專利名稱：測(cè)定骨吸收速率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定骨吸收速率的方法，特別是其免疫分析方法。本發(fā)明進(jìn)一步涉及診斷與骨吸收速率改變有關(guān)疾病(例如骨質(zhì)疏松癥)的方法以及該方法所采用的測(cè)試盒(test-kit)。本發(fā)明還涉及檢驗(yàn)藥物治療與骨吸收速率增加有關(guān)疾病效果的方法以及對(duì)所述疾病具有易感性對(duì)象的篩選方法。本文中公開了骨吸收速率特異性指標(biāo)的用途。
現(xiàn)存在幾種與骨吸收速率改變有關(guān)的疾病，最普遍的是骨質(zhì)疏松癥，它多發(fā)生在絕經(jīng)后的婦女身上。骨質(zhì)疏松癥是由骨質(zhì)丟失引起的，其導(dǎo)致骨架脆弱，很容易骨折。骨折及其它與骨質(zhì)疏松所引起的疾病治療對(duì)社會(huì)來說尚需要很高的耗費(fèi)，更不用說治療對(duì)象本人。因此需要對(duì)患有骨質(zhì)疏松的人群進(jìn)行診斷以防止嚴(yán)重后果的發(fā)生。目前已能成功地治療骨質(zhì)疏松癥，例如采用雌三醇替代方法或雙膦酸酯治療方法。
測(cè)定骨密度有幾種儀器和方法。然而，所用的儀器和操作均非常昂貴，因?yàn)槠湫枰^大的空間和較多的人員，同時(shí)測(cè)定非常緩慢需要有耐心。由于就骨質(zhì)疏松癥而言，人口的年齡分布愈發(fā)不容樂觀，因此開發(fā)特異、迅速、簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的體外骨密度測(cè)定方法尤為重要。
實(shí)質(zhì)上，骨中含有兩種主要的細(xì)胞類型，骨形成成骨細(xì)胞以及骨吸收破骨細(xì)胞。正常情況下，這兩種細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，破骨細(xì)胞吸收的骨細(xì)胞數(shù)量與成骨細(xì)胞形成的骨細(xì)胞數(shù)量相同。骨質(zhì)疏松是由于破骨細(xì)胞的活性增加，破骨細(xì)胞吸收的骨細(xì)胞數(shù)量比成骨細(xì)胞所產(chǎn)生的骨細(xì)胞數(shù)量要多，從而導(dǎo)致了失調(diào)。
根據(jù)其電泳流動(dòng)性，抗酒石酸磷酸酯酶(TRAP，EC3.1.3.2.)屬于5型酸性磷酸酯酶，因此，又稱為5型酸性磷酸酯酶。借助酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳至少可以鑒別出7種酸性磷酸酯酶。這些酶之中酸性最強(qiáng)的是位于帶5處的酸性磷酸酯酶(Acp5)，它是唯一可以抵抗酒石酸抑制的酶，因此又稱為TRAP。此酶為堿性糖蛋白，其在分子的活性部位含有旋轉(zhuǎn)-偶合的鐵單位。TRAP的雙核鐵單位含有兩個(gè)鐵(Ⅲ)離子，其使得蛋白變紫，因此又叫作紫色酸性磷酸酯酶。此蛋白的分子量為32kd。當(dāng)用β-巰基乙醇還原該酶時(shí)，其中的一個(gè)鐵(Ⅲ)離子被還原，酶變成粉色。TRAP可以在體外用作蛋白酪氨酸磷酸酯酶，它的氨基酸序列含有與磷酸蛋白磷酸酯酶相類似的部位。然而尚不知道它的天然底物。
酪氨酸磷酰化對(duì)于許多細(xì)胞的功能和鑒別來說是一種重要的調(diào)節(jié)機(jī)制。一般認(rèn)為TRAP在破骨細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)方面起著重要作用。已知TRAP能夠產(chǎn)生羥基基團(tuán)，后者能夠與天然的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)并使之破壞掉。在骨吸收過程中，破骨細(xì)胞產(chǎn)生游離的氧基團(tuán)，很顯然在骨吸收過程中它們是很顯著的。它們的來源尚屬未知，但似乎至少部分的羥基基團(tuán)是由TRAP產(chǎn)生的。正常情況下，含有TRAP的兩種類型細(xì)胞(即破骨細(xì)胞和小泡巨噬細(xì)胞)吸收化合物并使之降解。這一共同的特征有利地支持了TRAP參與骨吸收過程的假設(shè)。
Hayman，A.R.等人(進(jìn)展1223151-3162，1996)通過小鼠體內(nèi)TRAP基因的靶破壞調(diào)查了TRAP的作用。他們發(fā)現(xiàn)，缺乏基因的小鼠的軟骨內(nèi)骨化作用被破壞并有輕度的骨硬化。他們的結(jié)論是在骨生長(zhǎng)過程中需要TRAP進(jìn)行正常的軟骨礦化，TRAP還可以通過對(duì)骨基質(zhì)吸收的關(guān)鍵貢獻(xiàn)保持成人骨骼的完整性和靈活性(turnover)。
