動物血、腦樣品中痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法
【專利摘要】一種動物血、腦樣品中痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，其特征在于：利用微透析系統(tǒng)同步收集動物血透析液及腦組織透析液樣品于不同的色譜進樣瓶內(nèi)襯管中，分別加入NIC-d3、COT-d3混合內(nèi)標溶液，混勻后，直接采用UPLC-MS/MS分析檢測微透析樣品中煙堿和可替寧的含量。本發(fā)明的優(yōu)點在于：無需沉淀蛋白、純化等樣品前處理步驟，實現(xiàn)了煙堿及其代謝物在動物體內(nèi)多位點的同步、準確分析，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有操作簡便，靈敏度高，結(jié)果可靠等特點，開創(chuàng)了一種新的用于動物體內(nèi)煙堿代謝研究的方法。
【專利說明】動物血、腦樣品中痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動物血、腦樣品中痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，本方法針對動物微透析液樣品，以穩(wěn)定同位素標記物作為內(nèi)標物，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)對樣品中痕量煙堿及可替寧進行檢測，揭示煙堿在動物體內(nèi)的代謝規(guī)律。
【背景技術(shù)】
[0002]煙堿(Nicotine, NIC)是煙草的重要特征成分。由吸煙所導致的煙堿依賴,是持續(xù)吸煙進而危害健康的深層次原因。煙堿依賴的發(fā)生與個體對煙堿的代謝密切相關(guān)。研究煙堿在體內(nèi)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的代謝特征，可為煙堿依賴的形成機理提供依據(jù)。
[0003]大多數(shù)情況下，煙堿在體內(nèi)可代謝為9種化合物。其中，大部分的煙堿通過氧化代謝為可替寧(Cotinine，COT)。因此，煙堿及其主要代謝物可替寧可作為衡量機體煙氣暴露程度的生物標志物，用來區(qū)分吸煙者和非吸煙者。目前，關(guān)于這方面的研究已成為環(huán)境與健康領(lǐng)域中的熱點。
[0004]目前國內(nèi)外關(guān)于煙堿代謝的報道中所采用的分析方法有氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法、高效液相色譜(HPLC)法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MSn)法等。近年來，HPLC-MSn尤其是UPLC-MSn在生物樣品分析方面具有很大的優(yōu)勢，已經(jīng)成為煙堿及其代謝物分析的重要手段[參考文獻 1:Maria Dobrinas, Eva Choong, Muriel Noetzli, JacquesCornuzj Nicolas Ansermotj Chin B.Eap.Quantification of nicotine, cotinine,trans-3^-hydroxycotinine and varenicline in human plasma by a sensitive and specificUPLC-tandem mass-spectrometry procedure for a clinical study on smoking cessation.Journal of Chromatography B，2011，879: 3574-3582.參考文獻 2:Koen De CremerjIlse Van Overmeirej Joris Van Loc0.0n-line solid—phase extraction with ultraperformance liquid chromatography and tandem mass spectrometry for the detectionof nicotine, cotinine and trans-3^ -hydroxycotinine in urine to strengthen humanbiomonitoring and smoking cessation studies.Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis, 2013，76: 126-133.]。然而，這些研究也存在一定的不足，比如僅注重釆集外周系統(tǒng)中單一位點樣品進行分析測定，較少研究煙堿在其靶器官——腦組織內(nèi)的代謝特征；而且，收集到的生物樣品都屬于復雜基質(zhì)樣品，分析檢測時往往需要進行沉淀蛋白、離心、純化等前處理步驟，不僅操作繁瑣，還影響了定量分析的準確性。最近，微透析技術(shù)的發(fā)展體現(xiàn)出了很大的優(yōu)勢[參考文獻3:Yuh-Lih Chang，P1-Lo Tsai，Yueh-Ching Chouj et al.Simultaneous determination of nicotine and its metabolite,cotinine, in rat blood and brain tissue using microdialysis coupled with liquidchromatography: pharmacokinetic application[J].Journal of ChromatographyA, 2005，1088: 152-157.參考文獻 4:Anna Czubakj Elzbieta Nowakowskaj KrystynaGolembiowskaj et al.Effect of venlafaxine and nicotine on the level ofneuro transmit ter s and their metabolites in rat brains.Journal of Physiology andPharmacology, 2010, 61(3): 339-346.]。