專利名稱：具有單獨滑片加熱器的自動化的分子病理學裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種用于診斷分子病理學的裝置，尤其是關于用來對裝在顯微鏡載片上的組織樣品自動進行染色和/或處理的裝置。
背景技術：
分子病理學是對引發(fā)疾病或是與疾病相關的DNA、mRNA和蛋白質等分子量的檢測學科，從這種檢測到的重要信息，可以對患者的診斷，預測和治療方案進行說明。分子病理學的實踐一般分成二個主要方面(ⅰ)對完整細胞中DNA、mRNA和蛋白質的分析(就地)；(2)對從組織中提取這些生物物質后的分析。第一類分析，即本發(fā)明主要涉及到的，其優(yōu)點是，可使診斷者或科學工作者在顯微鏡下研究組織樣品的組織病理體系或組織形態(tài)，同時也能對核酸或蛋白質進行檢測。這些技術包括觀測蛋白質的免疫組織化學(IHC)；觀測核酸的就地雜化(ISH)，觀測碳水化合物的組織化學(HC)；和觀測酶的化學的酶組織化學(EHC)。例如，ISH可用于探尋是否存在遺傳異常現象或特別是在細胞內引起癌擴大的基團條件，即，當在顯微鏡下觀察時，在組織形態(tài)上呈現出惡性。ISH也應用于傳染性疾病的診斷中，它不僅能檢測出微生物的順序，而且也能確切地檢測出被傳染的細胞，這具有很重要的臨床病理意義，而且也是一種排除來自無臨床關系的相鄰組織或來自血液或來自外界感染的正向雜化信號的可能性的有效手段。
IHC是使用專門與僅存在于一定類型的患病細胞組織中單一抗原決定基相接合的抗體。IHC對固定在玻璃片上的組織片段或細胞(如，血液或骨髓)需要一系列的處理步驟，通過對某種患病狀態(tài)的形態(tài)指示者進行有選擇的染色而使之突出。主要步驟包括組織片段的予處理，以去除石蠟，并減少非特異性的結合，修補因化學固定劑產生的蛋白質的交聯而隱蔽的抗原，抗體的處理和培育，酶標記的第二抗體的處理和培育，與酶的基質反應以產生熒光團或生色團，以突出具有與抗體接合的抗原決定基的、復染等的組織片段。這些步驟大多數都由多次漂洗步驟間隔，以從前一步驟中除去未反應的殘余試劑。培育是在高溫下進行，通常約37℃，組織必須不斷地防止脫水。ISH分析，取決于探測劑與來自組織樣品或體液細胞的獨特的或重復的核苷酸序列的特殊親合力，它要求一個用許多不同試劑的相類似系列的工藝步驟，并進而通過不同溫度要求而完成。
鑒于對IHC和ISH需要大量的重復處理步驟，必須引入自動化系統(tǒng)，以減少人力、費用，以及與此有關的錯誤率，并且要均勻引入。已成功使用的自動化系統(tǒng)實例包括NEXES和GenⅡ染色系統(tǒng)，可由Ventana醫(yī)療系統(tǒng)(Tucson,Arizona)以及Copeland等人的US專利No.5654199中公開的系統(tǒng)中獲得，這些系統(tǒng)使用了控制系統(tǒng)的微處理機，該控制系統(tǒng)包括支撐輻射狀定位載片的旋轉圓盤傳送帶，步進電機旋轉圓盤傳送帶，將每個載片放置在位于載片上的系列試劑分配器的下面，載片和試劑分配器上的條型碼可使計算機控制分配器和載片的定位，以致通過適當的計算機程序完成對每一個不同組織樣品的不同試劑處理。
上面提到的染色系統(tǒng)包括一個熱空氣吹風機，或者一個加熱燈，以加熱各樣品到高于實驗室的環(huán)境溫度，以保證各步驟要求的高溫。對載片的加熱可通過促進化學反應而改進染色質量，并能使反應溫度更接近于匹配的體溫(約37℃)，在此溫度下設定抗體以進行反應。而這種對流或輻射加熱系統(tǒng)基本適用于以抗體為基礎的IHC分析。而不太適用于以核酸為基礎，并且要求更高更精確的溫度控制的ISH。為了使目標樣品和探測劑兩者的DNA雙螺旋變性，以致使它們變成單鏈，所以溫度必須提高到雙螺旋的熔點以上，通常約94℃。同時必須強調的是樣品不能加熱超過100℃，如果加熱過高，會破壞細胞的形態(tài)，使它難以在顯微鏡下觀察。在ISH分析中也要求更精確的溫度控制，以在所要求的嚴格性下實施探測劑的雜化。所選擇的溫度必須足夠低以便在探測劑和模板劑之間進行雜化，但是，還要使其有足以防止失配的雜化物形成的高溫。因此需要一種自動化的組織染色裝置，該裝置對大多數ISH應用能夠控制足夠精確的反應溫度。
通常使用的具有自動化組織染色器的加熱單元的另一個缺點是它們不能夠對各個片進行單獨的溫度控制。現有技術系統(tǒng)，所有的載片在處理過程中，在任何給定的時間內都加熱到相同的溫度。例如，在Bogen等人的US專利No.5645114中公開的，所采用的分配組件，可承載多個顯微鏡載片。配有一種含有電阻加熱單元的各個載片的夾具。然而，因為Bogen等人提出的組件，對所有的載片都加熱到同一個溫度，例如沒有公開能單獨控制加熱的裝置，也沒有公開能使載片屏蔽相鄰載片產生的熱的裝置。這就不可能具有不同溫度參數的方案，以在同一時間內對不同樣品進行處理。例如，具有不同嚴格要求的DNA探測劑測定不能在同一時間有效地進行。因此，要求一種自動的組織染色裝置，甚至試驗有獨特的加熱要求時，相鄰載片之間可以對它們進行不同的試驗。
在IHC和ISH試驗中經常遇到的困難是產生于經常要保存組織的方式。幾十年來，主要支持診斷病理學實驗室工作的是福爾馬林固定，石蠟封存的組織塊、切片并固定在玻璃片上，以這樣一種保存方式固定能引起大分子氨基酸和核酸二者的交聯。這些交聯成分必須去除，以使探測劑能接近目標核酸，并使抗體識別相應的抗原?！叭パ诒巍笨乖?或核酸主要是用人工多次予處理、質子消化和洗滌等步驟而完成。如果對細胞進行調節(jié)過程，以使它們的抗原和核酸適于檢測，則可以期望自動操作。
在染色前，要求必須完全去除石蠟，以至于不干擾抗體或探測劑的結合。石蠟是一種疏水物質，在染色或使用探測劑雜化前，必須去除，連續(xù)使用2次或3次凈化劑通常可獲得石蠟脫除，凈化劑是石蠟的溶劑，如二甲苯、二甲苯取代物或甲苯，它們可能是有毒的，易燃的，并造成環(huán)境危害，所以對載片脫蠟，采用更安全、更快速的方法是有利的。
發(fā)明簡要本發(fā)明是關于對多個固定在顯微鏡載片上的組織樣品進行自動染色或處理的裝置和方法，每個樣品都能接受到單獨的染色或處理方案(protocol)，甚至當這種方案需要不同的溫度參量，這樣，基于不同DNA探測劑和/或抗體的染色步驟可同時進行，盡管在同一時間每個可有不同的加熱要求。此外，樣品要求的脫蠟(例如，腫瘤片段)可在同一時間自動進行，而其他樣品(例如，涂片)則不要求這種初步步驟。
更具體地，該裝置是一種計算機控制，條形碼驅動的染色裝置，能自動地將化學試劑和生物試劑施加到固定或附加在標準玻璃顯微鏡載片上的組織或細胞上。多達20個載片，以環(huán)形排列固定在圓盤傳送帶上，當計算機指令時，即可旋轉，將每個載片放置在位于載片上的試劑分配器系列中的一個之下，以最佳的程序和所要求的時間周期，每一載片都能受到所選擇的試劑(例如，DNA探測物)，并且進行洗滌、混合和/或加熱。然后，將這樣染色或處理的組織片段由使用者從裝置內取出，由醫(yī)務專業(yè)人員在顯微鏡下觀測，他們研究載片以用于選擇病人的診斷、推測或治療方法，計算機控制的自動化能使裝置以一種“方便”的方式進行應用，即，使用很少的人力。
