用于組織樣品固定的方法
【專利摘要】使得處于第一溫度的醛固定劑溶液與組織樣品接觸達(dá)第一時間段，另外使得醛固定劑溶液在高于第一溫度的第二溫度接觸組織樣品達(dá)第二時間段。第一時間段的范圍通常為約15分鐘至約4小時，且第一溫度通常從高于0℃至至少15℃。第二溫度通常從超過約22℃至約55℃，且第二時間段的范圍為約1小時至約4小時。使用此方法，相比于室溫方案的24小時，在約4小時內(nèi)實現(xiàn)改進的組織形態(tài)學(xué)和IHC染色以及對翻譯后修飾信號的優(yōu)越保存，并且觀察到更均衡的形態(tài)學(xué)和抗原保存。
【專利說明】用于組織樣品固定的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]公開的實施方案關(guān)注通過醛固定來處理組織樣品，如對組織樣品的福爾馬林固定，從而隨后將該樣品染色和成像用于病理學(xué)判讀。
[0002]發(fā)明背景
[0003]福爾馬林已在組織學(xué)領(lǐng)域中使用超過半個世紀(jì)。當(dāng)在室溫使用時，福爾馬林?jǐn)U散到組織切片中并交聯(lián)蛋白質(zhì)和核酸，由此中止代謝、保存生物分子并使組織準(zhǔn)備好進行石蠟滲透。在實際中，福爾馬林固定主要發(fā)生在室溫或更高的溫度。一些小組在稍微升高的溫度實施固定，推測是為了提高交聯(lián)速率。正如加熱提高交聯(lián)速率一樣，冷福爾馬林顯著降低交聯(lián)速率。出于此原因，組織學(xué)家通常在室溫或更高的溫度實施組織固定。一些小組使用冷甲醛，但僅在特殊化的情況下使用并且并非用于固定組織。例如，一些小組使用冷福爾馬林來檢查脂質(zhì)小滴或其它特殊情況。
[0004]在暴露不足或過度暴露于福爾馬林的組織中觀察到數(shù)種影響。如果組織樣品未用福爾馬林處理足夠長的一段時間，那么該組織在進行標(biāo)準(zhǔn)組織處理時組織形態(tài)學(xué)通常非常差。例如，在未適當(dāng)固定的組織中，隨后對乙醇的暴露使細(xì)胞結(jié)構(gòu)收縮并壓縮細(xì)胞核，因為該組織不會有機會形成正確交聯(lián)的點陣(lattice)。當(dāng)對固定不足的組織染色時(如用蘇木精和曙紅(H&E))，在細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)之間觀察到許多白空間，壓縮的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)喪失，而且樣品表現(xiàn)為粉紅且蘇木精染料不均衡。過久暴露于福爾馬林的組織通常對于后續(xù)免疫組織化學(xué)過程作用不佳，推測是因為核酸和/或蛋白質(zhì)變性和降解。結(jié)果，這些組織的最適抗原修復(fù)條件作用不當(dāng)，因此，組織樣品表現(xiàn)為染色不足的。
[0005]正確的醫(yī)學(xué)診斷和患者安全性需要在染色前對組織樣品的正確固定。因此，腫瘤學(xué)家和病理學(xué)家已建立用于正確固定組織樣品的指南。例如，根據(jù)美國臨床腫瘤學(xué)會(American Society of Clinical Oncology (ASCO)),對于HER2免疫組織化學(xué)分析，目前對于中性緩沖福爾馬林溶液中的固定時間的指南為至少6小時，優(yōu)選更久，且長至72小時。開發(fā)用于快速固定組織樣品的方法對于在顯著地降解發(fā)生前更好地保存生物學(xué)分子和組織形態(tài)學(xué)，以及盡可能快地為醫(yī)學(xué)專業(yè)人員和患者提供準(zhǔn)確的測試結(jié)合是有利的。
[0006]這類方法對于保存翻譯后修飾信號尤為重要。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在細(xì)胞代謝中起著極其重要的作用。例如，蛋白質(zhì)的磷酸化調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能如細(xì)胞周期控制、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。其它修飾如泛素化可以將那些蛋白質(zhì)引向降解并對細(xì)胞功能有著深刻的影響。遺憾地是，當(dāng)細(xì)胞失去對其中一些修飾的控制時，引起細(xì)胞增殖和癌癥產(chǎn)生。實際上，大多數(shù)癌癥途徑現(xiàn)在整體上與最終導(dǎo)致細(xì)胞變成永生化并診斷為癌性的磷酸化級聯(lián)關(guān)聯(lián)。對于研究者和公司來說，理解癌癥中是否存在特定修飾作為診斷特定癌癥類型和/或預(yù)測治療結(jié)果的方式是極其重要的。
[0007]遺憾地是，目前存在的方法(通常需要在室溫較長的固定和處理時間)對于保存蛋白質(zhì)修飾是不佳的。在過去，許多研究者都著手于失去蛋白質(zhì)修飾信號的問題，例如，中止磷酸酶的作用，例如Millipore (激酶抑制劑混合物)目錄號20-116)、ThermoScientific (中止磷酸酶抑制劑混合物)目錄號78420)等。[0008]工業(yè)中其它人已開發(fā)出快速冷凍方法以中斷修飾酶的作用(Lawson等Cytotoxicity effects of cryoprotectants as single-component and cocktailvitrification solutions, 2011, vol.62, issue2, pagesll5_122)。快速冷凍方法一般適用于其中需要保存完整器官用于移植的情況，而且牽涉DMSO或糖。遺憾地是，快速冷凍可以在最初延緩這類酶的作用，但在樣品融化時不抑制其作用。這些辦法均具有各種局限性。
[0009]由于實體組織中大多數(shù)磷酸酶抑制劑擴散特性較差或缺乏有效性，因此上述辦法主要可用于抑制組織提取物或細(xì)胞系中的修飾酶。更大的分子抑制劑如蛋白質(zhì)會具有極其低的擴散速率。更小的分子如原f凡酸鹽(orthovanadate)具有更高的擴散速率,但其特異性有限且并非對于所有磷酸酶都極其有效。目前沒有通用的、容易執(zhí)行的、能有效中止實體組織樣品中修飾酶作用的方法。如此，本領(lǐng)域中期望開發(fā)出在保存組織形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或翻譯后修飾信號方面提供優(yōu)秀質(zhì)量的新的組織固定方法。
[0010]發(fā)明概述
[0011]本發(fā)明針對用于固定組織的方法。在典型的實施方案中，該方法在保存組織形態(tài)學(xué)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或翻譯后修飾信號方面提供優(yōu)秀質(zhì)量。
[0012]某些公開的實施方案關(guān)注用于對組織樣品進行醛固定(由福爾馬林固定例示)的方法，包括在第一溫度應(yīng)用、浸沒或以其它方式接觸醛溶液和組織樣品達(dá)第一時間段，然后將組織樣品的溫度提高至高于第一溫度的第二溫度達(dá)第二時間段。
[0013]醛溶液和組織樣品通常在第一溫度彼此接觸達(dá)一段時間，該時間段有效允許醛溶液貫穿擴散到該組織樣品的基本上整個橫截面。
[0014]組織樣品第二溫度高于第一溫度。組織樣品溫度的提高可以包括將組織樣品的溫度相當(dāng)快速或甚至突然提高至第二溫度。進行樣品溫度的提高以增加交聯(lián)，同時仍然保存潛在的樣品反應(yīng)性?；蛘?，可以通過將組織樣品浸沒在處于第二溫度的溶液中來實現(xiàn)將組織樣品提高至第二溫度，其中所述溶液可以是相同或不同的醛溶液。第二溫度通常高于環(huán)境，更通常高于約22°C，甚至更通常從超過約22°C至至少約50°C，且甚至更通常地從超過約22°C至約45°C。第二時間段有效允許發(fā)生內(nèi)源性分子和結(jié)構(gòu)的基本完全交聯(lián)。盡管第二時間段可以變化，但它的范圍通常是從超過15分鐘至長至至少約5小時，通常從約I小時至約4小時，且甚至更通常從約2小時至約3小時。如此設(shè)計用于提高溫度的速度和方法從而實現(xiàn)翻譯后修飾信號的最佳保存。