在正常的人體中，含有明顯量TRAP的細(xì)胞僅有破骨細(xì)胞和活性巨噬細(xì)胞。在某些病理情況下，在其它細(xì)胞中也能發(fā)現(xiàn)TRAP?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，TRAP是在骨吸收過程中從破骨細(xì)胞分泌到血液循環(huán)中的，因此建議血清中的TRAP的濃度可以作為骨吸收的指標(biāo)。人們還發(fā)現(xiàn)血清中TRAP的濃度與骨吸收的速率相關(guān)(Kraenzlin M.E.等人，臨床內(nèi)分泌和代謝雜志71(2)442-451，1990；Cheung C.K.等人，臨床化學(xué)，41(5)679-686，1995；Chamberlain P.等人，臨床化學(xué)，41(10)1495-1499，1995以及Halleen J.等人，骨和礦物研究雜志，11(10)1444-1452，1996)。
1978年，Lam W.K.等人，臨床化學(xué)，24(7)1105-1108，1978)報(bào)告了成人和兒童血清中TRAP生化性質(zhì)的研究結(jié)果。通過改進(jìn)的電泳方法，他們發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)明顯的TRAP帶，并將它們指定為5a和5b。TRAP 5a比TRAP 5b更適宜較低的pH環(huán)境。在人類的血清中，兩種酶形式TRAP 5a和TRAP 5b均可找到。成人和兒童體內(nèi)TRAP 5a的量是恒定的，但TRAP 5b的量在兒童體內(nèi)有所提高。
在另一篇論文中(Chen等人，臨床化學(xué)，25，719-722，1979)，同一個(gè)研究小組進(jìn)行了正常兒童血清中高酸性磷酸酯酶活性顯著性的研究。他們發(fā)現(xiàn)在巨細(xì)胞腫瘤中存在相應(yīng)于帶5 TRAP的血清TRAP活性，但在成骨細(xì)胞和肉瘤中則不存在，這一結(jié)果表明，TRAP是從破骨細(xì)胞中衍生出來的。
W.K.W.Lam等人(臨床生物化學(xué)，14，177-181，1981)從患有Gaucher疾病的病人的血清和脾臟中分離TRAP。他們指出Gaucher疾病的血清中含有帶5b，而Gaucher疾病的脾臟中含有帶5a。帶5a和帶5b含有可以識(shí)別的蛋白結(jié)構(gòu)。借助唾液酶從5a上除去碳水化物可以將其轉(zhuǎn)化為5b，這一結(jié)果表明，5a和5b結(jié)構(gòu)上唯一有區(qū)別的是在5a上存在唾液酸殘基，而5b中不存在。兩種形式適宜的pH環(huán)境不同，5a為5.0，5b為5.5-6.0。
W.K.W.Lam和R.J.Desnick(臨床和生物研究進(jìn)展95，267-278，1982)對(duì)Gaucher疾病中的帶5形式進(jìn)行了進(jìn)一步研究。他們還總結(jié)了正常和病理狀態(tài)標(biāo)本中酸性磷酸酯酶的電泳特征。結(jié)果顯示，在正常的血清中，存在痕量的帶5a和5b，在任何病理血清中均未發(fā)現(xiàn)帶5a的水平有所提高。代之出現(xiàn)的是破骨細(xì)胞骨腫瘤中、發(fā)生骨惡性轉(zhuǎn)移的治療對(duì)象血清中以及患有Gaucher疾病的病人血清中帶5b的量有所提高?；谶@些結(jié)果，研究者得出以下結(jié)論血清酸性磷酸酯酶(特別是其5b形式)的水平依賴于破骨細(xì)胞的生理活性。然而他們也指出還需要進(jìn)一步的證據(jù)來支持這一假設(shè)。從論文中可以看到的另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是這兩種酶(帶5a和5b)是密切相關(guān)的并具有抗原一致性。根據(jù)這一陳述，無法找一種既能測(cè)定5a又能測(cè)定5b的特異性免疫分析方法。1982年之后，沒有人再對(duì)TRAP 5a和5b的來源進(jìn)行進(jìn)一步的研究，所提出的5b破骨細(xì)胞的來源尚未證實(shí)。
借助分光光度法可以測(cè)定TRAP的活性，例如在酒石酸存在下，加入對(duì)硝基苯基磷酸酯(pNPP)作為底物(酒石酸可以抑制其它大多數(shù)酸性磷酸酯酶)。但是這個(gè)方法的特異性不是很好，因此發(fā)展了一些更具特異性的測(cè)定TRAP方法，例如免疫分析方法。
Stepan J.J.等人(Biochem.Biophys.Res.Commun.1651027-1034，1989)以及Kraenzlin M.E.等人(臨床內(nèi)分泌和代謝雜志71(2)442-451，1990)發(fā)展了TRAP免疫分析方法，其采用的是針對(duì)TRAP而得到的多細(xì)胞系抗體，上述TRAP是從患有多毛細(xì)胞白血病治療對(duì)象的脾臟中純化得到的。他們提出這種分析方法對(duì)于檢測(cè)患有礦物質(zhì)代謝失調(diào)的治療對(duì)象是很有用的。