根據本發(fā)明，各個載片的溫度控制是由加熱系統(tǒng)完成，該加熱系統(tǒng)具有以輻射狀安裝到圓盤傳送帶上的加熱平臺，用于對每個載片的溫度進行加熱和傳感。在載片的圓盤傳送帶上也裝有印刷線路板，分別對每一個加熱平臺進行監(jiān)測和控制。信息和能源借助于滑環(huán)組件而在旋轉的圓盤傳送帶和固定裝置之間通過。這些信息包括對20個載片中的每一片以所需的較高和較低的溫度參數加熱到適宜的時間周期。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是每個樣品都能受到單獨地染色或單獨的處理方案，即使是這些方案要求不同的溫度參數。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是該系統(tǒng)能對固定有組織的載片，整個表面的溫度進行精確地控制(即，在規(guī)定溫度的+或-兩攝氏度以內)。對于ISH中的DNA變性作用和探測劑雜化作用及相關的過程，如就地PCR，尤其需要這樣的精確性。此外，根據本發(fā)明，由于能進行均勻加熱，所以整個載片表面保持在狹窄的溫度范圍內，這樣，不管它在載片上的位置如何，組織都得到均勻地加熱。
本發(fā)明的再一個優(yōu)點是該系統(tǒng)能以自動化方式進行組織樣品的脫蠟，而不必依賴于如二甲苯一類的有害溶劑。
本發(fā)明的第四個優(yōu)點是利用在水溶液中加熱組織，該組織是通過使細胞中的目標分子更易于染色，而使染色條件更好。
本發(fā)明的第五個優(yōu)點是該系統(tǒng)對固定有組織的載片，能迅速加熱載片表面(即，不到2分鐘內，從37℃到95℃，不到4分鐘內，即可冷卻到同一范圍下)，從而能使DNA變性，而不會變性過度，和因加熱過度而使細胞形態(tài)受到損失。
本發(fā)明的第六個優(yōu)點是該系統(tǒng)能在染色后，利用熱量使組織樣品脫水。
本發(fā)明的第七個優(yōu)點是不存在人為的誤差，并因自動操作而增加產率。
參照本發(fā)明的以下的詳細描述、所附的權利要求書和附圖中的說明，本發(fā)明上述的和其他的目的、優(yōu)點和特征將更加明顯，本發(fā)明的實質也更加清楚理解。
附圖的簡要描述

圖1是表明載片蓋已打開和圓盤傳送帶門已去除的本發(fā)明的透視圖。
圖2是表明與用以操作的計算機和其他裝置連接的本發(fā)明的透視圖。
圖3是本發(fā)明的立體分解圖。
圖4是表明帶有試劑分配器的本發(fā)明的透視圖。
圖5是本發(fā)明加熱系統(tǒng)的方框圖。
圖6是表明由板部分斷開以暴露控制電子件部分的銷子的本發(fā)明加熱器/傳感器單元的透視圖。
圖7是加熱器的平面視圖。
圖8是表明其上有玻璃載片的加熱平臺的透視圖。
圖9是沿圖8中9-9線剖開的加熱平臺的斷面圖。
圖10是表明其上裝有多個加熱平臺的滑環(huán)組件和載片的圓盤傳送帶的透視圖。
圖11是表明其上裝有控制電子件印刷線路板的圖10中圓盤傳送帶下側的透視圖。
圖12是加熱器的頂面視圖。
圖13是圖5中控制電子件、加熱器和傳感器的方框圖。
圖14是控制加熱各個載片的流程圖。
圖15是控制冷卻各個載片的流程圖。
圖16是環(huán)組合件的斷面視圖。
發(fā)明的詳細描述現在詳細參照附圖，其中用同一標號表示同一部件，圖1表明了根據本發(fā)明的分子病理學裝置的透視圖，一般用標號10表示。所設計的裝置10是以要求的順序、時間和溫度，用核酸探測劑、抗體、和/或與其有關的試劑對裝在顯微鏡載片上的組織自動進行染色或其他形式的處理。然后，由專業(yè)醫(yī)務人員在顯微鏡下觀測這樣染色或處理的組織片段，他們研究該載片，以對病人選擇診斷、推測、或治療方案。
在優(yōu)選實施方案中，裝置10僅是系統(tǒng)12(圖2)中的一部分或者是一個組件，該系統(tǒng)還包括主機14，最好是個人計算機，監(jiān)測器16、鍵盤18、鼠標20、整體流體容器22、廢物容器23和有關的設備，另外的染色組件或其他裝置可加入到系統(tǒng)12中，以形成用計算機14為服務器的網絡。另外，這些單獨部件中的某些或全部都能組裝到裝置10內，使它成為一個獨立應用的裝置。
裝置10及系統(tǒng)12的優(yōu)選結構形式描述于如1997年12月遞交的US專利申請序號No.08/995052及由Ventana Medical Systems，Inc(Tuscon,AZ)獲得的Ventana Nex ES User＇s Guide中，這里是兩者的結合，除了下面公開的有關新型加熱系統(tǒng)、載片支架、整體流體組件、容積調節(jié)體系和載片的擦試體系之外。為了清楚起見，在本發(fā)明和結合參考文件中見到的這些組件的詳細描述都省略掉。
簡單地說，裝置10是一個由微處理機控制的染色裝置，它能自動地向裝在標準玻璃顯微鏡載片上的組織施加化學試劑和生物試劑。支撐輻射式定位玻璃載片的圓盤傳送帶由步進電機驅動旋轉，以將每一個載片放在試劑分配器系列中之一的下面。裝置10控制分配、洗滌、混合和加熱，以優(yōu)化反應動能，計算機控制的自動操作保證裝置10能以“輕而易舉”的方式使用，即，只用很少的人力。
尤其是，裝置10包括一個由較低部分30和較高部分32形成的殼體，較低部分30可拆卸地安裝或鉸接到較高部分32上，載片的圓盤傳送帶34安裝在較低部分30內，圍繞著軸A-A旋轉。下面將更詳細地描述，在圓盤傳送帶34的周邊處輻射狀地安裝多個加熱平臺50，在其上可以放置有組織樣品的標準玻璃載片。圓盤傳送帶34最好用不銹鋼制作。正如本文中所描述的，本發(fā)明的主要特征是通過各種傳感器和微處理機分別控制每個載片的溫度，在裝置10(圖3)中還安裝有清洗分配噴嘴36，蓋片(CoverslipTM)分配噴嘴37、流體刀38、洗滌容積調節(jié)噴嘴39、條形碼閱讀器反射鏡40、和空氣渦流混合器42，這些將在后文中詳細描述。
在部分32上部頂上可旋轉安裝的是試劑圓盤傳送帶28。分配器26可拆卸地安裝到試劑盤29上(圖4)，而它又適應于與圓盤傳送帶28相嚙合。試劑包括通常施用于各種載片的化學物質或生物物質，這些載片含有核酸探測劑或引物、聚酶、原發(fā)性抗體和繼發(fā)性抗體、消化酶、予-固定劑、后-固定劑、顯示(readout)化學、和復染。為了用計算機識別，試劑分配器26優(yōu)選是條形碼標記29。對每個載片施加單一試劑，然后，在溫控環(huán)境下培育精確的時間周期。用壓縮空氣噴射口42瞄準載片的邊緣以完成試劑的混合，因此引起試劑旋轉。在適當培育后，使用噴嘴36將試劑由載片上洗掉。然后使用容積調節(jié)噴嘴39以調節(jié)剩余洗滌緩沖液的容積。然后通過噴嘴37向載片施加蓋片(CoverslipTM)溶液，以防止蒸發(fā)。氣刀38分隔開CoverslipTM的液池，隨后使用下一個試劑，當圓盤傳送帶旋轉時，重復這些步驟，直到方案完成為止。