[0015]盡管第一時間段可以隨著組織厚度而變化，但對于厚達(dá)4_的厚度，在ASCO CAP指南中其范圍通常是從約15分鐘至長達(dá)約4小時，更通常從超過15分鐘至約3小時，且甚至更通常從約I小時至約2小時。公認(rèn)的是，對于更厚的樣品，第一時間段會由擴散速率決定。第一溫度為從至少-20°C至約15°C，通常從至少0°C至約15°C，更通常至少0°C至約10°C，且甚至更通常從約3°C至約5°C。
[0016]本方法的某些實施方案包括將處于第一溫度的第一醛溶液應(yīng)用于組織樣品，接著將第二醛溶液應(yīng)用于該組織樣品。第二醛溶液可以與第一醛溶液不同。例如，溶液可以處于不同的濃度，或第二醛溶液可以包含不同于第一種醛的醛。所述醛通常是低級烷基醛，如甲醛、戊二醛或其組合。
[0017]本發(fā)明一個公開的例示性實施方案包括將組織樣品浸沒到福爾馬林溶液中達(dá)第一時間段，所述福爾馬林溶液處于等于或高于0°c至高達(dá)不超過5°C的溫度，所述第一時間段從超過15分鐘至長達(dá)約4小時。然后，將組織樣品浸沒到處于第二溫度的福爾馬林溶液中達(dá)第二時間段，所述第二溫度為超過約22°C至高達(dá)至少45°C，所述第二時間段為從約I小時至約4小時。福爾馬林溶液一般是10%NBF。這些處理步驟之后通常是一系列醇清洗，再之后是從超過O分鐘至長達(dá)至少約30分鐘或長至約I小時、約2小時、約3小時或約4小時的清洗液清洗，如二甲苯清洗。然后對組織樣品應(yīng)用蠟以形成蠟浸潰的塊。
[0018]如目前理解的，迄今沒有人使用過冷卻和加熱固定辦法來提高組織固定的質(zhì)量。不受操作理論束縛，目前認(rèn)為在降低的溫度，發(fā)生很少的交聯(lián)但固定劑溶液確實滲入基本上整個組織切片中。另外，可能出現(xiàn)的情況是代謝或酶促過程急劇減少。一旦擴散，就快速提高溫度，其中交聯(lián)動力學(xué)大大增加。使用此方法，在一些實施方案中，已實現(xiàn)在約4小時中(相比于室溫方案的24小時)實現(xiàn)本領(lǐng)域中已知的高質(zhì)量組織形態(tài)學(xué)和IHC染色。另夕卜，由于固定劑溶液已基本上擴散到樣品中，觀察到更均衡的形態(tài)學(xué)和抗原保存。此方案與現(xiàn)有技術(shù)的不同之處在于，將已公開的工作實施方案中通常用于固定組織樣品的時間段期間的固定過程分開成第一過程步驟以及第二過程步驟，所述第一過程步驟允許固定劑溶液擴散到組織樣品中但使交聯(lián)最小化，所述第二過程步驟增加交聯(lián)速率。
[0019]在典型的實施方案中，本方法顯著保存組織樣品中蛋白質(zhì)的翻譯后修飾信號，例如，保存至少30%、50%、70%或90%的翻譯后修飾信號。本發(fā)明的組織固定方法能顯著地中止破壞翻譯后修飾信號的酶活性，如中止磷酸酶的酶活性。
[0020]在另一個典型的實施方案中，本方法顯著保存組織樣品中的蛋白質(zhì)的信號，例如，保存至少30%、50%、70%或90%的翻譯后修飾信號。本發(fā)明的組織固定方法能顯著中止降解蛋白質(zhì)的酶活性，如中止蛋白酶的酶活性。
[0021]在一個例示性實施方案中，使用甲醛固定石蠟包埋(FFPE)的組織樣品。本方法相對于現(xiàn)有嘗試提供數(shù)個優(yōu)點以保存FFPE組織的修飾狀態(tài)。本方法使用廣泛用于組織學(xué)實踐的標(biāo)準(zhǔn)福爾馬林溶液。低溫步驟可以以由冷福爾馬林接著是經(jīng)過加熱的福爾馬林組成的簡單方式實施。本發(fā)明在本領(lǐng)域中第一次實現(xiàn)保存FFPE組織中的修飾狀態(tài)。本技術(shù)比現(xiàn)有固定方法更迅速，并且能顯著地減少組織標(biāo)本的周轉(zhuǎn)時間并改進信息流。
[0022]另一個實施方案涉及自動檢測方法，包括在自動檢測系統(tǒng)中檢測依照本發(fā)明方法固定的組織樣品。
[0023]總之，本方法相對于本領(lǐng)域中現(xiàn)有方法提供至少三處改進。首先，通過允許福爾馬林在低溫環(huán)境中滲透到組織切片中能顯著降低酶活性。第二，通過快速提高組織樣品溫度來增加交聯(lián)動力學(xué)，比在室溫所會觀察到的更快速地將細(xì)胞成分“鎖”入位置。此組合使得此技術(shù)優(yōu)于現(xiàn)有方法，并且首次允許在FFPE組織中保存修飾狀態(tài)。第三，這代表了一種認(rèn)為適用于很多種修飾狀態(tài)和酶的通用方法。盡管其他方法靶向一組特定的修飾酶，但此方法使所有修飾酶快速失能，并且因此保存比黃金標(biāo)準(zhǔn)室溫規(guī)程好得多的一般細(xì)胞狀態(tài)。由于本發(fā)明不限于特定組的生物分子或含有特定翻譯后修飾的生物分子，因此認(rèn)為此方法代表一種用于保存任何生物分子或修飾狀態(tài)的通用方法。如此，本發(fā)明能以高質(zhì)量保存大量的生物分子和含有特定翻譯后修飾的生物分子。
[0024]本發(fā)明的前述和其它對象、特征和優(yōu)點從下列詳細(xì)描述將變?yōu)楦用黠@的，其參照所附圖進行。
[0025]附圖簡述[0026]圖1A-1D是用細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)Dl處理不同時間段(分別為0、2、4和24小時)的組織樣品的數(shù)字顯微鏡圖像，其圖示固定狀態(tài)對于使用抗體獲得的染色結(jié)果的強度的影響。
[0027]圖2A-2D是用bcl_2處理不同時間段(分別為0、2、4和24小時)的組織樣品的數(shù)字顯微鏡圖像，其圖示固定狀態(tài)對于使用抗體獲得的染色結(jié)果的強度的影響。
[0028]圖3A-3F是依照不同處理方案處理的組織樣品的數(shù)字顯微鏡圖像，其圖示當(dāng)用bcl-2、二氨基聯(lián)苯胺和蘇木精試劑處理組織樣品時，將組織樣品用10%中性緩沖的福爾馬林溶液預(yù)浸泡10分鐘、30分鐘和60分鐘(分別為A-C和D-F)提高染色質(zhì)量；圖3A-3C是在沒有預(yù)浸泡的情況下用10%中性緩沖的福爾馬林溶液40°C處理獲得的圖像；圖3D-3F是在4°C、10%中性緩沖的福爾馬林溶液中2小時預(yù)浸泡，接著用10%中性緩沖的福爾馬林溶液40°C固定的樣品；而圖3G和3H是圖3C和3F中分別指示的區(qū)域的放大圖。
[0029]圖4A-4B是圖3C和3F中所指示區(qū)域的進一步放大的數(shù)字顯微鏡圖像。
[0030]圖5是通過用在35°C、40°C、45°C和50°C的10%中性緩沖的福爾馬林溶液處理組織樣品達(dá)0.5-6小時的不同時間段所獲得的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果的示意圖。
[0031]圖6是使用在35°C、40°C、45°C和5(TC的10%中性緩沖的福爾馬林溶液處理達(dá)
0.5-6小時的不同時間段的組織樣品，通過bcl-2免疫組織化學(xué)分析所獲得的抗原性結(jié)果的示意圖。
[0032]圖7是使用有或無預(yù)浸泡處理的、用在35°C、40°C、45°C和50°C的10%中性緩沖的福爾馬林溶液處理達(dá)0.5-6小時的不同時間段的組織樣品，通過bcl-2免疫組織化學(xué)分析所獲得的抗原性結(jié)果的示意圖。
[0033]圖8是相比于無預(yù)浸泡對照，用各種預(yù)浸泡時間處理組織樣品的抗原性和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果的示意圖。
[0034]圖9是相比于無預(yù)浸泡對照，用各種預(yù)浸泡時間處理組織樣品的抗原性和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果的示意圖。
[0035]圖10是相比于無預(yù)浸泡對照，用各種預(yù)浸泡時間處理組織樣品的抗原性和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果的示意圖。
[0036]圖1lA-E是在Calu-3異種移植物上對pAKT染色的顯微鏡圖像。
[0037]圖12A-D是在有或無磷酸酶(phosphate)處理下在Calu-3異種移植物上對pAKT染色的顯微鏡圖像。
[0038]圖13A-B是在有原位導(dǎo)管癌(DCIS)的人乳腺上對pAKT染色的顯微鏡圖像。
