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分析樣品組分的方法

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分析樣品組分的方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了用于將毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)在線偶聯(lián)于高分辨率質(zhì)譜的方法和系統(tǒng),在該方法和系統(tǒng)中,包含極性有機(jī)溶劑和有機(jī)酸的鞘流緩沖液既用作用于(cIEF)的固定溶液又用作用于電噴霧電離(ESI)的電離溶液。
【專利說(shuō)明】分析樣品組分的方法
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 重組蛋白作為治療劑變得日益重要。重組蛋白可以使用細(xì)胞株制造,例如非人類 哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞株,這些細(xì)胞株被工程改造成表達(dá)特定人類基因序列以產(chǎn)生所關(guān)注的蛋 白質(zhì)。在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生目標(biāo)蛋白后,該目標(biāo)蛋白可以通過(guò)已知工藝純化到高純度水平。 然而,由宿主細(xì)胞株產(chǎn)生的痕量污染蛋白(稱為宿主細(xì)胞蛋白或HCP)可以存在于耗乏的細(xì) 胞培養(yǎng)物中。
[0003] HCP可以潛在地影響產(chǎn)品質(zhì)量和安全性。因此,重要的是對(duì)存在于治療性產(chǎn)品中的 HCP進(jìn)行表征以減低這些風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)HCP的當(dāng)前表征方法(如二維凝膠電泳)傾向于勞動(dòng) 密集的和繁瑣的,這可以限制這些用于HCP表征的方法的使用,尤其在商業(yè)生產(chǎn)期間。
[0004] 電泳是指離子通過(guò)電場(chǎng)中的吸引或排斥作出的不同移動(dòng)或遷移。毛細(xì)管等電聚 焦(CIEF)是基于樣品組分等電點(diǎn)(pi)差異的高分辨率分離技術(shù)并且適合用于分離兩性物 質(zhì),如氨基酸、肽以及藥物。在cIEF中,蛋白質(zhì)在電場(chǎng)的影響下通過(guò)由載體兩性電解質(zhì)(CA) 形成的pH梯度遷移。帶正電荷的兩性電解質(zhì)朝著陰極遷移,而帶負(fù)電荷的兩性電解質(zhì)朝著 陽(yáng)極遷移。因此,pH朝著毛細(xì)管的陰極端增大而朝著陽(yáng)極端減小。在兩性電解質(zhì)到達(dá)自身 pi并且不再帶電時(shí),遷移停止,引起穩(wěn)定pH梯度的形成。兩性分析物將最終遇到它會(huì)具有 零凈電荷的pH并且將因此停止遷移,引起分析物利用pi的聚焦或分離。cIEF已與許多檢 測(cè)技術(shù)(包括UV吸光度、激光誘發(fā)的熒光以及質(zhì)譜(MS))偶聯(lián)。
[0005] 質(zhì)譜(MS)是將化合物電離以產(chǎn)生帶電分子或分子片段的分析技術(shù),這些分子或 分子片段接著根據(jù)它們的質(zhì)荷比在分析器中使用電磁場(chǎng)分離。接著,可以對(duì)所分離的離子 進(jìn)行檢測(cè)和分析。
[0006] 大氣壓電離(API)來(lái)源可以用于將樣品分子在大氣壓下電離并且接著將這些離 子轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜儀中。API適于電離熱不穩(wěn)定樣品,如聚合物和肽。電噴霧電離(ESI)是API 應(yīng)用,該應(yīng)用時(shí)常用于熱不穩(wěn)定和高分子量化合物(如聚合物和肽,它們是低或非揮發(fā)性 的)的MS。