除了主機14外，裝置10最好包括它自己的微處理機44，由主機14的信息可以下載于此。尤其是計算機下載到微處理機44運轉程序中的步驟順序以及傳感器的監(jiān)測和控制，兩者在邏輯上都稱作“運行規(guī)則”以及方案的溫度參數。來自Dallas半導體的Dallas TX的型號No.DS2251T128K就是一種微處理機的實例，它能完成這一功能。
現在再回到圖5，它表明載片加熱系統(tǒng)48的方框圖。該系統(tǒng)一般包括約20個加熱平臺50，輻射狀地安裝到圓盤傳送帶34上，以加熱載片，和監(jiān)測其溫度，并控制也安裝到載片圓盤傳送帶上的電子件印刷線路板52，以監(jiān)測傳感器和控制加熱器?？刂齐娮佑∷⒕€路版52安裝在旋轉載片圓盤傳送帶34之下。信息和電源通過滑環(huán)組件56從固定裝置平臺傳輸到旋轉的圓盤傳送帶上。該信息包括加熱載片所需的溫度參數(較高和較低)，從微處理機44(從計算機14下載后)傳輸到控制電子件52，如下面描述的，在運行期間，如果載片所測溫度低于程序設定的下限，則熱平臺加熱載片。同樣，如果發(fā)現載片溫度高于上限，加熱停止(參看圖14的方框88)。有足夠容量的電能對每個加熱器提供約8瓦，以滿足所要求的升溫速率(a/k/a“直線上升”)。
同樣，在另一個方案中，同樣可以控制載片的冷卻，如后面描述的。在另一個方案中，在載片的下面裝有冷卻平臺，冷卻平臺可以包括珀爾帖(Peltier)型熱轉換器。在又一個改變方案中，如果為特定用途，要求將載片迅速冷卻，則可任選地提供如風扇(未圖示)一類的冷卻裝置。冷卻裝置將改變所有平臺的周圍環(huán)境空氣，迫使對應于不應冷卻的各載片的加熱器補償環(huán)境空氣溫度的降低。
本文所描述的載片加熱系統(tǒng)采用傳導加熱和分別加熱各載片的方式。該系統(tǒng)提供更精確的載片上溫度，并能通過載片基底而設定溫度?，F在更詳細地描述加熱系統(tǒng)48的每一個構成部件。
加熱平臺參照圖6-10，加熱平臺50包括兩部件加熱器/傳感器單元58和殼體70，以可拆卸地將加熱器/傳感器單元58安裝在圓盤傳送帶34上，并支撐各載片37。
加熱器/傳感器58有一個平板60，約2英寸長和1英寸寬，最好由0.04英寸厚的黃銅板制成。也可以用其他材料取代黃銅，只要它是一種剛性材料，并具有足夠的傳導性，將熱量均勻地分散在其整個表面，以致使載片可被均勻地加熱，平板任選地用抗腐蝕材料覆蓋，如Teflon。
本發(fā)明的一個特殊特征是在特定的時間能將相鄰的載片可任意地加熱到不同的溫度，這是通過在加熱器之間具有高熱電阻而使各載片相互熱隔離而完成的。正如本技術領域的人員所理解的那樣，熱阻是材料傳導性、材料厚度、和熱傳播距離的函數。因此，可以使用各種類型的材料對相鄰載片進行熱隔離，包括橡膠、塑料、陶瓷，或金屬，只要它們能提供根據文中提到的條件的熱阻就可以，本文使用的術語“熱隔離”，意思是來自一個加熱器的熱量對相鄰載片的溫度沒有明顯的影響。此外，對于熱隔離相鄰載片可以使用各種結構方式，包括將載片安裝在熱阻材料上，將熱阻材料裝在載片之間，和將載片放置在熱阻平臺上。
在優(yōu)選的實施方案中，圍繞著平板60的周圍安裝防護罩62，并由平板60的底側垂直懸掛，該防護罩62優(yōu)選用橡膠或類似材料制成，它既是防水層，又是隔熱層。防護罩62的絕熱特性有助于促進相鄰載片之間的這些溫度差異。應當指出的是可以使用各種材料以代替橡膠對相鄰載片的隔熱，包括能經受至少100℃溫度的陶瓷和塑料，安裝在加熱器/傳感器單元58(已描述)空穴中的部件必須與在裝置進行染色運行時所使用的各種加熱溶液(以油和水為主)進行屏蔽。因此，優(yōu)選通過橡膠硫化或類似工藝方法將平板60連結到防護罩上，以致形成即使在高溫下流體也不滲漏的密封。防護罩62的壁同樣必須能抵抗住這些加熱溶液。在優(yōu)選的實施方案中，防護罩62的厚度是0.06英寸的橡膠材料，因此減小了熱可以傳播的橫載面。另一方面，防護罩62也可以用金屬材料制成，如黃銅，要足夠薄(例如，約0.01英寸)，以提供熱阻。當安裝到圓盤傳送帶34上時，防護罩62的高度約0.5英寸，因此，提高平板60并且在其上支撐的載片也在同樣高度，在操作時升高放置有載片的平臺，使載片遠離收集在圓盤傳送帶34上的各種液體，并使載片與相鄰加熱器產生熱隔離或絕緣。
光蝕刻的阻熱器64安裝在由防護罩62限定的空腔中的平板60的下側。加熱器可用選自高阻抗鎳基材料，如鉻鎳鐵合金，到導熱性更高的材料，如銅-鎳的各種材料制成，銅-鎳是優(yōu)選的。光蝕刻電阻器64粘接并夾在二個0.008英寸厚的由杜邦公司購買的KaptonTM聚酰亞胺薄膜制成的塑料薄片之間，導線65焊在電阻跟蹤器的端部，這些導線從兩個KaptonTM層之間引出，并連接到光蝕刻的電阻器上。該夾層的一個外側指定與加熱器粘接，而另一外側有光蝕刻線路連接，第二線路是傳感溫度的，并具有四個低電阻跟蹤器，其終結是在加熱器中心處的焊片上，該焊片與用Dallas半導體制造傳感器連接，它們的部件號碼是DS1721S。四個跟蹤器焊接到同一面中引出的四根導線上，導線又連接到加熱跟蹤器上，第三層KaptonTM是粘接在控制跟蹤器上并且該第三層在中心處的焊片上有中斷器，以便連接傳感器。如圖7所示，從加熱器引出六根導線，二根向加熱器供電源，四根用于傳感溫度，六根導線接到母插頭一個六孔線路插孔板67，它由多家公司制造的，如AMP(Harrisburg.PA)或Molex(Lisle，IL)。插孔連接器片覆蓋六個焊在另外描述的控制電子園形PC線路板52上的匹配插頭69。PC板52安裝在載片圓盤傳送帶34之下，在其上側對面連接載片加熱器，所以六個匹配插銷通過圓盤傳送帶內的矩形開口75向上延伸。
根據本文公開的說明，加熱器64的加工來源是Minco產品(Minneapolis，MN)。正如下面更詳細的公開，加熱器各自通過集成線路驅動器或能夠啟動和關閉加熱器的各個晶體管(安裝到印刷線路板52上)進行控制。
正如所描述的，加熱器/傳感器單元能夠迅速加熱載片的有用面積，在2分鐘內從37℃加熱到95℃，并在4分鐘內在同樣范圍冷卻，以使DNA變性。而不會過渡變性，也不會因加熱過度，而使細胞形態(tài)受到損失。
由于組織試樣常常安放在載片的不同位置上，所以均勻加熱載片表面是本發(fā)明的另一個關鍵目的。這就對傳導加熱提出一個課題，甚至當人工完成時，由于傳統(tǒng)的加熱板常常產生不規(guī)則的“熱點”，使其難以知道在板上何處放置載片。如果整個組織的細胞得不到均勻地加熱，則顯微鏡載片將得不到準確的解釋。例如，如果溫度達不到使探查物和組織DNA變性的溫度，就有可能導致虛假的負效應而在嚴格洗滌時的不合理，又能導致虛假的正效應。