[0039]圖14A-D是在熱降解下在Calu-3異種移植物上對pAKT染色的顯微鏡圖像。
[0040]圖14E是在不同條件的熱降解下在Calu-3異種移植物上對pAKT陽性染色的定量分析的示意圖。
[0041]圖15A-E是在Calu-3異種移植物上對pAKT染色的顯微鏡圖像，其顯示在取出樣品后翻譯后信號的降解。
[0042]圖16A-1是在人結(jié)腸癌上對磷酸標(biāo)志物染色的顯微鏡圖像。
[0043]圖16J和K是在不同固定條件下的正常和癌瘤細(xì)胞中對pAKT或pPRAS40陽性染色的定量分析的示意圖。
[0044]圖17A和B是在人乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)中對miRNA保存染色的顯微鏡圖像。[0045]圖18A和B是在人乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)中對DNA保存染色的顯微鏡圖像。
[0046]圖19A、B和C是在人結(jié)腸癌上對Hifl α保存染色的顯微鏡圖像。
[0047]發(fā)明詳述
[0048]1.縮寫、術(shù)語和導(dǎo)言
[0049]除非另外記載，依照常規(guī)用法來使用技術(shù)術(shù)語。分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義可見于 Benjamin Lewin, Genes VII,由 Oxford University Press 出版，2000(ISBN019879276X) ；Kendrew 等(編)，The Encyclopedia of MolecularBiology,由 Blackwell Publishers 出版，1994 (ISBN0632021829)；和 RobertA.Meyers (編),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive DeskReference，由 Wiley, John&Sons, Inc.出版，1995 (ISBN0471186341);以及其它類似的參考文獻。
[0050]如本文中使用的，除非上下文另外清楚地指示，單數(shù)術(shù)語“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。類似地，除非上下文另外清楚地指示，詞語“或”意圖包括“和”。而且，如本文中使用的，術(shù)語“包括/包含”以其法律上接受的定義和方式使用，且在本文中無一處意圖改變此類含義。還必須理解，對核酸或多肽或其它化合物給出的所有核苷酸大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子質(zhì)量值均是近似的，并且提供以用于描述。盡管可在實踐中或測試本公開中使用類似于或等同于本文中描述的那些的方法和材料，但在下文描述了適宜的方法和材料。在有沖突的情況下，將以本說明書(包括術(shù)語解釋在內(nèi))為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實施例僅為例示性的且不意圖為限制的。
[0051]為了幫助對本公開各實施例的審查，提供下列對縮寫和特定術(shù)語的解釋:
[0052]H&E:蘇木精和曙紅染色。
[0053]IHC:免疫組織化學(xué)。
[0054]ISH:原位雜交。
[0055]NBF:中性緩沖的福爾馬林溶液。
[0056]醛:就本發(fā)明目的而言，術(shù)語“醛”指含有醛的固定劑的交聯(lián)類型。含有醛的交聯(lián)固定劑的許多例子是組織學(xué)中的常識，包括布安氏液(Bouin’ S)、GlyoxaU乙二醛)、鋅-福爾馬林、酸性福爾馬林(AFA)和戊二醛。
[0057]烷基:飽和的脂肪鏈。
[0058]動物:活的多細(xì)胞脊椎生物，一個包括例如哺乳類和鳥類的范疇。術(shù)語哺乳類包括人和非人哺乳類。類似地，術(shù)語“受試者”包括人和牲畜受試者，例如人、非人靈長類、犬、貓、馬和牛。
[0059]抗體:“抗體”統(tǒng)指免疫球蛋白或免疫球蛋白樣分子(舉例而言且無限制地，包括IgA, IgD, IgE, IgG和IgM、其組合，以及在任何脊椎動物例如哺乳類如人、山羊、家兔和小鼠的免疫應(yīng)答期間生成的類似的分子)和抗體片段，其特異性結(jié)合感興趣的分子(或一組高度類似的感興趣分子)以至于實質(zhì)性排除對其它分子的結(jié)合(例如，對感興趣分子具有的結(jié)合常數(shù)比對生物學(xué)樣品中的其它分子的結(jié)合常數(shù)高至少IO3M'高至少IO4M4或高至少IO5IT1的抗體和抗體片段)。
[0060]更具體地，“抗體”指特異性識別并結(jié)合抗原表位的包含至少一個輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)的多肽配體。抗體由重鏈和輕鏈構(gòu)成，其各自具有可變區(qū)，稱為可變重(Vh)區(qū)和可變輕(VJ區(qū)。Vh區(qū)和'區(qū)一起負(fù)責(zé)結(jié)合抗體所識別的抗原。
[0061]抗原:可以被特定體液或細(xì)胞免疫的產(chǎn)物，如抗體分子或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的化合物、組合物或物質(zhì)。抗原可以是任何類型的分子，包括例如半抗原、簡單中間代謝物、糖(例如寡糖)、脂質(zhì)和激素以及大分子如復(fù)雜的碳水化合物(例如多糖)、磷脂、核酸和蛋白質(zhì)。常用的抗原范疇包括但不限于，病毒抗原、細(xì)菌抗原、真菌抗原、原生動物和其它寄生物抗原、腫瘤抗原、牽涉自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)和移植物排斥的抗原、毒素和其它混雜性抗原。在一個實施例中，抗原是芽孢桿菌(Bacillus)抗原如YPGA。
[0062]表位:抗原決定簇。這些是分子上抗原性的(即引發(fā)特異性免疫應(yīng)答的)特定化學(xué)基團或連續(xù)或不連續(xù)的肽序列?？贵w結(jié)合特定抗原性表位。
[0063]福爾馬林:甲醛在水中的商業(yè)化溶液，其通常用于保存生物學(xué)標(biāo)本。用作固定劑的福爾馬林通常是10%中性緩沖的福爾馬林(NBF)，但也可以使用其他溶液濃度。如此，可用的福爾馬林固定濃度的范圍通常從超過0%至高達(dá)至少20%，更通常地從5%至高達(dá)15%，其中本發(fā)明的某些公開的工作實施方案使用10%NBF溶液來固定組織樣品。
[0064]半抗原:一種分子，通常為能與抗體特異性組合的小分子，但通常除與載體分子組合以外基本不能為免疫原性的。
[0065]免疫應(yīng)答:免疫系統(tǒng)的細(xì)胞(如B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或多形核細(xì)胞(polymorphonucleocyte))對刺激的響應(yīng)。免疫應(yīng)答可以包括身體中涉及宿主防御應(yīng)答的任何細(xì)胞，例如分泌干擾素或細(xì)胞因子的上皮細(xì)胞。免疫應(yīng)答包括但不限于，先天性免疫應(yīng)答或炎癥。
[0066]分離的:“分離的”微生物(如病毒、細(xì)菌、真菌或原生動物)已與不同類型、株或物種的微生物基本分開或從其純化出來?？梢酝ㄟ^多種技術(shù)來分離微生物，包括系列稀釋
和培養(yǎng)。
[0067]“分離的”生物學(xué)組分(如核酸分子、蛋白質(zhì)或細(xì)胞器)是已與該組分天然存在的生物細(xì)胞中其它生物學(xué)組分(如其它染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)基本分開或從其純化出來的。已“分離的”核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包含通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)而制備的核酸和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸或蛋白質(zhì)，或其片段。