Cheung C.K.等人(臨床化學(xué)，41(5)679-686，1995)公開了TRAP的免疫分析方法，其采用的是針對(duì)TRAP而制備得到的多細(xì)胞系抗體，上述TRAP是從索血漿(cord plasma)中分離得到的。他們發(fā)現(xiàn)兒童體內(nèi)TRAP濃度顯著高于絕經(jīng)后的婦女，并討論了將TRAP作為評(píng)價(jià)骨骼靈活性(turnover)的可能性。
還有針對(duì)人類骨頭中分離并純化得到的TRAP制得的多細(xì)胞系抗體。其再一次被證明兒童和絕經(jīng)后婦女的血清中TRAP濃度有所提高(Halleen J等人，骨和礦物研究雜志，11(10)1444-1452，1996)。
Chamberlain P.等人(臨床化學(xué)，41(10)1495-1499，1995)公開了使用一對(duì)單克隆抗體進(jìn)行的兩步血清免疫分析方法，其由重組生成的TRAP而得。這些單克隆抗體可以識(shí)別TRAP不同的表位，從而使得分析較為敏感。
迄今為止所有公開的免疫分析方法均是測(cè)定血清中的總TRAP濃度。然而，本發(fā)明是基于以下這樣一個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于骨吸收來說，TRAP5b比起總TRAP來說是一個(gè)特異性更高的生化指標(biāo)。在這一點(diǎn)上應(yīng)該指出的是盡管均被指定為5a和5b，上文中Stepan等人和Kraenzlin所報(bào)道的TRAP異構(gòu)體不應(yīng)與上文中Lam等人所報(bào)道的TRAP異構(gòu)體相混淆。
因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是利用TRAP 5b作為骨吸收的特異性指標(biāo)。
本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供特異并簡(jiǎn)單的測(cè)定骨吸收速率的方法，特別是提供能夠診斷與骨吸收速率明顯改變有關(guān)的疾病，例如骨質(zhì)疏松癥或其它骨代謝疾病、骨損傷或骨轉(zhuǎn)移。
本發(fā)明進(jìn)一步的目標(biāo)是能為易感或患有這些疾病的對(duì)象提供骨吸收的檢測(cè)的方法，并且能夠追蹤他們的治療效果。
本發(fā)明還有一個(gè)目標(biāo)是提供所述方法中使用的試劑盒。
在免疫分析方法中使用耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)作為骨吸收速率的指標(biāo)可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
因此本發(fā)明提供了用于測(cè)定治療對(duì)象骨吸收速率的免疫分析方法，其特征在于對(duì)來自所述治療對(duì)象體液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進(jìn)行測(cè)定，TRAP 5b的量可以反映出骨吸收的速率。
特別地，其提供了測(cè)定治療對(duì)象骨吸收速率的免疫分析方法，該方法包括以下步驟(a)通過使存在于體液樣品中的TRAP與抗體(其可以和總TRAP結(jié)合，包括TRAP 5a和TRAP 5b)結(jié)合，測(cè)定治療對(duì)象體液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)。
(b)在pH5.7-6.3下，測(cè)定結(jié)合的TRAP的活性，TRAP活性的量(其主要是TRAP 5b)可以反映骨吸收的速率。
本發(fā)明還提供了能夠診斷與骨吸收速率改變有關(guān)的疾病的方法，其特征在于借助免疫分析方法測(cè)定所述治療對(duì)象體液中的耐酒石酸酸性磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，TRAP 5b的異常量可以反映與骨吸收速率改變有關(guān)的疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測(cè)藥物治療患者體內(nèi)與骨吸收速率增加有關(guān)疾病的效果的方法，其特征在于通過免疫分析方法對(duì)所述治療對(duì)象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進(jìn)行測(cè)定，通過TRAP5b量的降低可以反映出所述藥物的作用。
本發(fā)明還提供了對(duì)與骨吸收速率增加有關(guān)疾病具有易感性的治療對(duì)象的篩選方法，特征在于通過免疫分析方法對(duì)所述治療對(duì)象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進(jìn)行測(cè)定，TRAP 5b水平提高即表示對(duì)所述疾病具有易感性。