[0007] 然而,用于生物樣品(尤其蛋白質(zhì)降解物)的CIEF與ESI-MS的在線偶聯(lián)已具挑 戰(zhàn)性。因此,需要改進(jìn)的用于生物樣品的cIEF與ESI-MS的在線偶聯(lián)。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 在此描述了用于鑒別并分析樣品中的一種或多種組分的方法。在一個(gè)實(shí)施例中, 該樣品包括異質(zhì)的生物分子混合物。在另一個(gè)實(shí)施例中,該樣品包括重組蛋白耗乏的細(xì)胞 培養(yǎng)物。在更特定實(shí)施例中,一種或多種組分包括宿主細(xì)胞蛋白。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品 包括重組單克隆抗體耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物并且一種或多種樣品組分包括宿主細(xì)胞蛋白。在更 具體實(shí)施例中,本發(fā)明提供了用于鑒別耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)組 分的方法。
[0010] 在一個(gè)實(shí)施例中,該方法包括以下步驟:(a)通過(guò)毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)分離該 樣品中的一種或多種組分;(b)使用鞘流溶液將分離的組分從分離腔室轉(zhuǎn)移到電離儀器; (c)將這些樣品組分電離;并且(d)通過(guò)質(zhì)譜(MS)鑒別并分析該樣品中的一種或多種組 分。在一個(gè)實(shí)施例中,該電離儀器包括電噴霧電離(ESI)儀器。
[0011] 在本發(fā)明的方法中,該鞘流溶液既充當(dāng)用于該分離腔室的動(dòng)員溶液又充當(dāng)用于該 電離儀器的電離溶液。在更具體實(shí)施例中,該鞘流緩沖液包含在約30%與約50%之間的極 性有機(jī)溶劑和在約0.01%與〇. 1%之間的有機(jī)酸。該極性有機(jī)溶劑可以是極性質(zhì)子溶劑或 極性非質(zhì)子溶劑。在一個(gè)實(shí)施例中,該極性質(zhì)子溶劑包括脂肪醇,例如甲醇、乙醇、丙醇、丁 醇、異丙醇以及其組合。在另一個(gè)實(shí)施例中,該極性非質(zhì)子溶劑包括乙腈。在一個(gè)實(shí)施例中, 該有機(jī)酸是選自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其組合。在一個(gè)實(shí)施例中,該有機(jī)酸的 pKa在約4. 0與5. 0之間。在更具體實(shí)施例中,該鞘流溶液包含在約30%與約50%之間的 脂肪醇和在約〇. 01 %與〇. 1 %之間的甲酸。在一個(gè)實(shí)施例中,該鞘流溶液包含在約30%與 約50%之間的甲醇和在約0. 01 %與0. 1 %之間的甲酸。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中,分離包括以下步驟:(a)將一定體積的該樣品和兩性電解質(zhì)緩 沖液引入到該分離腔室中,其中該分離腔室包括毛細(xì)管;并且(b)在高達(dá)約50kV的聚焦電 壓下將該樣品和該兩性電解質(zhì)緩沖液在該分離毛細(xì)管中聚焦。在更具體實(shí)施例中,該聚焦 電壓是在約5kV與約50kV之間。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品在介于約300V/cm與約600V/cm 之間的外加電場(chǎng)下聚焦。在更具體實(shí)施例中,該外加電場(chǎng)是在約300V/cm與約400V/cm之 間。
[0013] 在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品在高達(dá)約50kV的動(dòng)員電壓下轉(zhuǎn)移到該電離儀器。在更 具體實(shí)施例中,該動(dòng)員電壓是在約5kV與約50kV之間。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品在介于約 300V/cm與約600V/cm之間的外加電場(chǎng)下轉(zhuǎn)移到該電離儀器。在更具體實(shí)施例中,該樣品在 介于約300V/cm與約350V/cm之間的外加電場(chǎng)下轉(zhuǎn)移到該電離儀器。