[0068]低級烷基:含有1-10個碳原子的飽和脂肪鏈。
[0069]哺乳動物/哺乳類:該術(shù)語包括人和非人哺乳動物兩者。類似地，術(shù)語“受試者”包括人和牲畜受試者。
[0070]感興趣的分子或靶物:要針對其存在、位置和/或濃度進行測定的分子。感興趣分子的例子包括蛋白質(zhì)和核酸序列。
[0071]單克隆抗體:由B淋巴細(xì)胞的單一克隆或其中已轉(zhuǎn)染單一抗體的輕鏈和重鏈基因的細(xì)胞生成的抗體。單克隆抗體由本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方法生成，例如通過從骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞的融合制備雜合抗體形成細(xì)胞。單克隆抗體包括人源化單克隆抗體。
[0072]多重/多路:如期望的，在樣品中基本同時或序貫地檢測多個靶物。多重可以包括一般地鑒定和/或量化核酸、DNA、RNA、肽、蛋白質(zhì)，分別地或以任意和所有組合地。
[0073]贅生物形成(Neoplasia)和腫瘤:細(xì)胞的異常和不受控生長的過程。贅生物形成是增殖性病癥的一個例子。贅生物形成的產(chǎn)物是贅生物(腫瘤)，它是起因于過度細(xì)胞分裂的組織的異常生長。不轉(zhuǎn)移的腫瘤被稱為“良性的”。入侵周圍組織和/或能轉(zhuǎn)移的腫瘤被稱為“惡性的”。血液學(xué)腫瘤的例子包括白血病，其包括急性白血病(如急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性骨髓性白血病以及成髓細(xì)胞白血病、前髓細(xì)胞白血病、骨髓單核細(xì)胞白血病、單核細(xì)胞白血病和紅白血病)、慢性白血病(如慢性髓細(xì)胞(粒細(xì)胞)白血病、慢性骨髓性白血病、和慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多癥(polycythemiavera)、淋巴瘤、霍奇金氏(Hodgkin ' s)病、非霍奇金氏淋巴瘤(無痛性(indolent)和高級形式)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom, s macroglobulinemia)、重鏈病、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome)、毛細(xì)胞白血病和脊髓發(fā)育不良(myelodysplasia)。
[0074]實體瘤如肉瘤和癌瘤的例子包括，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)和其它肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' stumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、淋巴惡性(lymphoid malignancy)、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、甲狀腺髓樣癌、乳頭狀甲狀腺癌、嗜鉻細(xì)胞瘤、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝瘤(hepatoma)、膽管癌、絨毛膜癌(choriocarcinoma)、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、宮頸癌、睪丸腫瘤、精原細(xì)胞瘤、膀胱癌和CNS腫瘤(如膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、頡咽管瘤(craniopharyogioma)、室鼓膜瘤(ependymoma)、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦[脊]膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤)。
[0075]多肽:其中單體為經(jīng)由酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。當(dāng)氨基酸是α氨基酸時，可以使用L-光學(xué)異構(gòu)體或D-光學(xué)異構(gòu)體。如本文中使用的，術(shù)語“多肽”或“蛋白質(zhì)”意圖涵蓋任何氨基酸序列并且包括經(jīng)修飾的序列如糖蛋白。術(shù)語“多肽”特定地意圖涵蓋天然存在的蛋白質(zhì)以及那些重組或合成生成的蛋白質(zhì)。
[0076]術(shù)語“殘基”或“氨基酸殘基”包括對摻入蛋白質(zhì)、多肽或肽中的氨基酸的提述。
[0077]蛋白質(zhì):由氨基酸構(gòu)成的分子，特定地為多肽。
[0078]翻譯后修飾:在蛋白質(zhì)翻譯后對其進行的化學(xué)修飾。對于許多蛋白質(zhì)，它是蛋白質(zhì)生物合成(如此以及基因表達(dá))中的后期步驟。氨基酸的翻譯后修飾擴展了蛋白質(zhì)功能的范圍，其通過對其附接其它生化功能基團(如乙酸根、磷酸根、各種脂質(zhì)和碳水化合物)、改變氨基酸的化學(xué)性質(zhì)(例如瓜氨酸化)或進行結(jié)構(gòu)改變(例如形成二硫橋)來進行。還有，塵可以從蛋白質(zhì)的氫基端除去氨基酸，或在肽鏈中部切割。例如，在形成二硫鍵后肽激素胰1?被切割兩次，且從鏈中部移出皿;所得蛋白質(zhì)由通過二硫鍵連接的兩條多肽鏈組成。而且，大多數(shù)新生多肽開始于氨基酸甲硫氨酸，因為HiMA上的“起始”密碼子也編碼此氨基酸。此氨基酸在翻譯后修飾中通常被拿掉。
[0079]其它修飾如磷酸化是用于控制蛋白質(zhì)行為(例如活化或滅活某酶)的普遍機制的一部分。
[0080]可以通過使用本文中公開的方法來實現(xiàn)對翻譯后修飾信號的保存。所述方法顯著保存組織樣品中蛋白質(zhì)的翻譯后修飾信號，例如，保存至少50%、70%、90%或99%的翻譯后修飾信號。在一個例示性實施方案中，將通過翻譯后修飾信號的PAKT的免疫組織化學(xué)信號用作顯示對翻譯后修飾信號保存的指示物。[0081]蛋白酶:也稱為蛋白水解酶蛋白酶,是一大組酶。蛋白酶屬于稱為水解酶的這類酶，它們在水分子的參與下催化對各種鍵的2K經(jīng)反應(yīng)。
[0082]蛋白酶牽涉將長蛋白質(zhì)鏈消化成短片段、分裂連接氨基酸殘基的肽鍵。它們中的一些能將末端氨基酸從蛋白質(zhì)鏈脫離(外肽酶，如氨肽酶、羧肽酶A);其它蛋白酶攻擊蛋白質(zhì)的內(nèi)部肽鍵(內(nèi)肽酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶)。
[0083]依照蛋白酶的催化活性位點和作用條件將其分為4個主要的組:絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。蛋白酶對特定基團的附接取決于其活性所必需的催化位點和氨基酸(作為成分之一)的結(jié)構(gòu)。
[0084]樣品:從受試者犾得的含有基因組DNA、RNA (包括mRNA)、蛋白質(zhì)或其組合的生物學(xué)標(biāo)本。例子包括但不限于，外周血、尿液、唾液、組織活檢(biopsy)、外科手術(shù)標(biāo)本、羊膜穿刺(amniocentesis)樣品和尸檢材料。在一個實施例中，樣品包括腺癌活檢、非癌性組織的樣品和正常組織的樣品(來自未患已知疾病或病癥的受試者)。
[0085]特異性結(jié)合模塊:特異性結(jié)合對的成員。特異性結(jié)合對是一對分子，其特征在于它們彼此結(jié)合以至于實質(zhì)性排除對其它分子的結(jié)合(例如，特異性結(jié)合對能具有比結(jié)合對兩成員中任意一個與生物學(xué)樣品中其它分子的結(jié)合常數(shù)高至少IO3M'高至少IO4M4或高至少IO5M-1的結(jié)合常數(shù))。特異性結(jié)合模塊的特定例子包括特異性結(jié)合蛋白(例如抗體、凝集素、親合素如鏈霉親合素、和蛋白A)、核酸序列、和蛋白質(zhì)-核酸。特異性結(jié)合模塊還可包括這類特異性結(jié)合蛋白特異性結(jié)合的分子(或其部分)。