為了確保利用加熱平臺60均勻加熱，所以將阻熱器64安裝在板60的底側。如上所說，黃銅板具有足夠的傳導性，以消除因加熱跟蹤器不能在表面連續(xù)而引起的任何局部不均勻性，而是由不產生熱量的空間所分隔相鄰線路，分隔的量級為0.015英寸，所以在黃銅板的另一側看不到熱源中的這種非均勻性，通過改變加熱跟蹤器，使它們以非均勻方式產生熱，同樣可以獲得載片溫度的均勻性，熱量損失則包括載片37的邊緣和黃銅板60的邊緣的所有表面的四周空氣，但是，熱量只由黃銅板底表面上的加熱器64產生。如果在加熱器的整個區(qū)域中產生的熱是均勻的，所以以恒定通量進行黃銅板底部，則玻璃載片的頂部中心將明顯高于能快速散熱的邊緣。如果減小中心處的加熱器通量從而能提高玻璃載片頂部溫度的均勻性，這一現象是可以調節(jié)的，可以使用由Parametric Technologies(Waltham，MA)生產的Meohanica的有限元件熱量傳遞程序，以模擬系統(tǒng)中的熱流動，加熱器通量優(yōu)選如圖12所示設置，中心區(qū)63覆蓋總面積的40％，產生的熱能為總能量的8.3％，而外區(qū)域61產生的熱能平衡。因此，由于中心區(qū)接收較少的熱量，所以中心區(qū)正上方的載片上溫度稍低于長方形環(huán)正上方的載片溫度，當加熱器制成如所述的外形則玻璃載片的有用區(qū)域的溫度變化，(其上放置組織的區(qū)域一般不包括載片的最外邊緣)約為0.2℃，從玻璃片中心到玻璃片有用區(qū)域邊緣的溫度梯度為逐漸升高0.2℃，然后逐漸下降0.2℃。1英寸寬，3英寸長的濕潤玻璃載片的頂表面，在它的有用區(qū)域內保持特定的均勻的溫度，該有用區(qū)的限定為集中在載片寬度為0.75英寸，長度為1.6英寸的區(qū)域，從標記的相反端開始0.25英寸。均勻性的目的是將設定的溫度保持在正負2℃的范圍內，有用區(qū)域內的設定溫度從37℃～95℃。
可以使用Peltier型熱轉換器代替上述的加熱元件，它所通過轉換器而變換極性既能加熱和又能冷卻。這種冷卻能力在某種潛在應用方面具有應用性，本發(fā)明的應用，如就地進行PCR(下文將討論)。
溫度傳感器68也安裝在空腔73中的加熱器64的底側。可使用幾種不同類型的傳感器，如熱敏電阻，RTD＇s、或熱偶。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，使用集成線路傳感器68，它可以直接將溫度轉換成數字信號，如從Dallas半導體(Dalias，TX)獲得的型號No.DS1721型的傳感器。這種傳感器利用I2C方案以數字報導所感到的溫度。類似的傳感器也可從National半導體(SantaClara CA)獲得，所選擇的傳感器必須精確、可重復，并具有很低的熱質。
殼體70，優(yōu)選由噴射模鑄塑料構成，能提供將加熱器/傳感器58可拆卸地定位到圓盤傳送帶34上，并能支撐玻璃載片37。正如圖9中所見到的，殼體70限定為一個基本矩形空腔71，可將加熱器/傳感器單元58裝嵌到其里面，并由夾持器固定。在殼體70的底部，限定了一個凹槽區(qū)72，它收容沿防護罩62的端邊限定的相應凸緣74，以使加熱器/傳感器單元58固定在應有的位置上。為了進一步密封空腔71以隔離裝置操作時所用各種試劑，可提供一個向下延伸的凸出部分76，可更嚴密地使凸緣74嚙合，為進一步密封，也可沿防護罩62的外壁提供一個凸起部分78。該凸起部分的外側尺寸稍稍大于殼體的內側尺寸，可產生一種干擾，防止液體從防護罩和殼體間的凸起部分的下面進入空腔71中。
在殼體的基座上限定了一組安裝機器用的螺栓孔80(圖8)，與限定在圓盤傳送帶上的孔成一直線。
玻璃載片37由四個向上的相關支柱82固定，而放置在平板60上，支柱82整體地安裝在殼體70上。支柱延伸到玻璃載片厚度之上的一半，如圖9所示，由于玻璃載片厚度為0.04英寸，支柱是低于玻璃載片頂面0.02英寸，重要的是支柱伸出到載片的頂面，為了防止排出溶液的水溶液表面張力?，F有技術的已知裝置的問題，相對載片頂部的垂直夾具，它們存在一種趨勢，以毛細作用會虹吸掉載片的流體，應當指出的是可以使用其他方式固定或支撐載片。
控制電子件(印刷線路板)參照圖13所示的方框圖，控制電子件52包括一個具有需通過一系列數字方案57由染色裝置微處理機44接受溫度定點的必要部件的環(huán)形印刷線路板，并使用該信息將每個加熱器64保持在其定點上。那些沒有示出的部件(例如，電阻器、電容器等)，對本技術領域中技術人員容易理解的。加熱器的控制可以以各種方法完成，在優(yōu)選實施方案中，各加熱器可以通過集成線路驅動器或單獨的轉換器53能開啟/關閉加熱器的電流通或斷而單獨地進行各自的控制。因此，處理器可控制加熱器的運行循環(huán)，正如隨后描述的，在另一個實施方案中，可通過處理器55調整加熱器的電量，以至使加熱器可在總容量的百分比下進行(例如，最大加熱電源的50％)。在優(yōu)選實施方案中，使用由Allegro微機系統(tǒng)(Worcester.MA)獲得的集成線路(UDQ 2559)。具有微處理機44的系列信息設備57(通過滑環(huán)組件56)，優(yōu)選使用由荷蘭Eindhoven.Philips Labs開發(fā)的I2C(內集成線路)系列總線驅動方案。也可以使用，如RS232D、RS422等或其它的另外方案。控制電子件52起到監(jiān)測傳感器68和控制加熱器64兩種功能的作用。中心控制電子件52是一個微處理機55(它與存儲器51相連)或者是以能通過I2C系統(tǒng)總線驅動與染色裝置微處理機44連通時，能監(jiān)測加熱器溫度傳感器68和在特定時間需要提高載片溫度時向加熱器64供電能的其它數字的電路系統(tǒng)。這種微處理機的實例是由AZ,Chandler,Microchip Technology lnc.獲得的PIC16C64A。當與染色系統(tǒng)微控制器(參看圖14)提供的定點溫度(或目標溫度)相比較時，該程序必須控制對應于加熱器溫度傳感器的加熱器。根據存儲器51中定點溫度47的搜索表，微處理機55確定如何控制各加熱器。從具有微處理機44的系列信息設備57接收到搜索表47中的定點溫度。微處理機55從傳感器68獲得實際的溫度，而后，根據實際溫度和定點溫度之間的差異改變加熱器64的控制。這種加熱器的控制可以嚴格開關(即，如果其傳感器溫度低于定點，則開啟加熱器，如果其傳感器溫度高于定點，則關閉加熱器)，或者可利用百分比、積分和/或微分控制系統(tǒng)計算以提供更可控制的和精確的應答。
電源分配和控制反饋系統(tǒng)必須是以使熱平臺能夠精確地調整以模擬熱循環(huán)工藝中的特征(例如，就地PCR)并能夠迅速遞升溫度和冷卻降低溫度(例如，在3分鐘內從37℃～95℃，在5分鐘內冷卻到同一范圍)，這些特征對于成功地ISH染色，尤為重要。
