血管疾病，所以控制飲食中膽固醇 的攝入是現代飲食所提倡的方式。
[0006] 動物組織膽固醇的脫除方法目前有有機溶劑抽提、超臨界二氧化碳萃取、P_環(huán)狀 糊精包埋等物理方法及乳酸桿菌分解等生物學方法，成本高，或機制不明確，產生的其他代 謝產物干擾其他營養(yǎng)物的吸收等一系列不利因素而其使用受到限制。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種提取、分離三斑海馬脂溶性成分的方法，用以從三斑海 馬中篩選、提取出抗炎活性較強的脂溶性生物活性物質，并脫除其中的膽固醇。
[0008] 本發(fā)明所采用的技術方案是，一種提取、分離三斑海馬脂溶性成分的方法，具體按 以下步驟實施：
[0009]步驟1，提取脂溶性成分：
[0010] 1.1:采用乙醇溶液回流提取三斑海馬粉體，獲得乙醇粗提取液；
[0011] 1. 2 :對乙醇粗提液進行抽濾，濾渣重復抽濾操作多次，合并濾液減壓蒸發(fā)除去溶 劑，獲得浸膏狀乙醇粗提物；
[0012] 1. 3 :對浸膏狀乙醇粗提物進行有機溶劑萃取，得到三斑海馬脂溶性成分；
[0013] 步驟2,確定脂溶性成分最大紫外吸光峰的波長；
[0014] 步驟3,以步驟測得的三斑海馬脂溶性成分最大紫外吸光峰波長為檢測波長，對脂 溶性成分進行中壓制備與純化色譜硅膠柱層析分離、洗脫，然后收集每個洗脫峰，濃縮至浸 膏、O°c冷凍干燥，得到去除膽固醇的三斑海馬脂溶性分離物。
[0015] 本發(fā)明特點還在于，
[0016] 步驟I. 1具體為：將三斑海馬干燥體用自來水沖洗除去污泥、沙子，干燥后粉碎、 過篩得到三斑海馬粉體，將三斑海馬粉體與質量分數為70 % -95 %的乙醇溶液混合，在 80°C下回流lh-2h，得到乙醇粗提液。
[0017]干燥溫度為50_60°C，干燥時間24_36h;過篩規(guī)格為20-40目。
[0018] 三斑海馬粉體與乙醇溶液的料液比為I:8-12g/ml。
[0019] 步驟1. 3具體為：將浸膏狀乙醇粗提物與去離子水混合，然后加入石油醚，萃取， 取上層石油醚相，重復萃取多次，合并所有萃取得到的石油醚相，45_55°C減壓蒸發(fā)濃縮浸 膏后，0 °C冷凍干燥，得到三斑海馬脂溶性成分。
[0020] 浸膏狀乙醇粗提物與去離子水的質量體積比為I:8-12g/ml，石油醚的加入量與 浸膏狀乙醇粗提物和去離子水的混合物等體積。
[0021] 步驟2具體為：取步驟1得到的三斑海馬脂溶性成分，在石油醚中溶解，渦旋混勻， 以溶劑石油醚為空白，400-190nm紫外光譜掃描，獲取掃描圖譜，得到三斑海馬脂溶性成分 在205nm波長下具有最大吸收峰。
[0022] 步驟3中中壓制備與純化色譜硅膠柱層析分離參數具體為：進樣量：0. 5-2.OmL; 檢測波長：205nm，監(jiān)測波長：210nm。
[0023] 步驟3中洗脫為臺階/線性梯度洗脫。
[0024] 臺階/線性梯度洗脫具體為：洗脫溶劑以石油醚為流動相A，以乙醇為流動相B，流 動相A、B的比例按體積百分比為：45-95%流動相A，5-55%流動相B，以上組分體積百分比 總和為100%，洗脫流速：8-10mL/min。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明方法采用乙醇溶液回流提取三斑海馬獲得乙醇粗提 物，然后采用液_液分離的系統(tǒng)溶劑提取方法，從乙醇粗提物獲得極性小的石油醚提取物， 石油醚提取物經過中壓制備與純化色譜硅膠柱層析，用不同極性溶劑進行臺階/線性梯度 洗脫，獲得極性不同的分離組分。其中，極性較大組分FrIV的生理活性物質含量較高，該組 分中未檢測出膽固醇；同時該組分能夠抑制脂多糖刺激小鼠巨噬細胞RAW264. 7炎癥因子 一氧化氮，且對細胞無毒副作用，對細胞存活性無顯著影響。
【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明方法的流程圖；
[0027] 圖2是本發(fā)明中石油醚提取物紫外光譜掃描圖譜；
[0028] 圖3是本發(fā)明中三斑海馬脂溶性成分中壓快速制備與分離硅膠柱層析譜圖；
[0029] 圖4是本發(fā)明分離得到的膽固醇薄層層析圖譜；
[0030] 圖5是本發(fā)明實施例1三斑海馬脂溶性成分分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264. 7 細胞存活性影響示意圖；
[0031] 圖6是本發(fā)明實施例1三斑海馬脂溶性成分分離組分對小鼠巨噬細胞RAW264. 7 亞硝酸鹽的產量抑制狀況圖。
[0032] 圖中，1?標準品膽固醇，2.FrI組分，3.FrII組分，4.FrIII組分，5.FrIV組分。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0034] 本發(fā)明提供了一種提取、分離三斑海馬脂溶性成分的方法，如圖1所示，具體按以 下步驟實施：
[0035] 步驟1，提取脂溶性成分：
[0036]I. 1將三斑海馬干燥體用自來水沖洗除去污泥、沙子，然后置于50_60°C恒溫干燥 箱中24-36h。經中草藥粉碎機粉碎后過20-40目篩得到三斑海馬粉體，將三斑海馬粉體與 質量分數為70%-95%的乙醇溶液以料液比1 :8-128/1111混合，在80°(：下回流111-211，得到 乙醇粗提液。
[0037] 1. 2將三斑海馬乙醇粗提液在布氏漏斗中抽濾，濾渣重復抽濾操作3次。合并濾液 減壓蒸發(fā)除去溶劑，獲得浸膏狀乙醇粗提物。
[0038] 1. 3將浸膏狀乙醇粗提物與去離子水以I:8-12g/ml的比例混合，然后加入與上述 混合物等體積的石油醚II(沸程：60-90°C)，在梨形漏斗中萃取，取上層石油醚相，重復萃 取3次。合并所有萃取得到的石油醚相，45-55°C減壓蒸發(fā)濃縮成浸膏后，(TC冷凍干燥，得 到三斑海馬脂溶性成分，置于-20°C冰箱保存。
[0039] 步驟2,確定脂溶性成分最大紫外吸光峰的波長：
[0040] 取步驟1得到的三斑海馬脂溶性成分，在石油醚中溶解，渦旋混勾，以溶劑石油醚 為空白，400-190nm紫外光譜掃描。獲取掃描圖譜，檢測出三斑海馬脂溶性成分的最大吸收 波長。石油醚提取物400-190nm紫外光譜掃描結果表明，三斑海馬脂溶性成分在205nm波 長下具有最大吸收峰，因此以205nm為檢測波長，如圖2所示。
[0041] 步驟3,三斑海馬脂溶性成分的中壓制備與純化色譜硅膠柱層析分離：
[0042] 3. 1三斑海馬脂溶性成分經過裝有硅膠柱的中壓制備與純化色譜層析分離。進樣 量：0? 5-2.OmL;檢測波長：205nm，監(jiān)測波長：210nm;
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