[0086]I1.導(dǎo)言
[0087]固定保存生物學(xué)樣品(組織或細(xì)胞)用于后續(xù)檢查。有3種用于固定組織樣品的主要方法。熱固定牽涉將樣品暴露于足夠的熱達(dá)足夠的時間以消除細(xì)胞蛋白質(zhì)的活性，由此中止細(xì)胞代謝。熱固定一般保存細(xì)胞形態(tài)學(xué)而非蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。
[0088]灌注通過血液流動固定樣品。將固定劑注射到心臟中并傳播到整個身體。此方法保存形態(tài)學(xué)，但受試者死亡且由于所需固定劑的體積該方法是昂貴的。
[0089]化學(xué)固定牽涉將組織樣品浸沒在大量化學(xué)固定劑中，其通常為要固定的組織體積的至少20倍。固定劑擴散通過組織樣品并盡可能與活組織接近地保存結(jié)構(gòu)(化學(xué)上和結(jié)構(gòu)上的)。交聯(lián)固定劑(通常為醛)創(chuàng)建組織樣品中存在的內(nèi)源性生物學(xué)分子(如蛋白質(zhì)和核酸)之間的共價化學(xué)鍵。甲醛是組織學(xué)中最常使用的固定劑?？梢砸愿鞣N濃度使用甲醛來固定，但它主要以10%中性緩沖的福爾馬林(NBF)使用，其為約3.7%甲醛在水性磷酸鹽緩沖鹽水溶液中。多聚甲醒(Paraformaldehyde)是甲醒的聚合形式,其在加熱時解聚以提供福爾馬林。戊二醛以與甲醛類似的方式運轉(zhuǎn)，但它是具有更慢的跨膜擴散速率的更大分子。戊二醛固定提供更剛性或更緊密連接的固定產(chǎn)物，其導(dǎo)致快速且不可逆的變化，在4°C快速且較好地固定，提供較好的總體細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核詳情，但對于免疫組織化學(xué)染色是不理想的。一些固定方案使用甲醛和戊二醛的組合。
[0090]II1.開發(fā)背景
[0091]眾所周知的是，能通過提高福爾馬林的溫度來增加組織固定動力學(xué)。然而，由發(fā)明人進行的最初研究指示，將組織樣品直接置于經(jīng)過加熱的福爾馬林固定劑中導(dǎo)致在福爾馬林滲透到組織中心之前組織外部就早已交聯(lián)。福爾馬林對密實組織的擴散比在升高溫度時的交聯(lián)動力學(xué)要緩慢。在此情況下，加熱中心處的生物分子而沒有任何顯著交聯(lián)，并且因此這些分子更易受到降解和損害的影響。
[0092]因此，本發(fā)明的一些公開的實施方案通過首先將組織樣品預(yù)浸泡在冷固定劑如福爾馬林中來將固定劑擴散與不想要的交聯(lián)分開。然后，在固定劑已滲透到組織后，可以提高固定劑溫度以增加交聯(lián)動力學(xué)。這表現(xiàn)為產(chǎn)生更均衡固定的保存生物分子的樣品。已進行一系列組織樣品固定實驗，其僅使用經(jīng)過加熱的福爾馬林或?qū)悠肥紫仍诘蜏?例如，從-20V至10°C、從-10°C至5°C、從-0°C至5°C或4°C )在福爾馬林中“預(yù)浸泡”，接著將同一樣品進行加熱福爾馬林處理。
[0093]作為本發(fā)明的一部分，能有效允許固定劑擴散到感興趣組織中的較低溫度溶液可能能在保存翻譯后修飾上更有效?？梢钥紤]任何降低凝固點并由此允許固定劑在低于o°c使用的對福爾馬林的添加。例如，加入高濃度的鹽通常將凝固點降低幾度。涵蓋向福爾馬林溶液直接加入鹽，由此將甲醛濃度保持相對不變。另外，由二醇構(gòu)成的溶液或抗凝固型溶液也會是有效的。這些溶液可以將凝固點降到低至-20°C。不同類型的化學(xué)添加劑的例子是本領(lǐng)域中已知的，包括但不限于各種鹽和二醇。
[0094]經(jīng)預(yù)浸泡的樣品表現(xiàn)為提供在樣品中心更好的組織形態(tài)學(xué)以及更好的抗原保存。
[0095]IV.處理步驟
[0096]本發(fā)明的某些公開的實施方案關(guān)注多步驟(通常為兩步驟)的組織固定方法，用于用醛固定劑(如福爾馬林和/或戊二醛)來輸注/擴散組織樣品。在第一步驟期間，在允許固定劑擴散貫穿樣品的基本上整個橫截面的條件下用固定劑溶液處理組織樣品。此第一步驟使用第一溫度的固定劑組合物進行第一段時間，引起基本上完全的組織輸注/擴散。第二步驟是使組織樣品在第二、更高的溫度接受固定劑組合物以允許交聯(lián)以盡可能快的速率發(fā)生，而不損害組織特征如抗原性和形態(tài)學(xué)。這些處理步驟的每一個均在下文詳細(xì)論述。
[0097]組織制備過程初始涉及固定劑溶液擴散整個樣品。這通常通過將組織樣品浸泡到在第一期望溫度的期望固定劑組合物中完成。在此初始步驟后一段時間，將組織樣品從第一溫度的固定劑溶液中取出并浸泡到在高于第一溫度的第二溫度的固定劑溶液中。此第二步驟進行期望的第二段時間。第一和第二固定劑溶液可以是相同的固定劑溶液，例如NBF，或者是不同的固定劑溶液。作為又一個例子，可以對不同步驟使用完全不同的醛固定劑，如甲醛和戊二醛。而且，代替將樣品從在第一溫度的固定劑溶液取出，可以將該固定劑溫度快速提高至第二溫度，如通過使用微波加熱。這些步驟中的一個或兩個可以伴隨著機械攪動固定劑溶液和/或可以伴隨著對樣品應(yīng)用超聲波。
[0098]在一個例示性實施方案中，本文中描述的發(fā)明使用福爾馬林作為選定的固定劑，但這不是必須的。福爾馬林在磷酸鹽緩沖液中含有3.7%甲醛并中和到約pH7.0。然而，可以在本發(fā)明中使用含有組織學(xué)領(lǐng)域中已知醛的交聯(lián)固定劑的許多變體，其包括但不限于，布安氏液、Glyoxal(乙二醛)、鋅-福爾馬林、酸性福爾馬林(AFA)和戊二醛等。
[0099]然后對組織樣品進行一系列醇浸沒，其通常使用范圍為從約70%至約100%的遞增醇濃度來使樣品脫水。醇通常是烷醇，特別是甲醇和/或乙醇。本發(fā)明的具體的工作實施方案將70%、95%和100%乙醇用于這些系列脫水步驟。
[0100]在最后一個醇處理步驟后，接著將樣品浸沒到另一種通常稱為清洗溶液的有機溶劑中。此清洗溶液(I)除去殘余的醇，并(2)使得樣品更為疏水性以進行隨后的上蠟步驟。清洗溶劑通常是芳香族有機溶劑如二甲苯。通過對樣品應(yīng)用蠟(通常為石蠟)來形成蠟塊。然后從蠟塊切出載玻片。
[0101]對于處理步驟的以下論述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會領(lǐng)會的是，可以考慮各種因素來推導(dǎo)出用于特定組織樣品的最佳處理條件。這些因素包括:樣品厚度，其通常范圍為約Imm至約IOmm厚，更通常為約2mm至約8mm厚，且甚至更通常為約4mm至約6mm厚；固定劑溶液體積對組織樣品質(zhì)量，其通常為約10:1至約50:1的體積對質(zhì)量；固定劑組合物；溫度；和樣品在固定劑組合物中的浸沒時間。
[0102]對于在交聯(lián)固定劑中浸泡的第一和第二時間的優(yōu)選描述基于ASC0CAP指南，其中優(yōu)選的組織厚度厚達(dá)約4_。組織厚度可以低于或高于4_，甚至達(dá)到整個器官。由于本發(fā)明依賴于第一擴散步驟，更厚的組織切片在冷固定劑中會需要比優(yōu)選的1-5小時更久且長達(dá)12小時或更長的第一時間。另外，本領(lǐng)域中技術(shù)人員能理解，在固定劑溶液中的第二時間可以久于優(yōu)選方法的1-5小時且長達(dá)8小時或更久。例如，6_厚的組織樣品具有在固定劑溶液中4小時的優(yōu)選第一時間，和在固定劑溶液中4小時或更久的第二時間。本領(lǐng)域中還理解，一些組織類型和一些組織器官可具有與本發(fā)明的優(yōu)選方法稍微不同的時間。
[0103]A.固定劑擴散處理
[0104]該方法的第一步驟是在有效允許組合物基本完全擴散至貫穿樣品的基本上整個橫截面的條件下用固定劑組合物處理組織樣品。第一步驟的有效溫度范圍是從高于_20°C至至少15°C，優(yōu)選高于0°C至更通常約10°C的上限溫度，且甚至更通常從約3°C至約5°C。對于工作實施方案，溫度通常為約4°C。