[0014] 在另一個(gè)實(shí)施例中,該樣品通過(guò)水動(dòng)力注射轉(zhuǎn)移到該電離儀器。在一個(gè)實(shí)施例中, 水動(dòng)力注射包括在該分離腔室的入口處使用注射器施加介于約〇. 5psi與約50psi之間的 壓力。在另一個(gè)實(shí)施例中,水動(dòng)力注射包括在該分離腔室的出口處施加介于約0. 5psi與約 50psi之間的真空。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室是毛細(xì)管,該毛細(xì)管具有體積,并且所引入的樣品體 積小于或等于該毛細(xì)管體積。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品體積是在該毛細(xì)管體積的約25%與 約100%之間。在另一個(gè)實(shí)施例中,所引入的樣品體積是在約lyL與25iiL之間。在一個(gè) 實(shí)施例中,該樣品包含各在約0. 1Ug/ml與10mg/ml之間的一種或多種兩性樣品組分。
[0016] 在一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室是毛細(xì)管,該毛細(xì)管是熔融硅石(Si02)毛細(xì)管。在 一個(gè)實(shí)施例中,該毛細(xì)管包括聚合涂層。在更具體實(shí)施例中,該聚合涂層是選自聚丙烯酰胺 (LPA)、甲基纖維素、聚乙烯醇(PVA)以及其組合。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施例中,該兩性電解質(zhì)包括選自Ampholine?、Biolyte?、Pharmalyte?、 Servalyt?以及其組合的載體兩性電解質(zhì)(CA)。在一個(gè)實(shí)施例中,該兩性電解質(zhì)包括在 約0.1%與約10%之間的?1^1'111&1 7仏1\在一個(gè)實(shí)施例中,該兩性電解質(zhì)包括窄口11范 圍的載體兩性電解質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中,該兩性電解質(zhì)包括寬pH范圍的載體兩性電解 質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中,該兩性電解質(zhì)包括選自Pharmalyte(l-3)、Pharmalyte(5_8)以及 Pharmalyte(3-10)的Pharmalyte?。在一個(gè)實(shí)施例中,該兩性電解質(zhì)包括在約2 %與約8 % 之間的Pharmalyte(3-10)溶液。在另一個(gè)實(shí)施例中,兩性電解質(zhì)是包含酸性和堿性兩種官 能團(tuán)的低分子量分子(如氨基酸)的混合物。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施例中,該方法還包括在將該樣品引入到該分離毛細(xì)管中之前降解該樣 品中的一種或多種組分的步驟。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品中的一種或多種組分是用蛋白水 解酶(包括例如絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋 白酶、谷氨酸蛋白酶以及其組合)降解的。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品中的一種或多種組分是 用胰蛋白酶降解的。在一個(gè)實(shí)施例中,該蛋白水解酶被固定在固體支撐物上。在更特定實(shí) 施例中,胰蛋白酶被固定在固體支撐物上。在一個(gè)實(shí)施例中,該固體支撐物是選自聚合物粒 子、玻璃、膜、凝膠珠粒、溶膠-凝膠支撐物、多孔硅基體、多孔整體材料、磁性材料以及其組 合。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品中的一種或多種組分是在介于約25°C與約40°C之間的溫度下 或在介于約30°C與約40°C之間的溫度下降解的(例如通過(guò)固定的胰蛋白酶進(jìn)行)。在一個(gè) 實(shí)施例中,該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品與該蛋白水解酶一起孵育歷時(shí)在約 1小時(shí)與約20小時(shí)之間來(lái)降解的。