專(zhuān)利名稱(chēng)：豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分析化學(xué)和農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及動(dòng)物食品中藥物殘留的方法，尤其涉
及豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法。
背景技術(shù)：
克倫特羅(clenbuterol)是一種人工合成P -腎上腺素受體激動(dòng)劑類(lèi)藥物，商品 名稱(chēng)為平喘素，俗稱(chēng)瘦肉精，本用于治療哮喘等疾病，在發(fā)現(xiàn)它能顯著具有促進(jìn)生長(zhǎng)和提高 動(dòng)物瘦肉率的作用之后，曾一度作為飼料添加劑廣泛應(yīng)用畜牧業(yè)。但克倫特羅毒性大，易在 動(dòng)物組織中蓄積，從而引發(fā)了一系列的中毒事件。因此，為確保畜禽產(chǎn)品安全，我國(guó)于1997 年禁止克倫特羅在動(dòng)物生產(chǎn)中使用。但是受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，克倫特羅的使用屢禁不止，一 個(gè)很重要的原因就是監(jiān)管手段落后。目前，監(jiān)控克倫特羅用的靶組織主要有動(dòng)物可食組織 和動(dòng)物尿液等。由于血液相對(duì)尿液中克倫特羅含量相對(duì)較低的原因，血液中克倫特羅的監(jiān) 控一直未能引起重視，而實(shí)際上豬血液樣品對(duì)于獸醫(yī)部門(mén)來(lái)說(shuō)是最容易獲得的樣品，也是 覆蓋面最全的樣品。 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)[申請(qǐng)?zhí)枮镃N02131321]，名稱(chēng)為"一種免疫層析一步法檢測(cè)P-腎 上腺素激動(dòng)劑類(lèi)藥物的方法及試紙的制備"，其關(guān)鍵技術(shù)主要包括待檢樣品的預(yù)處理方法、 硝酸纖維素膜的制備方法、膠體金結(jié)合物的制備方法、膠體金結(jié)合物墊的制備及試紙條的 組裝方法等。其檢測(cè)原理是樣品中e-興奮劑類(lèi)藥物和膠體金結(jié)合墊上的限量的膠體金標(biāo) 記抗e-興奮劑類(lèi)藥物抗體結(jié)合，多余的膠體金標(biāo)記抗P _興奮劑類(lèi)藥物抗體再和硝酸纖 維素膜上的P-興奮劑類(lèi)藥物反應(yīng)，達(dá)到簡(jiǎn)便、快速、單份篩查e-興奮劑類(lèi)藥的一種或多 種之目的。但該技術(shù)仍采用的是傳統(tǒng)的膠體金免疫層析技術(shù)，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，可達(dá)20多分鐘， 檢測(cè)限還不能達(dá)到O. 3ppb(y g/L)，且檢測(cè)的特異性不夠強(qiáng)。當(dāng)前已申請(qǐng)的專(zhuān)利中用膠體金 免疫試紙條檢測(cè)鹽酸克倫特羅的最低檢測(cè)下限一般在0. 09ppb(ng/ml)以上，因而還不能 達(dá)到快速、超微量檢測(cè)的需要，并且結(jié)果的判定較為困難。 隨著分析技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于血液中低含量的克倫特羅分析已成為可能。目前篩選 方法中酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)的靈敏度通常均能達(dá)到0. 1 ii g/L ;確證方法中氣相色 譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)技術(shù)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC/MS/MS)的靈敏度通常也能達(dá)到 0. 5ii g/L以下。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，而提供為了更好地監(jiān)控克倫 特羅在生豬生產(chǎn)中的使用，利用豬血液作為生物樣品分析克倫特羅含量，同時(shí)根據(jù)豬尿液 和血液中兩者的相關(guān)性從而推出尿液中的克倫特羅含量，使其不僅覆蓋面最廣，又容易獲 得的生物樣品用于監(jiān)控克倫特羅的違禁使用，克服現(xiàn)有監(jiān)控生豬中違禁使用克倫特羅生物 樣品的不足的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，步驟一是將生豬飼喂鹽酸克倫特羅，同時(shí)采集生豬的尿液和血液；步驟二是取步驟一中一定量生豬的尿液和血液的樣品并加入無(wú)水碳酸鈉溶液后進(jìn)行有機(jī)溶劑提取，在提取后加入稀鹽酸反萃取，反萃取液直接陽(yáng)離子小柱后，用氨化甲醇洗脫，洗脫液吹干后經(jīng)硅烷化試劑衍生，最后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析；步驟三是把步驟二所得的尿液和血液中的克倫特羅含量進(jìn)行相關(guān)性分析，并建立線性方程。