[0105]當(dāng)溫度升高時，交聯(lián)速率增加。而且，此第一處理步驟試圖平衡與固定劑組合物基本完全擴散貫穿組織樣品的整個橫截面有關(guān)的有益特性，同時最小化與啟動交聯(lián)有關(guān)的影響。然而，擴散也隨著溫度升高而增加，因此對于給定的樣品，已發(fā)現(xiàn)最大化擴散速率并最小化任何與增加的交聯(lián)速率有關(guān)的有害影響表現(xiàn)為增加益處。
[0106]固定劑組合物到組織樣品中的擴散持續(xù)達(dá)一段時間，該段時間對于組合物擴散貫穿樣品的基本上整個橫截面是有效的。第一處理步驟的時間段的范圍從約15分鐘至長達(dá)約4小時，最通常從超過15分鐘至約3小時，較好的結(jié)果通常通過進行固定劑組合物擴散步驟達(dá)約1.5小時至約2小時獲得。將擴散時間增加至4小時或更久一般具有極小的有益影響。
[0107]與第二處理步驟有關(guān)的溫度通常高于環(huán)境，如高于約22V。對于工作實施方案，溫度通常高于環(huán)境至高達(dá)至少55°C，更通常從約35°C至約45°C，因為該溫度范圍充分增加交聯(lián)動力學(xué)以允許相對快的組織交聯(lián)。然而，如果將溫度提高到約50°C之上，樣品通常開始降解，這對于某些后續(xù)組織學(xué)反應(yīng)可能有有害影響。如此，選擇溫度和時間段上限以允許隨后的成像處理步驟(如原位雜交、IHC和/或H&E)有效進行。第二處理步驟的時間段的范圍從超過15分鐘至長達(dá)至少約5小時，更通常為至少約I小時至約4小時，且更通常為約2小時至約3小時。某些公開的工作實施方案在45°C進行第二處理步驟達(dá)1.5小時。
[0108]B.附圖論述
[0109]圖1A_1D(細(xì)胞周期蛋白Dl)和2A-2D(bcl_2)來自一系列對照載玻片，其中將組織樣品浸沒于室溫福爾馬林中分別達(dá)0、2、4和24小時。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)需要至少6小時，且更通常地至少8小時，長達(dá)72小時的室溫福爾馬林固定時間。由圖1A-1C提供的對照圖像例示，不充分固定組織樣品(即0、2和4小時的處理時間)時使用細(xì)胞周期蛋白Dl免疫組織化學(xué)染色方案染色不佳。對照載玻片2A-2C例示，不充分固定組織樣品(即0、2和4小時的處理時間)時使用bcl-2免疫組織化學(xué)染色方案染色不佳。然而，如基于已知標(biāo)準(zhǔn)會預(yù)期到的，將固定時間增加至24小時(圖1D和2D)提供經(jīng)可接受染色的組織樣品。
[0110]圖3A-3H例示將預(yù)浸泡處理用于bcl-2染色的影響。圖3A-3C是未預(yù)浸泡處理并浸沒到40°C 10%NBF溶液中分別達(dá)10分鐘、20分鐘和60分鐘的組織樣品的圖像。圖3D-3F是在10%福爾馬林固定溶液中預(yù)浸泡處理2小時，接著浸沒到40°C 10%NBF溶液中分別達(dá)10分鐘、20分鐘和60分鐘的組織樣品的圖像。圖3G是來自圖3C的區(qū)域的放大圖，而圖3H是來自圖3F的區(qū)域的放大圖。圖3A例示來自無預(yù)浸泡和10分鐘、40°C 10%NBF溶液處理的未充分染色結(jié)果。染色程度隨著30分鐘和60分鐘的處理時間延長而增加，其結(jié)果分別由圖3B和3C提供。圖3D-3F也例示預(yù)浸泡提供增強的染色結(jié)果。然而，可能甚至更具重要性的是通過應(yīng)用不同處理方案導(dǎo)致的組織染色的均衡性。圖3A-3C相對于其時間對應(yīng)物從樣品的外部部分至內(nèi)部部分是不均衡染色的，所述時間對應(yīng)物在4°C 10%福爾馬林固定溶液中進行2小時預(yù)浸泡。此外，每份經(jīng)預(yù)浸泡的樣品還具有增強的染色。
[0111]圖3G和3H分別來自人扁桃體樣品生發(fā)中心的圖3C和3F的代表性區(qū)域。圖3C顯示組織樣品的染色沒有圖3F的代表性區(qū)域好，圖3F的代表性區(qū)域是在4°C 10%福爾馬林固定溶液中進行2小時預(yù)浸泡。圖3G打分為2+，而3H打分為3+。還有，圖3H包含在載玻片中部的已染色的未成熟的淋巴細(xì)胞，這提供清楚指示，即使用在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡實質(zhì)性增加了染色方案的靈敏性。圖3G未允許顯現(xiàn)這些淋巴細(xì)胞。
[0112]圖4A和4B是圖3G和3H的增強的圖像。圖4B的箭頭例示使用在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡所產(chǎn)生圖像結(jié)果的增強的詳情。組織形態(tài)學(xué)對于使用在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡產(chǎn)生的組織樣品也更好。這可以通過觀察圖像左邊和圖像內(nèi)部看到。對于未在4°C 10%福爾馬林固定溶液中進行2小時預(yù)浸泡的組織樣品，福爾馬林未擴散到內(nèi)部，因此樣品的形態(tài)學(xué)(圖4A)不像使用在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡產(chǎn)生的組織樣品的形態(tài)學(xué)(圖4B)那樣得到保存。如果允許在后面應(yīng)用的提高溫度的處理步驟之前發(fā)生擴散，那么樣品的化學(xué)和結(jié)構(gòu)保存要好得多。圖像的白空間例示較差固定的區(qū)域。當(dāng)將這類組織樣品在隨后脫水時，組織收縮并產(chǎn)生更大體積的白區(qū)域，其指示較差的固定。
[0113]圖5是通過對組織樣品的H&E染色獲得的組織形態(tài)學(xué)結(jié)果的示意圖，上述組織樣品首先用在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡處理，接著相對于室溫對照用在35°C、40°C、45°C和5(TC的10%中性緩沖的福爾馬林溶液處理達(dá)0.5至6小時的不同時間段。24小時室溫載玻片是期望的標(biāo)準(zhǔn)，將處理方案與其進行比較。圖5匯總了數(shù)項試驗的結(jié)果，其聚焦于確定提供優(yōu)越組織形態(tài)學(xué)的最佳的第二更高溫度的浸泡。盡管圖5例示使用高達(dá)50°C的交聯(lián)處理溫度獲得的結(jié)果，但還嘗試了高得多的處理溫度。然后主觀評估每份組織樣品。淺灰色單元指示不想要的結(jié)果；中灰色單元指示中等但并非最佳的結(jié)果；而深灰色單元指示該組織樣品與24小時室溫結(jié)果是可比的。溫度越高，就需要越少的時間來實現(xiàn)期望的組織形態(tài)學(xué)。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員會領(lǐng)會，通過用高達(dá)50°C的福爾馬林交聯(lián)處理溫度僅2至6小時提供較好的組織樣品。
[0114]圖6是通過使用對組織樣品的二氨基聯(lián)苯胺染色所獲得的bcl-2免疫組織化學(xué)結(jié)果的示意圖，該組織樣品首先用在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡處理，接著相對于室溫對照用在35°C、40°C、45°C和50°C的10%中性緩沖的福爾馬林溶液處理達(dá)0.5至6小時的不同時間段。再一次地，增加溫度的結(jié)果的深灰色單元是與24小時室溫結(jié)果可比的結(jié)果。對于組織形態(tài)學(xué)和H&E染色，增加溫度的處理步驟的溫度和時間不太重要，直至使用高達(dá)65°C的溫度。在該溫度后，組織形態(tài)學(xué)受到有害影響。然而，如圖6中指示的，IHC染色對于為上限溫度處理步驟選擇的溫度更敏感。不受具體操作理論束縛，可能的情況是更高的溫度使蛋白質(zhì)變性，抗體也不識別或完全不識別蛋白質(zhì)上的表位，因此產(chǎn)生降解的IHC染色結(jié)果。如此，通過考慮對組織形態(tài)學(xué)、IHC和原位雜交技術(shù)的影響來最好地選擇特定方案。