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將 該樣品與該蛋白水解酶(例如固定的胰蛋白酶)一起孵育歷時(shí)在約30秒與約30分鐘之間 來(lái)降解的。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品與該蛋白水解酶 一起孵育歷時(shí)在約5小時(shí)與約15小時(shí)之間來(lái)降解的。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品中的一種或 多種組分是通過(guò)將該樣品與該蛋白水解酶一起孵育至少約12小時(shí)來(lái)降解的。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品在降解之后用水稀釋,與載體兩性電解質(zhì)組合并且被引 入到該分離腔室。在一個(gè)實(shí)施例中,該樣品以在約2:1與1:2之間的水與樣品比率用水稀 釋。
[0020] 在一個(gè)實(shí)施例中,一種或多種組分包括蛋白質(zhì)并且該方法包括在將樣品引入到該 分離腔室中之前將該樣品中的蛋白質(zhì)變性。在一個(gè)實(shí)施例中,將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包 括熱變性。在一個(gè)實(shí)施例中,將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品溶液與非離子表面活 性劑一起孵育。在一個(gè)實(shí)施例中,將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與堿組合以形成 pH在約8與約10之間的堿性溶液,并且將這些蛋白質(zhì)在該溶液中孵育至少約5分鐘或在約 5分鐘與約60分鐘之間。在一個(gè)實(shí)施例中,將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與酸組 合以形成pH在約2與約3之間的酸性溶液,并且將這些蛋白質(zhì)在該溶液中孵育至少約5分 鐘或在約5分鐘與約60分鐘之間。在一個(gè)實(shí)施例中,熱變性包括將該樣品在介于約60°C 與約80°C之間的高溫下孵育至少約5分鐘或在約5分鐘與約60分鐘之間。在一個(gè)實(shí)施例 中,將該樣品中的這些蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與包括碳酸氫銨的變性溶液一起孵育。在 一個(gè)實(shí)施例中,該變性溶液進(jìn)一步包括尿素。在一個(gè)實(shí)施例中,該變性溶液進(jìn)一步包括有機(jī) 溶劑,如甲醇或乙腈(ACN)。在一個(gè)實(shí)施例中,將該樣品中的這些蛋白質(zhì)變性包括將該樣品 與包括有機(jī)溶劑(如甲醇或乙腈)的變性溶液一起孵育約30分鐘。
[0021] 在一個(gè)實(shí)施例中,該方法進(jìn)一步包括將該樣品與還原溶液和/或烷基化溶液一起 孵育。在一個(gè)實(shí)施例中,該還原溶液是選自二硫蘇糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、 三丁基膦(TBP)以及其組合。在一個(gè)實(shí)施例中,該烷基化溶液包括碘乙酰胺(IAA)、巰 基乙醇或其組合。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于將毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)和質(zhì)譜(MS)接口連接的系統(tǒng)。該 系統(tǒng)包括:(a)cIEF儀器,具有用于將液體樣品中的一種或多種組分分離并聚焦的分離腔 室;(b)電壓電源,用于將電位施加在該分離腔室兩端,其中該分離腔室包含樣品和載體兩 性電解質(zhì)并且該電位將該樣品中的一種或多種組分分離并聚焦;(c)鞘流溶液,用于將一 種或多種已分離并聚焦的組分從該cIEF儀器的該分離腔室直接轉(zhuǎn)移到發(fā)射器,該發(fā)射器 被配置成將該溶液供應(yīng)到電噴霧電離(ESI)儀器;以及(d)MS儀器,用于分析樣品分析物。