為了使各載片的溫度調到目標溫度，處理器通過改變對各載片的加熱以控制載片的溫度，在優(yōu)選實施方案中，通過改變加熱器的輸出功率以實施對各片的加熱改變。參照圖14，該圖給出了各個載片加熱控制的流程圖。如方框84所示，獲得各個載片的目標加熱溫度(或設定點溫度)。在優(yōu)選實施方案中，目標溫度是從微處理機42傳送到控制電子件52。目標溫度也可以由操作人員另外輸入或通過載片上的條型碼讀出。如方框86所示，通過溫度傳感器68指示，確定載片溫度是否高于目標溫度。如果是，關閉加熱器，如方框88所示，另一方面，根據實際溫度和目標溫度之間的不一致，可以改變由加熱器產生的加熱量。例如，可以減少加熱器的工作循環(huán)。通過脈沖寬度調節(jié)，可以改變加熱器的工作循環(huán)(例如，可以減少加熱器的工作循環(huán)，從50％(此時加熱器運行時間的50％)到25％工作循環(huán)(此時加熱器運行時間的25％))。在另一變化方案中，如果實際溫度明顯高于目標溫度或如果想要更精確的溫度控制則在關閉加熱器之后，打開冷卻器。
在另一實施方案中，處理器通過改變加熱器和載片之間的熱的傳遞量而控制傳遞到各載片的熱量。作為一個實例，微處理機可改變加熱器和載片之間緩沖劑的熱傳遞特性，來改變傳遞到載片的熱量，并改變載片的溫度。
如果載片溫度低于目標溫度，加熱器打開，如方框90所示，加熱器的控制可利用百分比的、積分的，和/或微分的控制系統(tǒng)的計算以提供更可控制和更精確的應答。在優(yōu)選實施方案中，由加熱器產生的熱量是基于實際溫度和目標溫度之間的差異。例如，根據電流溫度和目標溫度之間的溫差，加熱器可以啟動100％，50％，等的工作循環(huán)。因此，如果實際溫度高于目標溫度2℃以上，則加熱器啟動為滿負荷循環(huán)。當實際溫度接近目標溫度，則減少加熱器的工作循環(huán)，以使對載片產生低的總熱量。此外，一旦加熱器達到目標溫度，則處理器55通過確定實際溫度和目標溫度之間的差異而維持控制，如方框86所示。這種循環(huán)繼續(xù)直到載片的加熱時間已到達為止，如方框92所示。因此，如果載片計劃要加熱到預定的時間，則載片的溫控制要進行到預定時間量完全結束為止。
然而，根據載片的特定目標溫度，以實驗方式確定維持載片在目標溫度時所需要的熱量，例如，當根據改變加熱器的工作循環(huán)而改變熱量時，則根據目標溫度確定加熱器的特定工作循環(huán)。將這些值存儲在搜索表47中。因此，當載片的實際溫度接近目標溫度時，工作循環(huán)減少到搜索表47中的實驗值。以這種方式，載片溫度可以從當前溫度轉變成目標溫度。
另一方面，溫度的控制可以是嚴格地開關(即，加熱器的傳感器溫度低于目標溫度，啟動加熱器，而當加熱器的傳感器溫度等于或高于目標溫度，則關閉加熱器)或溫度的控制可以是按比例的(即，改變加熱器產生的熱量，而不是工作循環(huán)；以至于使加熱器輸出其總加熱電能的一部分，例如加熱器總輸出功率的50％)。
參照圖15，表明單個載片的冷卻控制流程圖作為本發(fā)明的另一種實施方案。如方框94所示，得到對單個載片的目標冷卻溫度。目標溫度從微處理機42傳送到控制電子件52，目標溫度可以由操作人員輸入或通過載片上的條形碼讀出。如方框95所示，根據系統(tǒng)的操作，載片可以由環(huán)境空氣冷卻，或者由冷卻平臺冷卻，等等。
如方框96所示，類似于圖14，當由溫度傳感器68指示，確定載片溫度是否低于目標溫度，如果是，則關閉冷冷卻器，如方框94所示，另一方面，根據實際溫度和目標溫度之間的差異，可以改變冷卻器產生的冷卻量，例如，可以減少冷卻器的工作循環(huán)，通過調節(jié)脈沖寬度，可以改變冷卻器的工作循環(huán)。
如果載片溫度高于目標溫度，則冷卻器啟動，如方框98所示。冷卻器的控制，類似于加熱器的控制，可以使用比例、積分、和/或微分控制系統(tǒng)計算，以提供更可控制和更精確的應答。在一個實施方案中，產生的冷卻能力是基于實際溫度和目標溫度之間的差異。例如，根據電流溫度和目標溫度之間的溫度差異，冷卻器可以啟動100％、50％，等工作循環(huán)。因此，如果實際溫度高于目標溫度2℃以上，則啟動的冷卻器為滿負荷循環(huán)。當實際溫度接近目標溫度，則減小冷卻器的工作循環(huán)，從而對載片產生較低的總冷卻能量。此外，一旦冷卻器達到目標溫度，則處理器55通過確定實際溫度和目標溫度之間的差異而維持控制，如方框96所示，這個循環(huán)繼續(xù)直到超過載片冷卻時間已達到為止，如方框100所示。
滑環(huán)組件滑環(huán)組件56是使用旋轉的銀環(huán)和銀-石墨刷的技術。滑環(huán)必須有足夠的尺寸(約3″直徑)和容量(每個環(huán)約20安培)以承載I2C數字控制信號(2環(huán))、對邏輯的電能(2環(huán))和對加熱器的電能(2環(huán))。適于這種用途的滑環(huán)可從Fabricast,Inc South ElMonte CA,Airflyte Electronics,Bayonne,New Jersey,Litton Poly-Scientific,Blacksburg,VA和其它地方獲得。電纜57可操作地將滑環(huán)轉動體連接到控制電子件52(圖11)。定子支架59是使用機器螺栓或類似部件(未示出安裝)，將定子固定到裝置10上。參照圖16，表示滑環(huán)組件56的縱向部分視圖，具有傳輸數據的導件49，邏輯電能和加熱器電能，如圖5和16所示。
參照圖3，在裝置10中一般安裝有如下部件，如美國專利申請序號No.08/995052中描述的液體CoverslipTM分配噴嘴37、步進電機61、淋洗分配噴嘴36，液刀38、條形碼閱讀器40、空氣渦流混合器42、和洗滌容量調節(jié)器39。以上參考申請中公開的緩沖加熱器已被去除。整體液體組件22(圖2)優(yōu)選制成能容納許多液體的接收器，像ISH分析所需要的，包括SSC、DI水，和細胞調節(jié)緩沖劑。容積調節(jié)噴嘴39是制成可使用多種液體的。
本發(fā)明的方式與美國專利申請序號No.08/995052中公開的方式不同，其中，在使用了洗滌緩沖劑后從片上被擦掉，以致使其不稀釋下一次使用的試劑。本發(fā)明噴嘴36的目的是將液體噴射到載片的端部，由此形成液體真空從而引起通過毛細作用而抽吸液體。
定義本文中所用的如下術語具有如下意義“組織”是指能夠安裝在標準玻璃顯微鏡載片上的細胞集合體，包括，并不僅限于，器官切片、腫瘤切片、體液、涂片、凍片、細胞學制劑、和細胞系。
“目標的分子”是指在細胞中發(fā)現的可檢測的分子，包括，但不僅限于核酸，蛋白質、碳水化合物、脂類、和小分子。
“染色”是指任何生物的或化學的實體，當應用到組織中的目標分子上時，使得分子在顯微鏡下可以檢測。染色包括，但不僅限于可檢測的核酸探查物，抗體，和染料。
“進行處理”或“處理”都是指對組織使用染色，以及與這些使用有關的其他工藝方法，包括，并不限于，加熱、冷卻、洗滌、漂洗、干燥、蒸發(fā)抑制、脫蠟、調節(jié)細胞、混合、培育，和蒸發(fā)。
“使自動化”或“自動化”是指活動主要由計算機或機器驅動完成，基本沒有人工介入。