[0115]圖7例示對于無預(yù)浸泡測試相比于在4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡，來自IHC染色的抗原性結(jié)果。加熱一般對于組織樣品是潛在有害的。這可以對于無預(yù)浸泡測試結(jié)果看到。對未進行4°C 10%福爾馬林固定溶液中2小時預(yù)浸泡的樣品在45°C和50°C任何加熱在抗原性染色結(jié)果上具有強烈的負(fù)面影響。相比之下，對于在4°C 10%福爾馬林固定溶液中進行2小時預(yù)浸泡的樣品，將組織樣品在45°C和50°C加熱達(dá)短至0.5小時至長達(dá)I至2小時產(chǎn)生與24小時室溫方法可比的圖像結(jié)果。
[0116]圖8-10例示通過考慮樣品的不同預(yù)浸泡時間所獲得的抗原性和組織形態(tài)學(xué)結(jié)果，所述樣品在4 °C 10%福爾馬林固定溶液中處理達(dá)在圖頂部指示的時間量,接著在45 °C組織固定達(dá)在各單元中指示的時間段。圖8-10例示僅預(yù)浸泡I小時對于抗原性結(jié)果實質(zhì)性有益，但2-4小時浸泡對于最佳組織形態(tài)學(xué)結(jié)果可能是優(yōu)選的。
[0117]圖1lA-E例示翻譯后修飾信號保存，即用不同固定方案對Calu-3異種移植物上pAKT染色的顯微鏡圖像。將新鮮收獲的Calu-3異種移植物腫瘤切成兩個大致相等的部分，并用在RT的10%NBF (福爾馬林)或在4°C的10%NBF處理。在取出腫瘤5分鐘以內(nèi)，將用RT福爾馬林處理的腫瘤樣品直接置于溶液中。然后，在浸沒后O(A)、2 (B)、4(C)或24(D)小時的時間間隔時將樣品從福爾馬林取出。將一份腫瘤樣品直接置于4°C福爾馬林中2小時，然后轉(zhuǎn)移至45°C福爾馬林再達(dá)2小時(雙重溫度固定方案)。在所述雙重溫度固定方案(2+2) (E)中，抗pAKT抗體的染色指示保留比標(biāo)準(zhǔn)RT福爾馬林方法顯著更多的pAKT (將24小時(D)與2+2小圖(E)比較)。
[0118]圖12A-D例示在圖1lA-E中觀察到的信號確實是翻譯后修飾保存，其通過有(B和D)或無磷酸酶處理(A和C)在Calu-3異種移植物上對pAKT染色來證明。當(dāng)用磷酸酶處理樣品時(B和D)，消除了抗體的特異性染色，這指示該抗體識別磷酸-模塊并且是特異性的。
[0119]圖13A-B例示用所述雙重溫度固定方法(2+2;B)的翻譯后修飾保存，其通過在具有原位導(dǎo)管癌(DCIS)的人乳腺上用抗pAKT抗體對pAKT染色來證明。在所述雙重溫度固定(2+2;B)方案中保存比標(biāo)準(zhǔn)RT福爾馬林方法顯著更多的pAKT(將24小時㈧與2+2小圖比較)。另外，染色對于在所述雙重溫度固定方案樣品中的膜表現(xiàn)為遠(yuǎn)遠(yuǎn)更特異性的。
[0120]圖14A-D例示用所述雙重溫度固定方法(2+3.5;B)的翻譯后修飾保存，其通過在Calu-3異種移植物上用抗pAKT抗體對pAKT染色來證明。圖14F是對圖14A-D中顯示的PAKT陽性染色的定量分析的示意圖。在所述雙重溫度固定(2+3.5)樣品中保存比標(biāo)準(zhǔn)RT福爾馬林方法顯著更多的pAKT(將24小時與2+3.5小圖比較)。在4°C的第一溫度浸泡對于保存磷酸標(biāo)志物是必要的，因為沒有第一冷浸泡直接置于經(jīng)過加熱的福爾馬林中的腫瘤樣品沒有保留PAKT染色(0+3.5小圖)。
[0121]圖15A-F例示在取出樣品后的翻譯后信號降解。將新鮮收獲的Calu-3異種移植物腫瘤切成兩個大致相等的部分，包裹在鹽水浸泡過的紗布中并置于濕冰上O(A)、10(B)、30 (C)、60 (D)、120 (E)或240 (F)分鐘。然后，將每份樣品置于4°C福爾馬林中2小時，接著轉(zhuǎn)移至45°C福爾馬林再達(dá)2小時。pAKT信號在取出后30分鐘內(nèi)顯著降低(C)，即使在冷卻至4°C濕冰時也是如此。
[0122]圖16A-1例示用本發(fā)明的方法在人結(jié)腸癌上對磷酸標(biāo)志物的保存(底部小圖)。還將樣品用蘇木精和曙紅染色(頂部小圖)以用于比較組織形態(tài)學(xué)。圖16J和K是在不同固定條件下在正常細(xì)胞(在每個示意圖的右手邊顯示的3個條)和癌瘤細(xì)胞(在每個示意圖的左手邊顯示的3個條)中對pAKT或pPRAS40陽性染色的定量分析的示意圖。出于定量目的使用Aperio載玻片掃描儀掃描載玻片(下部圖)。將像素分成(binned)指示陽性(褐色)或陰性(藍(lán)色)的組(由陰性、弱陽性、中等陽性和強陽性組成的4個組)。在圖中報告陽性像素的百分比(所有陽性像素的總和)。在所述雙重溫度固定(2+2)方案中保存比標(biāo)準(zhǔn)RT福爾馬林方法顯著更多的磷酸標(biāo)志物(將24小時與2+2小圖比較)。另外，經(jīng)歷有目的的缺血的樣品具有比通過所述雙重溫度固定方案固定的樣品或通過24小時室溫標(biāo)準(zhǔn)方案固定的樣品顯著更少的磷酸標(biāo)志物的保留。
[0123]圖17A和B是在人乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)中對miRNA保存染色的顯微鏡圖像，依照所述雙重溫度固定方案(2小時4°C 10%NBF，接著是2小時45°C 10%NBF)保存含有原位導(dǎo)管癌(DCIS)的乳腺組織樣品，其與那些通過標(biāo)準(zhǔn)24小時室溫福爾馬林浸泡所固定的樣品相比較。在兩種樣品中均清楚可見miR205染色的強度(強烈的藍(lán)色信號，例示信號由箭頭指示)。2+2樣品的保存表現(xiàn)為比標(biāo)準(zhǔn)對照24小時固定的組織的保存更為強烈。
[0124]圖18A和B是在人乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)中對DNA保存染色的顯微鏡圖像。實施Ventana的雙重ISH方案(DDISH，染色體17/HER2)來測試檢測兩種不同DNA靶物的單一和多個拷貝的能力。依照Ventana快速固定方案(2小時4°C 10%NBF，接著是2小時450C 10%NBF)保存含有原位導(dǎo)管癌(DCIS)的乳腺組織樣品，其與那些通過標(biāo)準(zhǔn)24小時室溫福爾馬林浸泡所固定的樣品相比較。這例示了所述雙重溫度固定方案保存組織中的核酸DNA并能通過商品化探針檢測出來。
[0125]圖19A、B和C是在人結(jié)腸癌上對Hifla保存染色的顯微鏡圖像。收獲人結(jié)腸樣品并在從患者取出3-7分鐘內(nèi)進行處理。將樣品切成大致4_的片，并用3種不同的方案處理。在方案I中，將樣品直接置于4°C的福爾馬林中2小時，然后轉(zhuǎn)移至45°C福爾馬林再達(dá)2小時(A)。在方案2中，將樣品置于室溫福爾馬林在浸沒后達(dá)24小時(B)。在方案3中，使樣品有目的地缺血I小時，然后置于室溫福爾馬林達(dá)24小時(C)。在所述雙重溫度固定(2+2)方案中保存比標(biāo)準(zhǔn)RT福爾馬林方法顯著更多的Hifla (將24小時與2+2小圖比較)。另外，經(jīng)歷有目的地缺血的樣品具有比通過所述雙重溫度固定方案固定的樣品(2+2)或通過標(biāo)準(zhǔn)24小時固定方案固定的樣品顯著更少的Hifl a的保留。
[0126]V.本發(fā)明的使用
[0127]本發(fā)明可與傳統(tǒng)組織化學(xué)以及免疫組織化學(xué)和原位雜交領(lǐng)域中已知的任意染色系統(tǒng)和方案一起使用。本發(fā)明還可以與各種自動化染色系統(tǒng)一起使用，如那些由Ventana Medical Systems, Inc.，Tucson, AZ 銷售的，包括 Benchmark XT、BenchmarkUltra和Discovery自動化平臺。例示性系統(tǒng)披露于美國專利N0.6，352，861、美國專利N0.5，654，200、美國專利N0.6，582，962、美國專利N0.6，296，809和美國專利N0.5，595, 707。
[0128]下列描述例不了自動化方法和系統(tǒng)的一個合適的實施方案。關(guān)注自動化系統(tǒng)和方法的另外的信息還可見于PCT/US2009/067042。顯色檢測有助于對裝置上樣式的視覺獨立的解譯。
[0129]在例示性實施方案中，經(jīng)由與多種酶(例如辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP))綴合的抗-物種抗體實現(xiàn)檢測。根據(jù)綴合至各抗體的酶的多樣性，將此酶-抗體綴合物稱為HRP或AP多聚體。多聚體技術(shù)記載于美國申請N0.12/687，564。