本發(fā)明還提供了含有能夠區(qū)分耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)和耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP 5a)抗體的測(cè)試盒(test-kit)，該試劑盒在實(shí)施本發(fā)明方法時(shí)是有用的。
圖表的簡(jiǎn)述

圖1顯示了雌三醇治療對(duì)于血清中總TRAP和TRAP 5b量所產(chǎn)生的作用。
圖2顯示了血清TRAP 5b和骨礦物密度(BMD)之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
當(dāng)TRAP 5b取代治療對(duì)象體液樣品中的總TRAP被特異性地進(jìn)行測(cè)定時(shí)，在TRAP濃度和骨吸收速率之間獲得了顯著良好的相關(guān)。出乎意料的發(fā)現(xiàn)是利用針對(duì)TRAP的抗體在免疫分析中有可能對(duì)TRAP 5b進(jìn)行特異性的測(cè)定。另外還令人吃驚地發(fā)現(xiàn)抗體可以區(qū)分TRAP 5a和TRAP 5b。然而，并不需要本發(fā)明中使用的抗體對(duì)TRAP 5a或TRAP 5b具有特異性，只要是可以識(shí)別總TRAP的抗體就可使用。在這種情況下，兩種形式酶之間的區(qū)分將在與非特異性的抗體反應(yīng)后通過其它手段獲得。例如發(fā)現(xiàn)可在一個(gè)pH范圍內(nèi)測(cè)定TRAP的活性，在這個(gè)范圍下總TRAP的活性實(shí)際上來自TRAP 5b。這些發(fā)現(xiàn)可為診斷初級(jí)及次級(jí)與骨吸收速率改變有關(guān)的骨疾病(例如代謝骨疾病、骨損傷或骨轉(zhuǎn)移，尤其是骨質(zhì)疏松)提供改進(jìn)的方法。測(cè)定TRAP 5b量的方法也可用于檢測(cè)對(duì)骨疾病的治療效果，例如雌三醇雙膦酸酯治療骨質(zhì)疏松的效果。其還可用來篩選對(duì)骨吸收增加具有易感性的人群，對(duì)他們進(jìn)行治療從而防止骨折發(fā)生。
這里所用的‘治療對(duì)象’是指哺乳動(dòng)物，優(yōu)選的是人類。
本申請(qǐng)中使用的‘TRAP’是指耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP，EC3.1.3.2.)，屬于5型酸性磷酸酯酶，包括酶的5a和5b兩種形式。
‘TRAP 5b’是指TRAP酶的b形式，在其烴鏈上缺乏唾液酸，適宜的pH環(huán)境約為5.7-6.0。
‘TRAP 5a’是指TRAP酶的a形式，在其碳水合物(糖)鏈上含有唾液酸，適宜的pH環(huán)境約為4.9。
Lam W.K.W.等人(臨床化學(xué)，24(7)，1105-1108，1978)以及Lam W.K.W.等人(臨床生物化學(xué)，14，177-181，1981)還對(duì)所述的酶作過進(jìn)一步的描述。
優(yōu)選的(但不必需)體液樣品為血液，例如血漿或特別是血清。
在本發(fā)明的免疫分析中，采用了針對(duì)TRAP的抗體。這里的‘免疫分析’是指任何通過抗原-抗體反應(yīng)進(jìn)行化合物測(cè)定的分析。免疫分析可以是直接的或間接的，競(jìng)爭(zhēng)性的或非競(jìng)爭(zhēng)性的分析。其可以是復(fù)合技術(shù)也可以是單一的技術(shù)?？梢詫?duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記以提高檢測(cè)的靈敏度。這些方法的原則在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。
本發(fā)明中所用的‘針對(duì)TRAP的抗體’包括5a和5b非特異性和特異性抗-TRAP抗體。
優(yōu)選的針對(duì)TRAP的抗體是單克隆抗體。所述的單克隆抗體可以是抗體，其可以區(qū)分TRAP 5b和TRAP 5a?！梢詤^(qū)分TRAP 5b和TRAP 5a’的抗體既可是TRAP 5b和TRAP 5a特異性的，或者它們可由所述的特異性抗體與可以識(shí)別總TRAP的抗體的任意組合構(gòu)成，例如TRAP 5b和TRAP 5a。