應用和操作在操作中，裝置10可用于進行就地雜化(ISH)，就地PCR，免疫組織化學分析(IHC)，以及各種化學(非生物的)的組織染色技術。而且，本發(fā)明的加熱系統(tǒng)，在單一運行時，不管它們要求不同的溫度，仍可以使用上述技術中的2種或多種。
就地雜化顯然是一項使用本發(fā)明而有利應用的技術，它可以單獨地，也可以與其他技術組合地使用，由于ISH分析中的許多步驟，在精確的時間周期內必須仔細控制溫度，對于充分地使DNA變性，在精確的時間的周期內需要精確的加熱量，以使之產生后續(xù)的雜化，而不使過熱到使細胞形態(tài)降解的溫度點。不同的樣品對于變性要求不同的溫度，這取決于怎樣去制備和固定組織。變性，雜化，和后繼雜化洗滌等步驟，都要求單獨的溫度，這取決于要試驗的探查物和組織的特定要求，這些溫度要求如上述討論的可通過加熱器的單個控制面進行控制。DNA探查物要求，并主要是在30～55℃間進行雜化，而RNA探查物主要是在高溫下雜化，雜化時間從30分鐘到24小時，這取決于目標拷貝數，探查物大小和樣品類型，對于細胞遺傳學制劑的標準變性是在約72℃下進行2分鐘，而對于組織片段，條件是從55℃～95℃,2～30分鐘。后繼雜化洗滌溫度，從37℃～72℃，2～15分鐘，鹽濃度為0.1×～2×55C。探查物檢測溫度，可從環(huán)境溫度變到42℃,2～30分鐘。
低重量的平板60和加熱器能使載片迅速地加熱和冷卻，結果使載片上的組織也加熱(即，在180秒內，從37℃～95℃)。加熱和冷卻的迅速增加，可增加就地變性的效率。通過迅速加溫促使探查物迅速退火到目標，使探查物特性增加，伴隨而來的是，本底降低，所得試驗的質量大大改進。ISH可以用于檢測DNA，cDNA，和高復制的mRNA也可以應用于涂片、組織、細胞系，和冷凍片段。通常，將樣品固定在1″×3″的玻璃載片上。
DNA的雜化或變性對于組織染色過程是絕對需要的，要求溫度迅速達到92-100℃，并進行精確地控制和維持，熱平臺使顯微鏡載片上的待處理組織，在低于180秒內達到所要求的溫度范圍，其精確度為±2℃。在雜化組織中迅速降低溫度對成功的染色和診斷也是重要的。為使要求的溫度在420秒以內達到37℃，可以加入風扇或其他快速冷卻的特征。
本發(fā)明的裝置可以在同一次試驗中放置多種類型的樣品并進行ISH試驗，而不必考慮每個ISH試驗的單獨要求(即，雜化溫度37-45℃的嚴格要求，和洗滌濃度)。該系統(tǒng)在同一試驗中可對不同載片進行一個以上的化學檢測。本文所用的“ISH”包括熒光檢測(FISH)和非熒光檢測(例如，明視野檢測)。
也可以使用裝置10，以對某組織片段同時使用ISH和IHC染色，而可在同時觀察遺傳變異和蛋白變異。這是有利的，例如，在檢測乳腺腫瘤切片中，對于HER-2/neu的基因增殖和蛋白質表現，兩者都已評價為具有臨床的意義，參看Oncologist 1998；323 7-253,Ross等人的“The Her-2/neuOncogene in Breast Cancer”。
通過加熱平臺的迅速加熱和冷卻使得本發(fā)明也能夠用于就地PCR(聚合酶鏈反應)，該反應要求高和低溫度的重復循環(huán)。PCR的限定是要求在增殖之前提取目標DNA或RNA，以排除相關分子導致樣品的細胞學或組織學的特征。就地PCR排除了因ISH的細胞定位能力與PCR的極端敏感性相結合而受的限制。該技術已描述于Nuovo等人的美國專利No.5538871中，引入本文作參考。
裝嵌在石蠟中的片段，第一步要求對裝嵌組織進行脫蠟。使用加熱平臺，排除使用苛刻的化學藥品，如二甲苯，通過使用精確控制的各個載片的加熱，使嵌入組織中的石蠟溶出，漂浮在水溶液中，再將它漂洗出去。石蠟的密度低于水，一旦液化，通過液體緩沖劑上升到組織樣品上面，并漂浮在該液體頂部。然后，將液體石蠟從顯微鏡載片中除掉，并通過液體流而離開組織樣品，它可以是液體或氣體，在液體石蠟上面，該步驟的詳細情況已公開于美國專利申請序號No.60/099018中(1998,9,3遞交)，引入本文作為參考。也可以使用類似技術以去除嵌入材料，不是石蠟，而是如塑料，雖然加入蝕刻試劑是必要的。
已發(fā)現在適當的水溶液中用加熱平臺50以加熱組織能夠改進對細胞中的目標分子(蛋白質、核酸、碳水合物、脂類、或小分子)染色的可達性。通過因保藏組織中所用的乙醛的分子交聯或固定劑引起的確定中的其他變化，而可能引起的缺乏可達性，由于抗原蛋白的化學變態(tài)，抗原的交聯會使抗原性喪失。這種改進(生物的或化學的)對目標分子染色的可達性的方法本文中稱為“細胞調節(jié)條件”。對于DNA目標，優(yōu)選的調節(jié)溶液是檸檬酸鹽緩沖劑，優(yōu)選的溫度可高達約95℃，優(yōu)選的加熱時間約為1小時。對于蛋白目標，優(yōu)選的調節(jié)溶液是檸檬酸鹽緩沖劑，優(yōu)選的溫度高達100℃，約42分鐘。使用加熱平臺加熱組織樣品可降低乙醛處理組織中的交聯度，這樣改進的抗原通過相應抗體而逆轉到可識別的形式，因此提高了染色。對于RNA目標，優(yōu)選的調節(jié)溶液是檸檬酸鹽緩沖劑，優(yōu)選的溫度高達75℃，約1小時，作為細胞的調節(jié)溶液，可以使用許多替代物取代檸檬酸鹽緩沖劑。這種溶液的目錄列于Analytical Morphology,Gu,ed,Eaton PublishingCo.(1997).PP.1-40。溶液一般是已知的克分子濃度、PH、和組成。優(yōu)選向調節(jié)溶液中添加十二烷基硫酸鈉鹽(SDS)、乙二醇。
用本發(fā)明的裝置完成的就地雜化(ISH)、就地PCR、免疫組織化學(IHC)、免疫化學(HC)，或酶化學(EHC)方法，主要包括如下步驟。
1)將條形碼加到指明就地雜化、就地PCR免疫組織化學、免疫化學、或酶化學的過程的載片而制備載片。
2)將一批載片插入裝置中，將每個載片裝到載片支架上。
3)關閉裝置，開始處理過程。
4)如果載片要在裝置被脫蠟而作為予處理，則每個載片將干燥加熱到60℃以上，隨后干燥加熱，用約7ml的DI水洗滌載片，殘留下約300μl的水溶液，然后用約600μl的蒸發(fā)抑制液覆蓋各片，再使各載片在60℃以上保持6分鐘，然后再用約7ml DI水漂洗，再用600μl蒸發(fā)抑制液覆蓋。溫度降低到37℃。載片已被脫蠟，并準備作為指出過程的下一項。
5)要細胞調節(jié)的各載片，用約7ml DI水漂洗滌。裝置中容積減少的固定物，從300μl殘存容積降到約100μl，使用裝置中的容積調整的定位器，將200μl細胞調節(jié)溶液加到載片上，然后，載片將接受約600μl的蒸發(fā)抑制液，載片溫度將升高到37～100℃范圍的預定溫度，而流體循環(huán)將開始，并每6-8分鐘重復循環(huán)，時間達2小時，如在方案中設定的，將各載片冷卻到37℃，并用約7ml APK洗滌液漂洗。在這時，各載片可為指出過程的下一項備用。