采取的措施還包括 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的步驟一為在給生豬喂鹽酸克倫特羅后并距初次喂藥時(shí)間為0d、0. 25d、ld、1. 25d、2d、5d、7d、10d、15d時(shí)分
別同時(shí)采集血液和尿液。 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的步驟一為在給生豬喂鹽酸克倫特羅距停藥時(shí)間為Od、0. 25d、ld、1. 25d、2d、4d、8d、13d、19d時(shí)分別同時(shí)采集血液和尿液。 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的步驟二具體為準(zhǔn)確吸取一定量生豬的尿液和血液于離心管中，加入15mL的乙酸乙酯，再加入10. 0%無(wú)水碳酸鈉溶液，渦旋混合lmin后以4500 5500r/min的速度離心2min，吸取上層有機(jī)溶劑于離心管中，再加入10mL的乙酸乙酯在旋渦混合器上混合lmin，離心后吸取有機(jī)溶劑并合并提取液。 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的步驟二具體為在收集的有機(jī)溶劑中加入5mL的0. 1Omol/L的鹽酸溶液進(jìn)行反萃取，旋渦混合30s，以4500 5500r/min的速度離心2min，吸取下層溶液，同樣步驟重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取液。 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的步驟二具體萃取液陽(yáng)離子小柱后依次用5mL的甲醇、5mL的水和5mL的30mmol/L鹽酸活化，然后將萃取液上樣至固相萃取小柱中，依次用5mL的水和5mL甲醇淋洗柱子，在溶劑流過(guò)固相萃取柱后，抽干小柱，再用5mL的4%氨化甲醇溶液洗脫。 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的步驟二具體為在5(TC水浴中用氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘?，加?00 ii L甲苯和100ii LBSTFA，在8(TC的烘箱中加熱衍生lh，待冷卻后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析。 在上述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法中，所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，克服現(xiàn)有監(jiān)控生豬中違禁使用克倫特羅生物樣品的不足，具有樣品易得，覆蓋面廣的特點(diǎn)；同時(shí)血液樣品由于雜質(zhì)相對(duì)較少，于是分析相對(duì)簡(jiǎn)單，具有確證效果較好的優(yōu)點(diǎn)。


圖1是飼喂期間豬尿中克倫特羅含量的示意 圖2是飼喂期間豬血液中克倫特羅含量的示意 圖3是休藥期間豬尿中克倫特羅含量的示意 圖4是休藥期間豬血液中克倫特羅含量的示意 圖5是本發(fā)明的檢測(cè)步驟示意圖。
具體實(shí)施例方式