可以通過幾種途徑利用能夠區(qū)分TRAP 5a和TRAP 5b的抗體來測(cè)定體液中TRAP 5b的濃度。如果采用TRAP 5b特異性的抗體，當(dāng)然可以直接測(cè)定TRAP 5b。但是，優(yōu)選的是將TRAP 5b特異性的抗體與能夠識(shí)別兩種酶(即總TRAP)的抗體結(jié)合使用。在這種情況下，體液的總TRAP首先與能識(shí)別兩種酶的抗體進(jìn)行結(jié)合，然后用對(duì)TRAP5b具有特異性(但不與TRAP 5a反應(yīng))的標(biāo)記抗體檢測(cè)結(jié)合的TRAP5b。
進(jìn)一步可能的是使用對(duì)TRAP 5a具有特異性的抗體與可以識(shí)別總TRAP的抗體的組合。在這種情況下，首先使TRAP 5a與對(duì)TRAP5a具有特異性的抗體進(jìn)行結(jié)合，然后用能夠識(shí)別兩種酶的抗體對(duì)余下的未結(jié)合的TRAP活性(其必定來自TRAP 5b)進(jìn)行測(cè)定。
本發(fā)明方法中所用的抗體可以用任意常規(guī)的方法進(jìn)行標(biāo)記，例如放射標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或熒光標(biāo)記，目的是提高它們的檢測(cè)靈敏度?？股鞍祖溇?生物素基(biotinyl)系統(tǒng)提供了敏感的檢測(cè)。采用Delfia系統(tǒng)獲得了尤其好的結(jié)果，其為時(shí)間-分辨的熒光免疫分析方法，Halleen J等人(骨和礦物研究雜志，111165-1175，1996)以及Hemmila等人(Anal.Biochem.137335-343，1984)曾對(duì)該方法進(jìn)行過描述。進(jìn)一步優(yōu)選的是使用至少兩種不同的抗體，它們可以識(shí)別TRAP不同的表位。此舉可以獲得高度敏感并具有重現(xiàn)性的雙部位(two-site)熒光免疫分析。
本發(fā)明的試劑盒包含能夠區(qū)分TRAP 5b和TRAP 5a的抗體。根據(jù)本發(fā)明，在評(píng)價(jià)骨吸收速率和診斷與骨吸收速率改變有關(guān)的疾病時(shí)，上述試劑盒是很有用的。試劑盒包含可以特異識(shí)別TRAP 5b的抗體，任意地還可以含有識(shí)別總TRAP的抗體。兩外，試劑盒還可以含有可以特異識(shí)別TRAP 5a及總TRAP的抗體，或者其可以包含TRAP 5b特異性抗體或TRAP 5a特異性抗體。優(yōu)選的抗體為單克隆抗體。
根據(jù)本發(fā)明，另一個(gè)可以測(cè)定TRAP 5b活性的方法是在一定的pH范圍內(nèi)于酒石酸存在下，對(duì)酸性磷酸酯進(jìn)行常規(guī)的分光光度測(cè)定(參見Halleen J等人，骨和礦物研究雜志，11(10)1444-1452，1996)，上述pH范圍位于TRAP 5b的酶活性峰范圍內(nèi)，但位于TRAP5a的范圍之外。根據(jù)本發(fā)明者測(cè)定，TRAP 5a的pH適宜范圍約為4.9，TRAP 5b約為5.7-6.0。總TRAP在pH5.5處進(jìn)行測(cè)定。然而現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在TRAP 5a的存在下，測(cè)定TRAP 5b的適宜的pH范圍是5.7-6.3，優(yōu)選的是5.8-6.2，特別優(yōu)選的是6.0-6.2，6.1是最適宜的pH值。盡管分光光度法不能區(qū)分TRAP 5a和TRAP 5b，但在所述的pH范圍下，所測(cè)得的活性實(shí)質(zhì)上均來自TRAP 5b。pH6.1下TRAP 5a的活性僅為pH4.9下活性的20-30％。(如果在沒有TRAP 5a存在下測(cè)定時(shí)，在pH5.9下獲得的TRAP 5b的活性稍高一些)。在pH6.1下，5a活性占總TRAP活性的比例小于10％。因此在pH6.1下，大于90％測(cè)定得到的TRAP的活性來自5b。
在免疫分析中，TRAP 5b和TRAP 5a具有不同的適宜pH值這一優(yōu)勢(shì)可以提供經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)單的TRAP 5b測(cè)定方法。此過程使得非特異性的TRAP抗體(既與5a又與5b結(jié)合)得以利用，即它們首先與體液中總TRAP進(jìn)行結(jié)合。然后用分光光度法等方法在pH范圍5.7-6.3下測(cè)定TRAP的活性，其主要來自TRAP 5b的活性。
碳水合物含量上的不同也可以用來區(qū)別TRAP 5b和TRAP 5a。例如首先使總TRAP與能夠識(shí)別5a和5b的抗體結(jié)合。結(jié)合的總TRAP與標(biāo)記的Galanthus Nivalis凝集素(GNA)或拌刀豆球蛋白A(ConA)植物血凝素，這些物質(zhì)能與具有終端果糖的糖類(例如TRAP5b)結(jié)合，但其不與TRAP 5a結(jié)合，原因是TRAP 5a的糖鏈上具有終端唾液酸。