6)當各載片暫停在試劑應用區(qū)時，適宜的試劑容器由試劑圓盤傳送帶移動到試劑應用站。向載片上提供計量容積的試劑。試劑液體通過蒸發(fā)抑制液層而到達位于下面的液層。
7)然后載片的圓盤傳送帶開始，將各載片直接移動到渦流混合站的前面，渦流混合器噴射攪動在蒸發(fā)抑制液層下面的載片表面上的試劑。
8a)對就地雜化如果方法需要蛋白質消化，則將各載片用約7ml APK洗滌漂洗，殘留～300μl的緩中劑。然后，載片再接受～600μl的蒸發(fā)抑制液，重復步驟6和7中描述步驟，以消化酶的應用。37℃下，可選擇的培育時間為2～32分鐘。各載片用～7ml的2×SSC緩沖液漂洗，殘留～300μl緩沖劑，使用容積減少的固定物使容積從～300μl降到～100μl。重復6-7中描述的步驟以使用探查物。然后，載片接受～600μl的蒸發(fā)抑制液，升高載片溫度到37℃～95℃范圍的特定溫度，以使目標物和/或探查物分別變性或伸展。
可選擇的培育時間為2分鐘到18小時。
使用雜化后開始漂洗，使用者嚴格選擇，包括可選擇的鹽濃度，為2×,1×,0.5×,0.1×SSC，溫度范圍37～75℃。
隨后探查步驟，用1×APK洗滌緩沖劑洗滌各載片，然后接收～600μl的蒸發(fā)抑制液。在某些標記的探查物中，就如在FISH中那樣，直接檢測探查物，并使用下面的適當檢測技術，對ISH用抗半抗原抗體間接檢測。
如果要求凈化，則在對探查物的檢測步驟之后，用DI水漂洗各載片，并用去污劑凈化各載片的蒸發(fā)抑制液。再次用DI水漂洗各載片，并使用容量降低定位器去除殘留的容量。在37℃或高于37℃下，加熱干燥各片，直到所有水份從組織、細胞或涂片中蒸發(fā)掉。
8b)對就地PCR如果方法要求蛋白質消化，則將各載片用～7ml的APK洗液漂洗，殘留～300μl的緩沖劑。然后，載片接受～600μl的蒸發(fā)抑制液，重復步驟6和7中所述步驟以消化酶的應用。37℃下可選擇的培育時間范圍為2分鐘到32分鐘。
各載片用～7ml的DI水漂洗，殘留～300μl的緩沖劑，使用容積減少定位器，使容積從～300μl降到～100μl。重復步驟7中所述步驟以加強試劑的應用。為在37℃或之上輸送到100μl殘留的載片容積，配置加強試劑。然后，載片將接受～600μl的蒸發(fā)抑制液。在2分鐘以上，將載片溫度升高到37～95℃的特定溫度范圍，開始PCR反應，加熱循環(huán)達到30個循環(huán)，由55℃的1.5分鐘開始到89℃的45秒。
在就地PCR之后，各載片進行就地雜化，如在有關部分中描述的。
8c)對IHC、HC、EHC的方案，將各片用～7ml的1×APK洗液或適當緩沖劑進行漂洗，殘留～300μl的緩沖劑?？梢允褂没虿皇褂萌莘e減少定位器，使容積從～300μl降低到～100μl。然后，載片將接受～600μl的蒸發(fā)抑制液。重復步驟7中所述步驟以使用抗體或其他試劑。
可選擇的培育時間范圍為2～32分鐘。
可選擇的培育溫度范圍為37～95℃，這取決于是否要求細胞調節(jié)或脫蠟。
整個工藝，各載片都用1×APK洗液或適當的緩沖劑進行漂洗，然后接受～600μl的蒸發(fā)抑制液。當用熒光時，蛋白質、碳水化合物、和酶可直接標記，或者使用適當的檢測技術間接地標記。在規(guī)定的染色工序結束時，制備載片以用自動凈化工序以蓋玻片、已蓋玻片、在顯微鏡下觀察以適當染色，它們是DNA/RNA、蛋白質、碳水化合物或酶。
以上列出的工序，包括各步驟的順序，各試劑的應用，和上述溫度參數，優(yōu)選是由生產者預先編好的程序輸入到主機內。某些參數，如反應時間，可由使用者任意變動的。試驗的初始程序是靈活的，足以允許方案的復雜操作，并在將探查物添加到目標組織或樣品之前或之后添加多種試劑(5-6種試劑)。
在試驗運行中或運行之間，溫度控制為目標溫度的±1％，并如上已描述的可以控制。操作者在同一試驗中可進行多個復合的ISH方案，這包括能夠對ISH方法設計方案程序，該方法是在相同的變性溫度下運行。同樣，該系統(tǒng)也便于操作者校正載片溫度，而不必使裝置有重大拆卸。通過可靠的選取而保護使用者限定的ISH方案的方案變化。該系統(tǒng)對于載片和試劑系統(tǒng)是條形碼驅動。也還有一個選擇余地，操作者對所有主要的硬件功能可進行人工控制，包括試劑分配、洗液分配、液蓋片(高低溫度)分配、載片的轉位和溫度控制，這就使使用者有助于查找故障。使用者限定的方案可使操作者控制反應各相的溫度，除了檢測溫度。軟件包括預先編制的優(yōu)化方案存儲在軟件中，以使連續(xù)引入優(yōu)化的全部探查物。
實施例以下非限定性的實施例是進一步說明本發(fā)明并其詳細使用和應用實施例1使用自動的就地雜化對人類papaloma病毒的高危害菌株的檢測一種頸涂片，通過標準收集裝置，如細胞刷或Thin PrepTM載片法(CytecInc)收集的，通常用巴帕尼科拉烏染劑(papanicolau)染色法染色(PapSmear)，用探查物就地雜化設置特定的高危害HPV型菌體。將樣品載片按照本發(fā)明裝入裝置的載片夾持器上(以下稱“染色裝置”)。設置該系統(tǒng)運行HPV就地程序。該程序完成就地反應的所有步驟，一旦程序開始，不需要來自使用者的介入。
染色裝置首先進行載片的予處理室溫下，1×APK(10×APKVentana P/N250-042)漂洗和使用CoverslpTM，然后，在37℃下，用蛋白酶I(Protease 1)進行4分鐘的蛋白酶消化，隨后以2×SSC漂洗步驟。2×SSC漂洗后，使殘留的載片容積從300μl減少到約100μl，并使用CoverslipTM。從Ventana確定分配器向載片中加入與雜化溶液予混合(cocktail premixed)的FITC-標記DNA探查物合劑，使樣品和載片加熱到72℃，4分鐘，對探查物和樣品DNA進行變性。然后染色裝置迅速將載片溫度降至37℃,37℃下雜化2小時。染色裝置從載片上去除探查物混合物和CoverslipTM，并進行后雜化洗滌。向載片添加后雜化洗液(2×SSC)和蓋片(coverslip)，裝置將載片加熱到45℃,10分鐘。染色裝置去除后雜化洗液，并開始檢測步驟。首先，染色裝置用1×APK漂洗各載片，并施加蓋片。然后，由分配器向載片施加抗-FITC(SerotecP/N MCA1320)抗體，并將載片培育20分鐘，同時加熱載片37℃，接著通過APK漂洗和使用蓋片，加入生物素標記的第二抗體，并在37℃下培育8分鐘，接著也進行APK漂洗，使用蓋片，將Streptavidin-Alkaline磷酸鹽共軛物放置在載片上，染色裝置將載片在37℃下培育30分鐘，APK漂洗后，向載片加入Ventana Blue檢測劑，并在室溫下培育20分鐘，Ventana Blue Kit(P/N760-060)是生物素標記的第二抗體、Streptavidin-Alkaline磷酸酶和NBT/BCIP基質。用DI水漂洗片，利用裝置加熱干燥載片，在這點，在片上施加核速紅(Nuslear Fast Red)復染劑，室溫下培育5分鐘，載片再用水漂洗。