[0023] 在一個(gè)實(shí)施例中,該鞘流緩沖液包含在約30%與約50%之間的極性有機(jī)溶劑和 在約0. 01 %與0. 1 %之間的有機(jī)酸。在一個(gè)實(shí)施例中,該極性有機(jī)溶劑是選自極性質(zhì)子溶 劑和極性非質(zhì)子溶劑。在一個(gè)實(shí)施例中,該極性質(zhì)子溶劑包括脂肪醇。在一個(gè)實(shí)施例中,該 脂肪醇是選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇以及其組合。在一個(gè)實(shí)施例中,該極性非質(zhì)子 溶劑包括乙腈。在一個(gè)實(shí)施例中,該有機(jī)酸是選自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以及其組 合。在一個(gè)實(shí)施例中,該有機(jī)酸的pKa在約4. 0與5. 0之間。在更具體實(shí)施例中,該鞘流溶 液包含在約30 %與約50 %之間的甲醇和在約0. 01 %與0. 1 %之間的甲酸。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施例中,該cIEF儀器包括陽(yáng)極、陰極、陽(yáng)極電解質(zhì)儲(chǔ)槽以及陰極電解質(zhì) 儲(chǔ)槽。在一個(gè)實(shí)施例中,該陽(yáng)極電解質(zhì)儲(chǔ)槽包含了包括酸(如磷酸、甲酸、天冬氨酸或其組 合)的陽(yáng)極電解質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施例中,該陰極電解質(zhì)儲(chǔ)槽包含了包括堿(如氫氧化鈉、氫氧 化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀或其組合)的陰極電解質(zhì)。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施例中,該系統(tǒng)包括被配置成將該分離腔室的一端與該發(fā)射器偶聯(lián)的接 口偶聯(lián)裝置。在一個(gè)實(shí)施例中,將該鞘流溶液引入到該陽(yáng)極電解質(zhì)和/或陰極電解質(zhì)儲(chǔ)槽 中以動(dòng)員這些聚焦的樣品組分。在一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室包括具有陽(yáng)極端的毛細(xì)管,其 中在將該樣品中的一種或多種組分聚焦之后將該毛細(xì)管的該陽(yáng)極端插入到該發(fā)射器的輸 入端中并且將該鞘流溶液引入到該陰極電解質(zhì)儲(chǔ)槽中以動(dòng)員這些聚焦的組分。在另一個(gè)實(shí) 施例中,該分離腔室包括具有陰極端的毛細(xì)管,其中在將該樣品中的一種或多種組分聚焦 之后將該毛細(xì)管的該陰極端插入到該發(fā)射器的輸入端中并且將該鞘流溶液引入到該陽(yáng)極 電解質(zhì)儲(chǔ)槽中以動(dòng)員這些聚焦的組分。
[0026] 這個(gè)概述是對(duì)本申請(qǐng)的一些傳授內(nèi)容的綜述并且并不打算作為對(duì)本發(fā)明主題的 排他性或窮盡性處理。另外的詳情見(jiàn)于詳細(xì)說(shuō)明和所附權(quán)利要求書。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員在閱讀并理解以下詳細(xì)描述并且查看形成該詳細(xì)描述的一部分的圖式(其中的每一者 均不以限制性意義采用)后將清楚其他方面。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書和其法律等 效物界定。
[0027] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0028] 圖1是組合的cIEF-ESI-MS系統(tǒng)的流程圖。
[0029] 圖2是cIEF的示意性圖示。
[0030] 圖3是ESI的示意性圖示。
[0031] 圖4是MS的示意性圖示。
[0032] 圖5是展示使用以下不同鞘流緩沖液在cIEF期間針對(duì)動(dòng)員的電流特征曲線的圖 式:(a) 50%甲醇和0.05%乙酸;(b) 50%甲醇和0.05%甲酸;以及(c) 50%甲醇和0. 1%甲 酸。