以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例一 飼喂期間的豬血液和尿液相關(guān)性 如圖1、圖2和圖5所示，首先進(jìn)行生豬的尿液和血液采樣在距初次喂藥時(shí)間為0d、0. 25d、ld、1. 25d、2d、5d、7d、10d、15d時(shí)分別同時(shí)采集血液和尿液。其中d是英文單詞字母day的簡(jiǎn)寫(xiě)，中文意思為時(shí)間"天"。 然后進(jìn)行分析準(zhǔn)確吸取一定量樣品于離心管中，加入15mL乙酸乙酯，再加入10%無(wú)水碳酸鈉溶液，渦旋混合lmin后以5000r/min的速度離心2min，吸取上層有機(jī)溶劑于離心管中，再加入10mL的乙酸乙酯在旋渦混合器上混合lmin，離心后吸取有機(jī)溶劑并合并提取液。在收集的有機(jī)溶劑中加入5mL的0. 1Omol/L的鹽酸溶液進(jìn)行反萃取，旋渦混合30s，以5000r/min的速度離心2min，吸取下層溶液，同樣步驟重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取液，其中所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯；萃取液陽(yáng)離子小柱后依次用5mL的甲醇、5mL的水和5mL的30mmol/L鹽酸活化，然后將萃取液上樣至固相萃取小柱中，依次用5mL的水和5mL的甲醇淋洗柱子，在溶劑流過(guò)固相萃取柱后，抽干小柱，再用5mL的4%氨化甲醇溶液洗脫，在5(TC水浴中用氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘?，加?00 ii L甲苯和100ii LBSTFA，在8(TC的烘箱中加熱衍生lh，待冷卻后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析；最后是把所得的尿液和血液中的克倫特羅含量進(jìn)行相關(guān)性分析，并建立線性方程。
實(shí)施例二 休藥期豬血液和尿液相關(guān)性 如圖3、圖4和圖5所示，首先進(jìn)行生豬的尿液和血液采樣在距停藥時(shí)間為Od、0. 25d、ld、1. 25d、2d、4d、8d、13d、19d時(shí)分別同時(shí)采集血液和尿液。其中d是英文字母day的簡(jiǎn)寫(xiě)，中文意思為天。 然后進(jìn)行分析準(zhǔn)確吸取一定量樣品于離心管中，加入15mL的乙酸乙酯，再加入10%無(wú)水碳酸鈉溶液，渦旋混合lmin后以5000r/min的速度離心2min，吸取上層有機(jī)溶劑于離心管中，再加入10mL乙酸乙酯在旋渦混合器上混合lmin，離心后吸取有機(jī)溶劑并合并提取液，在收集的有機(jī)溶劑中加入5mL的0. 1Omol/L的鹽酸溶液進(jìn)行反萃取，旋渦混合30s，以5000r/min的速度離心2min，吸取下層溶液，同樣步驟重復(fù)萃取一次，合并兩次萃取液，其中所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。萃取液陽(yáng)離子小柱后依次用5mL的甲醇、5mL的水和5mL的30mmol/L鹽酸活化，然后將萃取液上樣至固相萃取小柱中，依次用5mL的水和5mL的甲醇淋洗柱子，在溶劑流過(guò)固相萃取柱后，抽干小柱，再用5mL的4%氨化甲醇溶液洗脫；在5(TC水浴中用氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘?，加?00 ii L甲苯和100ii LBSTFA，在8(TC的烘箱中加熱衍生lh，待冷卻后氣相色譜質(zhì)譜分析；最后是把所得的尿液和血液中的克倫特羅含量進(jìn)行相關(guān)性分析，并建立線性方程。 相關(guān)性研究在整個(gè)休藥期間，尿液中克倫特羅含量和血液中克倫特羅含量也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，Y = 61. 162X-22. 242， r = 0. 9402。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，同時(shí)根據(jù)豬尿液和血液中兩者的相關(guān)性從而推出尿液中的克倫特羅含量，克服現(xiàn)有監(jiān)控生豬中違禁使用克倫特羅生物樣品的不足，具有樣品易得，覆蓋面廣的特點(diǎn)；同時(shí)血液樣品由于雜質(zhì)相對(duì)較少，于是分析相對(duì)簡(jiǎn)單，具有確證效果較好等優(yōu)點(diǎn)。 本文中所描述的具體實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明精神作舉例說(shuō)明。本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類(lèi)似的方式替代，但并不會(huì)偏離本發(fā)明的精神所定義的范圍。
權(quán)利要求
豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是包括以下步驟步驟一是將生豬飼喂鹽酸克倫特羅，同時(shí)采集生豬的尿液和血液；步驟二是取步驟一中一定量生豬的尿液和血液的樣品并加入無(wú)水碳酸鈉溶液后進(jìn)行有機(jī)溶劑提取，在提取后加入稀鹽酸反萃取，反萃取液直接陽(yáng)離子小柱后，用氨化甲醇洗脫，洗脫液吹干后經(jīng)硅烷化試劑衍生，最后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析；步驟三是把步驟二所得的尿液和血液中的克倫特羅含量進(jìn)行相關(guān)性分析，并建立線性方程。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是 所述的步驟一為在給生豬喂鹽酸克倫特羅后并距初次喂藥時(shí)間為0d、0. 25d、ld、1. 25d、2d、 5d、7d、10d、15d時(shí)分別同時(shí)采集血液和尿液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是 所述的步驟一為在給生豬喂鹽酸克倫特羅距停藥時(shí)間為Od、0. 25d、ld、1. 25d、2d、4d、8d、 13d、19d時(shí)分別同時(shí)采集血液和尿液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是 所述的步驟二具體為準(zhǔn)確吸取一定量生豬的尿液和血液于離心管中，加入15mL的乙酸乙 酯，再加入10. 0%的無(wú)水碳酸鈉溶液，渦旋混合lmin后以4500 5500r/min的速度離心 2min，吸取上層有機(jī)溶劑于離心管中，再加入10mL的乙酸乙酯在旋渦混合器上混合lmin， 離心后吸取有機(jī)溶劑并合并提取液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是 所述的步驟二具體為在收集的有機(jī)溶劑中加入5mL的0. 10mol/L的鹽酸溶液進(jìn)行反萃取， 旋渦混合30s，以4500 5500r/min的速度離心2min，吸取下層溶液，同樣步驟重復(fù)萃取一 次，合并兩次萃取液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是 所述的步驟二具體萃取液陽(yáng)離子小柱后依次用5mL的甲醇、5mL的水和5mL的30mmol/L鹽 酸活化，然后將萃取液上樣至固相萃取小柱中，依次用5mL的水和5mL甲醇淋洗柱子，在溶 劑流過(guò)固相萃取柱后，抽干小柱，再用5mL的4%氨化甲醇溶液洗脫。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征 是所述的步驟二具體為在5(TC水浴中用氮?dú)獯蹈缮鲜鱿疵撘?，加?00i!L甲苯和 100ii LBSTFA，在8(TC的烘箱中加熱衍生lh，待冷卻后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，其特征是 所述的有機(jī)溶劑為乙酸乙酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了豬血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，包括以下步驟步驟一將生豬飼喂鹽酸克倫特羅，同時(shí)采集生豬的尿液和血液；步驟二取步驟一中生豬的尿液和血液的樣品并加入無(wú)水碳酸鈉溶液后進(jìn)行有機(jī)溶劑提取，提取后加入稀鹽酸反萃取，反萃取液直接陽(yáng)離子小柱后，用氨化甲醇洗脫，洗脫液吹干后經(jīng)硅烷化試劑衍生，最后進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析；步驟三把步驟二所得的尿液和血液中的克倫特羅含量進(jìn)行相關(guān)性分析，并建立線性方程。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于利用血液作為生物樣品預(yù)警克倫特羅殘留的方法，克服現(xiàn)有監(jiān)控生豬中違禁使用克倫特羅生物樣品的不足，樣品易得，覆蓋面廣，同時(shí)血液樣品雜質(zhì)相對(duì)較少，分析相對(duì)簡(jiǎn)單，具有準(zhǔn)確效果較好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/02GK101713768SQ20091015326
公開(kāi)日2010年5月26日 申請(qǐng)日期2009年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月29日
發(fā)明者余曉華, 吳銀良, 孫澤祥, 徐震宇, 楊挺, 鮑偉華 申請(qǐng)人:孫澤祥