當(dāng)然在本發(fā)明方法中，可以使用上述過程的任意組合測(cè)定TRAP5b。下列實(shí)施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明但并不限制本發(fā)明。
實(shí)施例1采用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行單克隆抗體的制備。將提純的并用Freund’s輔助劑進(jìn)行過乳化的人類骨TRAP(Halleen J等人，骨和礦物研究雜志，11(10)1444-1452，1996)以兩周的間隔給予BALB/c小鼠4次注射，每次20μg/小鼠。之后將動(dòng)物殺死。將脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系P3-X-63-Ag8.653進(jìn)行雜交，將雜交瘤在HAT介質(zhì)中培養(yǎng)。在抗鼠LgG-包裹的微滴培養(yǎng)皿中培養(yǎng)100μl上清夜，篩選克隆，接著培養(yǎng)人類的骨TRAP。最后，在培養(yǎng)皿中，通過培養(yǎng)200μl反應(yīng)混合物(0.1M乙酸鈉，pH6.0，8mM pNPP以及40mM酒石酸鈉)對(duì)結(jié)合酶的活性進(jìn)行1小時(shí)測(cè)定。加入16μl 0.5M氫氧化鈉終止反應(yīng)。在405nm處用ELISA平皿讀數(shù)儀測(cè)定吸收。獲得了兩種TRAP單克隆抗體，O1A和JIB。這兩種抗體既可以識(shí)別TRAP 5a也可以識(shí)別TRAP 5b，但是不同的表位。
人們發(fā)現(xiàn)，利用作為抗原的重組TRAP(Chamberlain P.等人，臨床化學(xué)，41(10)1495-1499，1995)開發(fā)出來的單克隆抗體4E6不與從骨中分離純化得到的TRAP反應(yīng)。代之出現(xiàn)的是它可以特異性識(shí)別含有唾液酸的TRAP的5a形式。使400ng 4E6在抗鼠IgG-包裹的微滴培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1小時(shí)。然后在這些平皿中使血清樣品(200μl)培養(yǎng)1小時(shí)。作為對(duì)照，將同樣來源的血清樣品按照相似的方法在空的抗鼠IgG-包裹的微滴培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)。從這些平皿中取3份等份樣品(各50μl)，與100μl含有400ng銪標(biāo)記O1A和生物素化J1B的Delfia分析緩沖液進(jìn)行混合?；旌衔镉贒elfia平皿振蕩器的不斷振搖下，在抗生蛋白鏈菌素包裹的微滴培養(yǎng)皿中培養(yǎng)2小時(shí)(1296-001Delfia平皿振蕩器，Wallac Oy，Turku，F(xiàn)inland)，然后用Delfia洗滌緩沖液進(jìn)行洗滌。最后用Delfia增強(qiáng)溶液填充平皿，振搖5分鐘，測(cè)定結(jié)合的熒光。Halleen J等人(骨和礦物研究雜志，111165-1175，1996)以及Hemmila等人(Anal.Biochem.137335-343，1984)曾對(duì)此方法進(jìn)行了進(jìn)一步的描述。
結(jié)果列于表1。可以發(fā)現(xiàn)在絕經(jīng)前和絕經(jīng)后的婦女身上TRAP 5a的量幾乎相同，但兩組之間的TRAP 5b量的差異是非常顯著。與采用總的TRAP相比，特異性的測(cè)定TRAP 5b使得TRAP作為骨吸收指標(biāo)的用途有了顯著的改進(jìn)。另外還證實(shí)兒童體內(nèi)TRAP 5b的量水平要高于成人，而TRAP 5a的量在成人和兒童之間幾乎是恒定的。
表1．血清中TRAP的量(μg/l) 1后/前=絕經(jīng)前婦女與絕經(jīng)后婦女的TRAP酶比例。
2兒童/前=兒童與絕經(jīng)前婦女的TRAP酶比例。
實(shí)施例2對(duì)抗鼠IgG-包裹的微滴培養(yǎng)皿進(jìn)行預(yù)洗滌，在不斷振搖下，在這些培養(yǎng)皿中使單克隆TRAP-抗體O1A(400ng抗體/平皿)培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌這些平皿，在不斷振搖下，使來自40位健康成人的血清樣品在這些培養(yǎng)皿培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌平皿，通過培養(yǎng)200ml反應(yīng)混合物(0.1M乙酸鈉，pH5.9，8mM pNPP以及40mM酒石酸鈉)對(duì)培養(yǎng)皿中結(jié)合的TRAP活性測(cè)定1小時(shí)。加入25ml 0.32M氫氧化鈉終止反應(yīng)，在405nm處用ELISA平皿讀數(shù)儀測(cè)定吸收。