利用微透析技術(shù)不僅可以實現(xiàn)多位點樣品的同步、動態(tài)收集，而且樣品中還不含蛋白質(zhì)，可以實現(xiàn)直接進樣分析。生物樣品中煙堿及其代謝物的含量僅為ng級甚至更低，采用微透析樣品進行LC-MSn分析，可以極大地消減基質(zhì)效應，同時選用同位素標記物作為內(nèi)標物，還可以提高定量分析的準確度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的正是針對目前煙堿代謝研究方法的不足，而專門開發(fā)的一種動物體內(nèi)煙堿及其代謝物的分析方法。本方法通過選用同位素標記物作為內(nèi)標物，相較于微透析樣品的直接進樣分析提高了定量分析的準確性，還免除了常規(guī)方法收集生物樣品后需要進行沉淀蛋白、固相萃取純化等繁瑣步驟，實現(xiàn)了煙堿在外周血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的同步、動態(tài)分析。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:一種動物血、腦樣品中痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，利用微透析系統(tǒng)同步收集動物血透析液及腦組織透析液樣品于不同的色譜進樣瓶內(nèi)襯管中，分別加入NIC-1/3、C0T-1/3混合內(nèi)標溶液，混勻后，直接采用UPLC-MS/MS分析檢測微透析樣品中煙堿和可替寧的含量。
[0007]該方法具體步驟如下:
a.微透析樣品收集:a.同步且分別收集動物攝入煙堿后的血液微透析樣品和腦微透析樣品，使得每管中樣品為30 μ L。
[0008]b.混合內(nèi)標工作溶液配制:以穩(wěn)定同位素NIC_d3、C0T-d3作為內(nèi)標物，配制濃度均為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液。具體方式為:準確稱取NIC-d3、C0T_d3各10mg，分別置于2個IOOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度各為100 μ g/mL的NIC_d3、C0T-d3內(nèi)標儲存溶液；分別移取2.0mL內(nèi)標儲存溶液于同一支IOOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為2 μ g/mL的一級混合內(nèi)標溶液；準確移取20.0mL —級混合內(nèi)標溶液置于IOOOmL容量瓶中，用復方氯化鈉注射液稀釋至刻度，搖勻，配制得濃度均為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液。
[0009]c.混合標準溶液配制:分別稱取煙堿、可替寧標準品，配制具有濃度梯度的系列混合標準溶液，并加入混合內(nèi)標工作溶液，使內(nèi)標物的濃度均為10ng/mL。具體方式為:準確稱取煙堿、可替寧各10mg，分別置于2個IOOmL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度各為100 μ g/mL的煙堿、可替寧標準儲備溶液；分別移取10.0mL的標準儲備溶液，置于同一支IOOmL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得一級混合標準溶液；移取LOmL的一級混合標準溶液，置于另一 IOOmL容量瓶中，用復方氯化鈉注射液稀釋至刻度，搖勻，得濃度為100ng/mL 二級混合標準溶液；準確移取0.025,0.10,0.50、1.00,2.50、
5.00、10.0和25.0mL 二級混合標準溶液，分別置于不同的IOOmL容量瓶中，各加入25.0mL混合內(nèi)標工作溶液，用復方氯化鈉注射液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度均為0.025,0.10、
0.50、1.00,2.50,5.00、10.0和25.0ng/mL的煙堿、可替寧系列混合標準溶液。
[0010]d.標準曲線繪制:將煙堿、可替寧系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行UPLC-MS/MS分析，以各目標分析物的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積之比(7)對其相應的濃度CO進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)。[0011]e.樣品檢測及數(shù)據(jù)處理:將10 μ L濃度為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液分別加入到30 μ L透析液樣品中，混勻后直接進行UPLC-MS/MS分析。利用標準曲線法計算透析液樣品中各目標物的含量，分別繪制血、腦內(nèi)煙堿和可替寧的濃度-時間變化曲線，揭示煙堿在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律。
[0012]本發(fā)明依據(jù)的測試原理在于:同步并且連續(xù)收集動物血液和腦微透析樣品，加入同位素標記物內(nèi)標溶液后，進行UPLC-MS/MS分析，測定不同時間點動物樣品中煙堿及其主要代謝物的含量，揭示煙堿在動物體內(nèi)尤其是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的代謝特征。
[0013]本發(fā)明能夠直接而準確地測定動物樣品中煙堿及其代謝產(chǎn)物的含量，實現(xiàn)了對煙堿在外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)代謝特征的同步、動態(tài)監(jiān)測，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有操作簡單快捷，靈敏度高，結(jié)果可靠等特點，開創(chuàng)了一種新的用于動物體內(nèi)煙堿代謝分析的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為實施例1中的大鼠血、腦內(nèi)煙堿的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0015]圖2為實施例1中的大鼠血、腦內(nèi)可替寧的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0016]圖3為實施例2中的大鼠血、腦內(nèi)煙堿的濃度隨時間變化趨勢圖。