[0033] 圖6是展示計(jì)算的pi值對(duì)觀察到的鑒別的肽從HCP樣品的遷移時(shí)間的曲線。肽 的pi值用TPP計(jì)算并且遷移時(shí)間從所提取的肽譜獲得。
[0034]雖然本發(fā)明易有不同修改和替代形式,但它的特性已借助于實(shí)例和圖式示出并且 將加以詳細(xì)描述。然而,應(yīng)理解,本發(fā)明不限于所描述的具體實(shí)施例。相反,目的是支持屬 于本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的修改、等效物以及替代物。
[0035]詳細(xì)說(shuō)明
[0036]在此描述了用于鑒別并分析樣品中的一種或多種組分的新穎系統(tǒng)。在一個(gè)實(shí)施 例中,該系統(tǒng)被配置成檢測(cè)樣品中的蛋白質(zhì),例如殘留在耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中的殘余 宿主細(xì)胞蛋白。具體來(lái)說(shuō),該系統(tǒng)使用在線分析和鑒別方法鑒別并分析樣品中的組分,該 方法組合有毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)、電噴霧電離(ESI)以及質(zhì)譜(MS)。提供對(duì)該組合的 cIEF-ESI-MS系統(tǒng)的綜述的流程圖展示在圖1中。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),制備出包括樣品溶液15的混 合物的"聚焦溶液" 10,該樣品溶液可能包含所關(guān)注的一種或多種分析物(在此也稱為樣品 組分,例如HCP)和一種或多種其他組分。將聚焦溶液10引入到cIEF儀器100中以便分離。 在利用cIEF100分離了樣品組分之后,將包含分離的組分的電離溶液20引入到ESI儀器 200中以便電離。電離的組分30可以接著利用MS300分析。
[0037] 在此所描述的在線方法能夠?qū)嵸|(zhì)上縮短用于組合的cIEF-ESI-MS方法的總分析 時(shí)間;而典型的方法可以耗費(fèi)10小時(shí)以上(包括樣品制備、降解、分離以及檢測(cè)),在此所 描述的組合的方法能夠?qū)⑼瓿扇糠椒ǖ臅r(shí)間縮短到少于約5小時(shí)、少于約4小時(shí)、少于約 3小時(shí)或少于約2小時(shí)。另外的優(yōu)點(diǎn)是cIEF可以將樣品富集超過(guò)10倍。根據(jù)在此所描述 的本發(fā)明,鞘流液體既充當(dāng)用于cIEF的化學(xué)動(dòng)員溶液又充當(dāng)用于ESI的電離溶液。
[0038]毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)的綜沭
[0039] 如在此所用,術(shù)語(yǔ)"電泳"是指離子在電場(chǎng)的影響(吸引或排斥)下的遷移。最簡(jiǎn) 單的電泳分離是基于離子電荷/大小。
[0040] 毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)是電泳技術(shù),在該技術(shù)中,樣品中的兩性組分基于等電點(diǎn) (pi)的差異進(jìn)行分離。在電場(chǎng)的影響下,pH梯度在分離腔室(例如毛細(xì)管)內(nèi)由一系列 兩性離子(也稱為兩性電解質(zhì))形成。樣品中的兩性樣品組分(它們也可以稱為分析物) 在電場(chǎng)中遷移直到它們到達(dá)pH梯度中它們的pH等于它們的pi(即,其中分子由于正和負(fù) 電荷抵消成零而不具有凈電荷)的部位為止。在這個(gè)部位處,兩性組分停止移動(dòng)并且聚焦。 在聚焦之后,動(dòng)員步驟將聚焦的分析物傳遞出分離腔室以便分析??偟膩?lái)說(shuō),pi相差小于 0. 05pH單位的分析物可以利用cIEF拆分。