基于這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得到了兩組數(shù)據(jù)“高”組，其含有8個(gè)具有最高總TRAP活性的樣品以及“低”組，其含有8個(gè)具有最低總TRAP活性的樣品。在兩組中，分別特異地測(cè)定TRAP 5a和TRAP 5b，首先使5a和抗體4E6結(jié)合，然后按照上述方法，用抗體O1A測(cè)定未結(jié)合的活性，即TRAP 5b的活性。在pH5.0下測(cè)定TRAP 5a的活性，在pH5.9下測(cè)定TRAP 5b的活性。結(jié)果(405nm處的吸收)列于表2?？梢钥吹?，兩組中TRAP 5a的含量基本相同，而高組中TRAP 5b的含量則顯著較高。
表2．在高和低活性血清下TRAP的活性
最后，通過與抗體O1A的結(jié)合，對(duì)來自兩組的總TRAP進(jìn)行測(cè)定，按照上述方法，在不同的pH值下測(cè)定結(jié)合的TRAP活性。結(jié)果(405nm處的吸收)列于表3。該結(jié)果清楚地顯示當(dāng)pH增加時(shí)，兩組之間的差異也在增加。在pH6.1下，可以獲得最大的差異。
表3．在不同pH值下TRAP的活性
實(shí)施例3對(duì)不同pH值下的血清TRAP 5a和TRAP 5b的活性進(jìn)行了研究。具體作法是使血清樣品中的TRAP 5a與抗體4E6結(jié)合，然后用抗體O1A與剩余的TRAP 5b進(jìn)行結(jié)合。按照實(shí)施例2第一段中所述方法測(cè)定結(jié)合的TRAP活性，除了乙酸鹽緩沖液的pH如所示的變化。表4列出了不同pH值下，以pNPP作為底物時(shí)得到的TRAP 5a和TRAP 5b的吸收值(A405)。“％5”一欄表示每一個(gè)pH下，5a活性與總TRAP活性(5a+5b)的比例，例如在pH4.7下，“％5”為0.256/0.354=72％。
表4 由表4可見，對(duì)于特異性地測(cè)定TRAP 5b來說，pH6.1最為適宜，此時(shí)，TRAP 5a的干擾最低(9.3％)，而TRAP 5b在適宜的pH范圍內(nèi)(5.7-5.9)最為活躍。通常，在pH5.5處測(cè)定血清TRAP活性，這是在測(cè)定總血清TRAP時(shí)所觀察到的最適宜的pH值(由于在pH5.5處，TRAP 5a和TRAP 5b的結(jié)合活性最大，參見上表中“5a+5b”一欄)。
實(shí)施例4將實(shí)施例3中所述的測(cè)定TRAP的特異方法(其中在pH6.1處測(cè)定與O1A結(jié)合的血清TRAP5b的活性)與雙部位分析方法(其中通過使TRAP與O1A結(jié)合，測(cè)定總血清TRAP，并且采用Delfia系統(tǒng)，利用銪標(biāo)記的J1B，檢測(cè)總TRAP)進(jìn)行比較。采集絕經(jīng)后婦女(年齡大于70歲)的血清樣品，用以研究6個(gè)月的雌三醇替代治療(HRT)對(duì)血清TRAP含量的作用。根據(jù)測(cè)定TRAP 5b的特異方法，經(jīng)過6個(gè)月的HRT(p=0.001)，TRAP 5b的活性下降了48％，而在對(duì)照組中(其用安慰劑代替雌三醇)，經(jīng)過6個(gè)月的HRT，TRAP 5b的活性增加了2％。6個(gè)月后，兩個(gè)組用雙部位分析法得到的總TRAP的量下降了15-20％。這些結(jié)果顯示，經(jīng)過6個(gè)月的HRT，測(cè)定總TRAP的雙部位分析方法在檢測(cè)骨吸收速率變化方面不夠敏感，而特異性測(cè)定TRAP 5b的方法則可以檢測(cè)到經(jīng)過6個(gè)月的HRT后，TRAP 5b幾乎達(dá)到50％的降低。這些結(jié)果表明，在檢測(cè)骨質(zhì)疏松患者的HRT治療時(shí)，上述方法是非常有用的。因此在雌三醇替代治療檢測(cè)骨吸收速率變化時(shí)，TRAP 5b比起用雙部位分析方法檢測(cè)總TRAP來說是一項(xiàng)更好的指標(biāo)。結(jié)果列于圖1。
實(shí)施例5最后，采用一系列絕經(jīng)后婦女的血清樣品，對(duì)血清TRAP 5b量及總血清TRAP與骨礦物密度(BMD)的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，TRAP 5b與BMD的負(fù)相關(guān)性(r=-0.540，p=0.001***)比總TRAP與BMD的負(fù)相關(guān)性(r=-0.156，p=0.1488，沒有顯著的相關(guān)性)更為顯著。圖2顯示了TRAP 5b與BMD的相關(guān)曲線。
這些數(shù)據(jù)令人信服地說明在骨吸收速率檢測(cè)方面，TRAP 5b比起總血清TRAP來說，是一個(gè)更為特異和敏感的指標(biāo)。