[0130]此類型的檢測化學(xué)技術(shù)目前由Ventana Medical Systems Inc.作為ultraView通用DAB檢測試劑盒(P/N760-500)、ultraView通用AP紅檢測試劑盒(P/N760-501)、ultraView 紅 ISH DIG 檢測試劑盒(P/N760-505)和 ultraView SISH DNP 檢測試劑盒(P/N760-098)銷售。
[0131]在例示性實施方案中，該辦法使用非內(nèi)源性半抗原(例如，非生物素，參見美國申請N0.12/660, 017)。在例示性實施方案中，可以與此辦法一起使用酪酰胺(tyramide)信號擴大以進一步增加檢測的靈敏性和動力學(xué)范圍(參見PCT/US2011/042849)。
[0132]任何合適的酶/酶底物系統(tǒng)可以用于所公開的固定方法。工作實施方案通常使用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。如果酶是堿性磷酸酶，那么一種合適的底物是硝基藍(lán)氯化四唑(nitro blue tetrazolium chloride) / (5-溴-4-氯-1H-卩引哚-3-基)二氫憐酸(NBT/BCIP)。如果酶是辣根過氧化物酶，那么一種合適的底物是二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。眾多其他的酶-底物組合是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對于這些的一般綜述，參見美國專利N0.4，275，149和4，318，980。在一些實施方案中，酶是過氧化物酶，如辣根過氧化物酶或谷胱甘肽過氧化物酶或氧化還原酶。
[0133]美國專利公開2008/0102006描述了由微型處理器操作和控制的機器人流體分配器。美國專利公開2011/0311123描述了用于自動化檢測免疫組織化學(xué)(IHC)樣式的方法和系統(tǒng)。在這些專利申請中披露的自動化檢測系統(tǒng)可用于檢測本發(fā)明所固定的組織樣品。
實施例
[0134]提供下列實施例以例示本發(fā)明工作實施方案的某些特征。本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員會領(lǐng)會本發(fā)明的范圍不限于在這些實施例中所記載的特征。
[0135]實施例1
[0136]本實施例關(guān)注在30°C、40°C、5(rC和60°C固定的小鼠腎樣品的固定時間過程，并確認(rèn)先前用人組織樣品獲得的結(jié)果。小鼠腎自Ventana Medical Systems, Inc的BMAC部
門新鮮獲得。
[0137]將20ml福爾馬林(10%NBF)置于50ml錐形管中。將管置于設(shè)成30°C、40°C、50°C或60°C的標(biāo)準(zhǔn)VWR加熱塊中。將小鼠腎切成兩半并將3片置于每個錐形管中。在每個溫度浸泡10、30和60分鐘后取出一片。
[0138]通過將小鼠腎置于室溫福爾馬林達(dá)0、2、6和23小時進行對照。所有樣品均在Renaissance 組織處理器(Ventana Medical Systems, Inc.;目錄號 V-REN)中處理并包埋在石蠟塊中。將切出的載玻片用Gills II蘇木精和曙紅Y染色用于組織形態(tài)學(xué)分析。
[0139]O小時和2小時對照組織顯示特征性的乙醇固定特性。23小時對照要好得多。固定的量與溫度和時間相關(guān)。50°C組織接近用23小時對照獲得的結(jié)果。
[0140]實施例2
[0141]此實施例關(guān)注在50°C、60°C、70°C、8(rC和90°C延長的福爾馬林熱浸泡以確定在形態(tài)學(xué)或抗原性受損之前能對樣品應(yīng)用多少熱。用福爾馬林浸泡重復(fù)實施例1，但將人扁桃體片浸沒到加熱至50°C、60°C、70°C、8(TC和90°C的10%NBF中。如下文例示的嘗試各個時
間點:
[0142]
【權(quán)利要求】
1.一種用于固定組織樣品的方法，其包括: a)使所述組織樣品與處于第一溫度的第一醛溶液接觸達(dá)第一時間段，該 第一時間段足以使所述溶液擴散到所述組織樣品中；并 b)將a)中獲得的組織樣品的溫度快速提高至第二溫度，在所述第二溫度達(dá)第二時間段，其中所述第一溫度為約_20°C至約15°C，所述第二溫度為約22°C至至少約50°C，而且所述第二時間段足以保存所述組織樣品的翻譯后修飾信號。
2.依照權(quán)利要求1的方法，其中通過將所述組織樣品加熱至所述第二溫度來提高所述組織樣品的所述溫度。
3.依照權(quán)利要求1的方法，其中通過將所述組織樣品浸沒到處于所述第二溫度的第二醛溶液中來提高所述組織樣品的所述溫度。
4.依照權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中所述溶液是醛溶液或水。
5.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第一溫度從約0°C至約15°C。
6.依照權(quán)利要求5的方法，其中所述醛溶液處于從3°C至約5°C的第一溫度。
7.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第一時間段的范圍從約15分鐘至長達(dá)約4小時。
8.依照權(quán)利要求7的方法，其中所述第一時間段的范圍從約I小時至約2小時。
9.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第二溫度為約35°C至約45°C。
10.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述第二時間段從超過15分鐘至長達(dá)至少約5小時。
11.依照權(quán)利要求10的方法，其中所述第二時間段為約2小時至約3小時。
12.依照權(quán)利要求3的方法，其中所述第二醛溶液與所述第一醛溶液相同或與所述第一醛溶液不同。
13.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述醛是低級烷基醛。
14.依照權(quán)利要求13的方法，其中所述醛選自福爾馬林、戊二醛及其組合。
15.一種用于固定組織的方法，其包括: 將組織樣品浸沒到處于超過(TC至約5°C的第一溫度的福爾馬林溶液中達(dá)超過15分鐘至長達(dá)約4小時的第一時間段；并將所述組織樣品浸沒到處于超過約22°C的第二溫度的福爾馬林溶液中達(dá)約I小時至約4小時的第二時間段。
16.依照權(quán)利要求15的方法，其在將所述組織樣品浸沒到處于第二溫度的福爾馬林溶液中后進一步包括一系列醇清洗。
17.依照權(quán)利要求16的方法，其進一步包括超過O分鐘至長達(dá)約30分鐘的二甲苯清洗。
18.一種用于固定組織的方法，其包括: 將處于超過O至約5°C的第一溫度的福爾馬林溶液應(yīng)用到所述組織樣品達(dá)超過15分鐘至長達(dá)約4小時的第一時間段；并 將所述組織樣品的溫度提高到超過約22°C的第二溫度達(dá)約I小時至約4小時的第二時間段。
19.依照權(quán)利要求1的方法生成的固定的組織樣品。
20.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述方法顯著保存所述組織樣品的翻譯后修飾信號。
21.依照權(quán)利要求1的方法，其中所述組織樣品是FFPE組織樣品。
22.依照權(quán)利要求1的方法，其進一步包括在自動檢測系統(tǒng)中檢測所述固定的組織樣品。
【文檔編號】G01N1/30GK103518127SQ201280018757
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月17日
【發(fā)明者】M.奧特, A.皮爾遜, D.查芬, E.羅伯茨 申請人:文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司