[0041] 許多類型的化合物可以利用cIEF分離,包括(但不限于)肽、氨基酸、核酸(DNA和 RNA)、無(wú)機(jī)離子、有機(jī)堿、有機(jī)酸以及完整細(xì)胞。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"肽"是指包含兩個(gè)或更 多個(gè)連接在鏈中的氨基酸的化合物,其中每一氨基酸的羧基連接于鄰近氨基酸的氨基。肽 的實(shí)例包括(但不限于)寡肽(即,連續(xù)非分支肽,通常包含在2與10個(gè)之間的氨基酸殘 基)、多肽(即,連續(xù)非分支肽,通常包含超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基)以及大分子蛋白質(zhì)(它們 可以包括一條或多條折疊成特定空間構(gòu)象的多肽鏈)。術(shù)語(yǔ)"一級(jí)結(jié)構(gòu)"是指蛋白質(zhì)中多肽 鏈的氨基酸序列。術(shù)語(yǔ)"二級(jí)結(jié)構(gòu)"是指高度常規(guī)亞結(jié)構(gòu),包括例如a螺旋和0折疊。"三 級(jí)結(jié)構(gòu)"是指單一蛋白質(zhì)分子的三維結(jié)構(gòu),而"四級(jí)結(jié)構(gòu)"是指數(shù)個(gè)蛋白亞基的裝配物。 [0042]存在于肽上的氨基酸殘基可以賦予分子兩性特性,使得這些分子包含正和負(fù)兩種 電荷。肽的凈電荷取決于側(cè)接官能基和周圍環(huán)境的pH。總的來(lái)說(shuō),肽在低于其pi的pH值 下帶正電荷而在高于其pi的pH值下帶負(fù)電荷。因此,在電泳期間,單獨(dú)的肽將朝著pH等 于其pi的區(qū)域遷移。cIEF因此適用于復(fù)雜蛋白混合物(例如耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)基中的HCP) 的分析和/或表征。cIEF也可以用于針對(duì)重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物加工、研究配制品以 及進(jìn)行質(zhì)量控制。cIEF也可以用于復(fù)雜蛋白混合物的預(yù)分級(jí)分離。
[0043]cIEF儀器
[0044]cIEF的基本儀器設(shè)置示意性地展示在圖2中并且包括分離腔室120、兩個(gè)緩沖液 儲(chǔ)槽131U32以及兩個(gè)電極141U42以及電源150。分離腔室120典型地是具有內(nèi)壁125 的細(xì)長(zhǎng)毛細(xì)管,該內(nèi)壁界定具有直徑0>)的管腔,該管腔在入口 121與出口 122之間延伸。 在一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室120的該入口 121與第一緩沖液儲(chǔ)槽131處于流體連通,并且 該分離腔室的該出口 122與第二緩沖液儲(chǔ)槽132處于流體連通。
[0045] 在一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120是玻璃毛細(xì)管,該玻璃毛細(xì)管的長(zhǎng)度為至少約 5cm、至少約10cm、至少約15cm、至少約20cm、至少約25cm、至少約30cm、至少約35cm、至 少約40cm、至少約45cm、至少約50cm以及高達(dá)約55cm、高達(dá)約60cm、高達(dá)約65cm、高達(dá)約 70cm、高達(dá)約75cm、高達(dá)約80cm、高達(dá)約85cm、高達(dá)約90cm、高達(dá)約95cm或高達(dá)約100cm并 且內(nèi)部直徑為至少約10Um、至少約15ym、至少約20ym、至少約25ym、至少約30ym、至少 約35iim、至少約40iim、至少約45iim或至少約50iim以及高達(dá)約50iim、高達(dá)約75iim、高 達(dá)約100iim、高達(dá)約125ym以及高達(dá)約150ym。在一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室120是熔融 硅石毛細(xì)管。在另一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室120是由TeflonTM或硼硅酸鹽玻璃構(gòu)建的。 在另一個(gè)實(shí)施例中,該分離腔室可能是使用熟知微型制造技術(shù)形成的平面結(jié)構(gòu)中的通道。 在這種情況下,該裝置可能由玻璃、熔融硅石或如聚二甲基硅烷(PDMS)的聚合物制成。在 一些情況下,熔融硅石可能是優(yōu)選的,因?yàn)樗趶V泛范圍的電磁波譜內(nèi)是透明的并且具有 高熱傳導(dǎo)率。熔融硅石還易于制造成直徑幾微米的毛細(xì)管。