權(quán)利要求
1．在治療對(duì)象身上測(cè)定骨吸收速率的免疫分析方法，其特征在于在所述治療對(duì)象的體液樣品中測(cè)定耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，通過TRAP 5b的量可以反映出骨吸收的速率。
2．權(quán)利要求1中所述的方法，其中采用了耐抗酒石酸磷酸酯酶(TRAP)的單克隆抗體。
3．權(quán)利要求1或2中所述的方法，其中存在于體液樣品中的TRAP首先與抗體結(jié)合，該抗體與全部的TRAP(TRAP 5a和TRAP 5b)結(jié)合，在pH5.7-6.3之間測(cè)定結(jié)合的TRAP的活性。
4．權(quán)利要求3中所述的方法，其中在pH約為6.1時(shí)用分光光度法測(cè)定TRAP的活性。
5．權(quán)利要求2中所述的方法，其中的單克隆抗體能夠區(qū)分所使用的TRAP 5b和TRAP 5a。
6．權(quán)利要求5中所述的方法，其中存在于體液樣品中的TRAP首先與TRAP 5a特異性抗體結(jié)合，之后可以測(cè)定未結(jié)合的TRAP的活性。
7．權(quán)利要求6中所述的方法，其中可以通過分光光度法或免疫分析方法測(cè)定未結(jié)合的TRAP的活性。
8．權(quán)利要求1，6或7中所述的方法，其中在pH5.7-6.3之間進(jìn)行TRAP的活性測(cè)定。
9．權(quán)利要求8中所述的方法，其中在pH約為6.1時(shí)測(cè)定TRAP的活性。
10．權(quán)利要求1或5中所述的方法，其中至少使用了兩種不同的單克隆抗體，它們可以識(shí)別TRAP的不同表位。
11．權(quán)利要求10中所述的方法，其中采用了時(shí)間-分辨熒光免疫分析。
12．前述任意權(quán)利要求中所述的方法，其中的體液樣品為血清。
13．診斷治療對(duì)象體內(nèi)與骨吸收速率改變有關(guān)疾病的方法，其特征在于在所述治療對(duì)象的體液樣品中測(cè)定耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)，通過TRAP 5b的異常量可以反映出與骨吸收速率改變有關(guān)的疾病。
14．權(quán)利要求13中所述的方法，其中所述的失調(diào)為骨質(zhì)疏松癥。
15．含有能夠區(qū)分耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)和耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP 5a)抗體的測(cè)試盒(test-kit)。
16．檢測(cè)藥物治療治療對(duì)象體內(nèi)與骨吸收速率增加有關(guān)疾病的效果的方法，其特征在于通過免疫分析方法對(duì)所述治療對(duì)象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進(jìn)行測(cè)定，通過TRAP 5b量的降低可以反映出所述藥物的作用。
17．權(quán)利要求16中所述的方法，其中的疾病為骨質(zhì)疏松癥。
18．對(duì)與骨吸收速率增加有關(guān)疾病具有易感性的治療對(duì)象的篩選方法，特征在于通過免疫分析方法對(duì)所述治療對(duì)象體液樣品中的耐酒石酸磷酸酯酶5b(TRAP 5b)進(jìn)行測(cè)定，TRAP 5b水平提高即表示對(duì)所述疾病具有易感性。
19．權(quán)利要求18中所述的方法，其所述的疾病為骨質(zhì)疏松癥。
全文摘要
現(xiàn)已將耐酒石酸磷酸酯酶(TRAP)作為骨吸收的指標(biāo)。然而,所述的酶在體內(nèi)有兩種形式:TRAP5a和TRAP5b,其中TRAP5b是更具特異性的指標(biāo)。本發(fā)明提供了用于測(cè)定骨吸收速率的免疫分析方法,該方法能夠進(jìn)行TRAP5b的特異性測(cè)定,通過TRAP5b的量可以反映出骨吸收的速率。該方法可以用于診斷與骨吸收速率改變有關(guān)的疾病,例如骨質(zhì)疏松癥。本發(fā)明還提供了對(duì)這些疾病具有易感性對(duì)象的篩選方法以及檢驗(yàn)治療效果的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1295667SQ99804628
公開日2001年5月16日 申請(qǐng)日期1999年3月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月1日
發(fā)明者尤西·哈勒恩, 卡萊爾沃·韋內(nèi)寧 申請(qǐng)人:尤西·哈勒恩, 卡萊爾沃·韋內(nèi)寧