實施例2利用自動就地雜化對石蠟內嵌組織中的埃-巴二氏病毒(EBER)的mRNA進行檢測將脾(Spleen)#EBV 37A切成5μm的切片，并放置在超過霜凍(supperfrost)的玻璃染色片上。將樣品載片按照本發(fā)明裝置載到裝置的載片夾具上(以后本文稱為“染色裝置”)。將染色裝置程序編制以就地設計進行EBER。該程序將完成就地反應的所有步驟，一旦程序開始，不要求使用者的介入。
染色裝置首先進行脫蠟將各載片干式加熱到65℃，6分鐘，室溫DI水漂洗載片，殘留300μl容積和600μl液蓋片，防止蒸發(fā)并保護載片樣品不干燥，溫度保持在65℃以熔掉石蠟。用DI水漂洗載片完成細胞調節(jié)，然后，降低殘留容積，并加入200μl細胞調節(jié)緩沖劑(檸檬酸鹽緩沖劑)和600μl液體CoverslipTM，將載片加熱到75℃,40分鐘內每8分鐘重新施加一次調節(jié)緩沖劑和CoverslipTM，將載片溫度冷卻到37℃，并用室溫的1×APK洗液(Ventana 10×APK P/N250-042)漂洗載片，留下≈300μl殘留載片容積，并施加≈600μl液體蓋片。在37℃下用蛋白酶I(Protease 1)(Ventana P/N250-2018)進行8分鐘的蛋白酶消化。消化之后，用室溫2×SSC(20×SSCVentana P/N650-012)漂洗載片，使用染色裝置中的容積減少定位器，將殘留載片容積從≈300μl降到≈100μl，并向載片施加≈600μl的液體蓋片，用于目標mRNA進行EBER的Dig-標記的(Boehringer Mannheim cat#1417231)寡核苷酸探測劑，與雜化溶液進行混合，并將試劑放置進Ventana使用者限定的分配器(Ventana P/N 551-761)中。向樣品施加探測劑，并將載片加熱到75℃,4分鐘，使寡核苷酸和樣品mRNA解鏈，染色裝置將載片溫度調到37℃，以雜化2小時，染色裝置從載片上去除探測劑溶液和CoverslipTM，并進行3次后續(xù)雜化洗滌。后續(xù)雜化洗液包括在42℃下用2×SSC洗滌載片4分鐘，然后用1×SSC,42℃下洗滌4分鐘，最后42℃下用0.5×SSC洗滌4分鐘。然后，染色裝置進行檢測步驟。用1×APK洗滌載片，并施加蓋片。向載片施加抗-Dig抗體(Sigma P/ND-8156)，并在37℃下培育16分鐘，接著用1×APK洗滌并使用CoverslipTM。然后向載片加入生物素標定的第二抗體，在37℃下培育8分鐘，接著用1×APK洗滌和使用蓋片，第二抗體后，施加Streptavidin-Alkaline磷酸鹽共軛物，并在37℃下培育30分鐘。在APK洗滌和使用蓋片后，向樣品施加Ventana Blue檢測試劑，并在37℃下培育20分鐘。然后將載片用水洗滌，并用裝置加熱干燥，生物素標定的第二抗體、Streptavidin-Alkaline磷酸酶，和檢測試劑是Ventana Blue Kit(Ventana P/N 760-060)的組份。樣品脫水后，用玻璃蓋片蓋住載片，并進行顯微鏡觀測。
雖然本文描述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方案，但是，很明顯，本技術領域的技術人員對所述實施方案的變動和改進，不偏離本發(fā)明的精神和范圍的都歸屬于本發(fā)明。因此，認為本發(fā)明是僅限定到所附權利要求和法律適用條款所要求的范圍。
權利要求
1．一種對載帶在許多載片上的組織樣品進行處理的方法，包括對所述各載片提供多個加熱器用以加熱，其中，每個載片的溫度可獨立控制，和處理所述組織樣品，其中，所述處理包括至少通過所述加熱器之一加熱一載片。
2．根據權利要求1的方法，其中所述處理步驟還包括使用選自核酸探測劑、核酸引物、抗體和染料中的一種可檢測的染色。
3．根據權利要求1的方法，其中所述的處理步驟還包括選自洗滌、漂洗、干燥、覆蓋、混合、培育、和冷卻中之一的自動過程。
4．根據權利要求1的方法，其中至少所述加熱器中之一能夠將載片加熱到至多達94℃的溫度。
5．根據權利要求1的方法，其中所述組織樣品是選自腫瘤切片、器官切片、冷凍切片、體液、涂片、細胞學制劑、和細胞系中的樣品。
6．根據權利要求1的方法，其中所述處理步驟還包括施加流體以去除石蠟的步驟。
7．一種向多個生物材料自動施加的裝置，該裝置包括對多個載片中的每一個的單獨加熱單元，其中，每個單獨加熱單元具有監(jiān)測和控制生物材料溫度的裝置。
8．加熱生物材料的裝置，包括固定到平臺上的多個加熱器，其中每個所述加熱器都進行熱隔離，防止來自相鄰加熱器的熱傳遞。
9．根據權利要求8的裝置，其中所述平臺是圓盤傳送帶。
10．一種同時處理二個或多個裝有組織樣品的載片的方法，包括步驟(ⅰ)配有二個或多個加熱單元以對需要處理的載片進行加熱，其中每個單元的溫度由計算機單獨控制，(ⅱ)用所述處理的溫度參數編制計算機程序；(ⅲ)從計算機選擇二個或多個要進行的處理；(ⅳ)同時進行所述處理。
11．根據權利要求10的方法，其中所述的處理選自DNA變性、DNA復原，探測劑雜化、和后雜化洗滌。
12．一種從固定在載片上的組織切片中去除內嵌介質的方法，包括步驟(a)加熱載片，和(b)自動向載片施加流體流。
13．一種改進對固定到載片上細胞中的目標分子的染色的可達性的方法，包括步驟(a)加熱載片，和(b)自動向載片施加水溶液。
14．一種進行就地PCR的方法，以對固定在顯微鏡載片上的細胞中的目標核酸進行擴增，包括步驟有(a)提供權利要求7的裝置；(b)向所述細胞施加一組PCR試劑；(c)使用所述加熱單元以使所述細胞受到熱循環(huán)，足以擴增目標核酸；知(d)檢測所述擴增的目標核酸。
15．一種用于對多個顯微鏡載片保持不同目標溫度的顯微鏡載片加熱系統(tǒng)，包括用于多個載片的每一片產生熱輸出的加熱單元，用于多個載片的每一片的溫度傳感器；和與溫度傳感器連通的處理器；和用于對多個載片的每一片改變加熱單元熱輸出的裝置，用于改變與處理器連通的裝置。
16．權利要求15中的顯微鏡載片加熱系統(tǒng)，其中用于改變加熱的裝置包括用于改變加熱單元的工作循環(huán)的裝置。
全文摘要
本發(fā)明提供一種自動操作對多個固定在顯微鏡載片(37)上的組織樣品進行染色或處理的裝置和方法,根據本發(fā)明通過加熱系統(tǒng)單獨進行各載片的溫度控制,該裝置包括輻射狀固定在用于加熱各載片(37)和傳感每個溫度的圓片傳送帶(34)上的加熱平臺(64),如果需要,加熱系統(tǒng)也能自動脫蠟。
文檔編號G01N35/10GK1297529SQ99805028
公開日2001年5月30日 申請日期1999年2月26日 優(yōu)先權日1998年2月27日
發(fā)明者威廉·理查茲, 查爾斯·D·萊米, 金伯利·克里斯坦森, 埃塞爾·R·麥克雷 申請人:文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司