[0017]圖4為實施例2中的大鼠血、腦內(nèi)可替寧的濃度隨時間變化趨勢圖。
【具體實施方式】
[0018]本發(fā)明結(jié)合以下實施例做進一步描述，但并不限制本發(fā)明。
[0019]實施例1
雄性成年SD正常大鼠，10周齡，體重(200 土 20) g，采用獨立隔離飼養(yǎng)籠具飼養(yǎng)，自由進水，標準顆粒進食。大鼠以1%戊巴比妥，按50mg/kg劑量腹腔注射麻醉。借助立體定位儀定位，于大鼠腦紋狀體內(nèi)埋入探針套管。24 h后，在大鼠清醒自由活動狀態(tài)下插入微透析探針(CMA/12)。對于血液微透析樣品收集，需將微透析探針(CMA/20)植入大鼠右心房頸靜脈。采用復方氯化鈉注射液以2.0 yL/min的速度灌流，平衡120min后開始收集樣品，4°C下每15 min各同步收集I管腦、血透析液。于第4管收集結(jié)束時開始計時，按1.0 mg/kg劑量腹腔注射煙堿溶液(0.2 mg/mL,采用復方氯化鈉注射液配制)，繼續(xù)在4°C下按每15min收集透析液。收集好的每管透析液樣品加入10 μ L濃度為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液，混勻后上樣UPLC-MS/MS檢測。
[0020]色譜條件
色譜柱:Waters Atlantis HILIC Silica (2.1 X 150 mm, 1.d., 1.7 μ m)。
[0021]柱溫:30 V ;流動相:A:10 mmol/L乙酸銨水溶液，B:乙腈(含0.1%甲酸，體積分數(shù))；流速:0.5 mL/min ;梯度洗脫條件見表1 ;進樣量:10 μL ;柱平衡時間為I min。
[0022]表1梯度洗脫條件
【權(quán)利要求】
1.一種動物血、腦樣品中痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，其特征在于:利用微透析系統(tǒng)同步收集動物血透析液及腦組織透析液樣品于不同的色譜進樣瓶內(nèi)襯管中，分別加入NIC-1/3、COT-1/3混合內(nèi)標溶液，混勻后，直接采用UPLC- MS/MS分析檢測微透析樣品中煙堿和可替寧的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物血、腦內(nèi)痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，其特征在于:該方法具體包括以下步驟: a.同步且分別收集動物攝入煙堿后的血液微透析樣品和腦微透析樣品； b.混合內(nèi)標工作溶液配制:以穩(wěn)定同位素NIC-d3、C0T-d3作為內(nèi)標物，配制濃度均為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液； c.混合標準溶液配制:分別準確稱取煙堿、可替寧標準品，配制濃度梯度的系列混合標準溶液，并各加入25.0mL濃度為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液，使內(nèi)標物的濃度均為10ng/mL，混合標準溶液的濃度為 0.025,0.10,0.50、1.00,2.50,5.00、10.0 和 25.0ng/mL ； d.標準曲線繪制:將煙堿、可替寧系列混合標準溶液按由低到高的濃度順序進行UPLC-MS/MS分析，以各目標分析物的色譜峰面積與內(nèi)標峰面積之比(7)對其相應的濃度CO進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)； e.樣品檢測及數(shù)據(jù)處理:將步驟a收集的微透析樣品30μ L置于色譜進樣瓶內(nèi)襯管中，加入10 μ L濃度為40ng/mL的混合內(nèi)標工作溶液，混勻后直接進行UPLC- MS/MS分析，利用標準曲線法計算透析液樣品中各目標物的含量，揭示煙堿在大鼠體內(nèi)的代謝規(guī)律。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物血、腦內(nèi)痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，其特征在于:在UPLC-MS/MS分析中，其色譜條件、質(zhì)譜條件具體如下: 色譜條件:
色譜柱:Waters Atlantis HILIC Silica ,規(guī)格 2.1 X 150 mm, 1.d., 1.7 μ m, 柱溫:30 V ;流動相:A:10 mmol/L乙酸銨水溶液，B:乙腈(含0.1%甲酸，體積分數(shù));流速:0.5 mL/min ;梯度洗脫；進樣量:10 μL ;柱平衡時間為I min ； 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描模式:正離子掃描(掃描范圍為m/z 50~500);監(jiān)測方式:多反應監(jiān)測(MRM);毛細管電壓:3.2 kV，離子源和氣化溫度分別為100 1:和350 V ；脫溶劑氣(N2)和氣簾氣(N2)流速分別為600 L/h和50 L/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動物血、腦內(nèi)痕量煙堿及其主要代謝物的同步分析方法，其特征在于:梯度洗脫條件見表1: 表1梯度洗脫條件

【文檔編號】G01N30/88GK104020241SQ201410257438
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月11日
【發(fā)明者】毛健, 張?zhí)? 盧斌斌, 孫世豪, 李鵬, 張建勛, 宗永立, 曾世通, 柴國璧 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院