[0046] 在一些實(shí)施例中,裸二氧化硅材料用于分離腔室120的內(nèi)壁125。在其他實(shí)施例 中,該分離腔室120的該內(nèi)壁125上的硅烷基團(tuán)可以與中性或親水性取代基共價(jià)連接以減 少電滲流(EOF)和/或防止分析物吸附到內(nèi)壁125上。中性涂層的實(shí)例包括(但不限于) 線性聚丙烯酰胺(LPA)、聚乙烯醇(PVA)、三甲基氯硅烷以及二乙烯基苯涂層。親水性涂層 的實(shí)例包括丙烯酰胺(AA)、二甲基丙烯酰胺(DMA)、N-丙烯酰基氨基乙氧基乙醇(AAEE)或 N-丙烯?;被迹ˋAP)。在另一個(gè)實(shí)施例中,動(dòng)態(tài)涂層可以用于減少電滲流。術(shù)語(yǔ)"動(dòng) 態(tài)涂層"是指將添加劑包括在分離溶液中,該添加劑緊緊地粘附于該分離腔室的內(nèi)壁并且 有效地逆轉(zhuǎn)電滲流(EOF)的方向。動(dòng)態(tài)涂層添加劑的實(shí)例包括表面活性劑和聚合物。表面 活性劑可以包括陽(yáng)離子表面活性劑,如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB);兩性離子表面活性 齊IJ,如CHAPS、辛?;腔鸩藟A、月桂基磺基甜菜堿或棕櫚?;腔鸩藟A;以及非離子 表面活性劑,如tween20、NP40或TritonX。其他動(dòng)態(tài)涂層添加劑包括聚合添加劑,如親 水性聚合物,例如甲基纖維素(MC)、(羥丙基)甲基纖維素(HPMC)、聚氧化乙烯(PE0)、聚乙 二醇(PEG)、葡聚糖、聚(乙烯醇)或聚(二甲基丙烯酰胺)。動(dòng)態(tài)涂層添加劑可能以一定 濃度包括在聚焦溶液中,該濃度在約〇. 1%w/v與約1. 0%w/v之間,或?yàn)橹辽偌s0. 1%w/ v、至少約0. 2%w/v、至少約0. 3%w/v、至少約0. 4%w/v以及至少約0. 5%w/v以及高達(dá) 約0? 6%w/v、高達(dá)約0? 7%w/v、高達(dá)約0? 8%w/v、高達(dá)約0? 9%w/v或高達(dá)約1. 0%w/v。
[0047] 在cIEF期間,pH梯度由于分離溶液存在于分離腔室120內(nèi)部而形成,其中該分離 溶液包括載體兩性電解質(zhì)(CA)。術(shù)語(yǔ)"載體兩性電解質(zhì)"(CA)是指包含多種兩性組分的溶 液。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"兩性組分"是指可以既充當(dāng)酸又充當(dāng)堿的物質(zhì)。兩性電解質(zhì)pH梯 度的拆分能力受溶液中兩性電解質(zhì)物質(zhì)數(shù)目的影響??偟膩?lái)說(shuō),兩性電解質(zhì)數(shù)目越多,該分 離腔室120內(nèi)鄰近位點(diǎn)之間的pH差異越小,使得pH梯度在使用大量?jī)尚噪娊赓|(zhì)時(shí)更平穩(wěn)。 一些可商購(gòu)的CA可以包含超過(guò)900種兩性組分。
[0048]CA可以是寬的(SM函蓋多個(gè)pH單位)或窄的(SM又涵蓋幾個(gè)pH單位)。如在 此所用,術(shù)語(yǔ)"寬"是指CA包含至少約4個(gè)pH單位、至少約5個(gè)pH單位、至少約6個(gè)pH單 位以及高達(dá)約7個(gè)pH單位或高達(dá)約8個(gè)pH單位。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"窄"是指CA包含少 于約4個(gè)pH單位、少于約3個(gè)pH單位、少于約2個(gè)pH單位、少于約1個(gè)pH單位或少于約 0. 5個(gè)pH單位??偟膩?lái)說(shuō),兩性電解質(zhì)組合物基于所希望的pi分離范圍加以選擇。典型 地,選擇寬CA以用于未知pi值的樣品。然而,在所希望的是具有類似pi值的蛋白質(zhì)的增 強(qiáng)的拆分的情形中,使用窄范圍CA混合物可能是所希望的。
[0049] 總的來(lái)說(shuō),有四種可商購(gòu)的CA:Pharmalyte?(賓夕法尼亞州匹茲堡的通用電氣醫(yī) 療集團(tuán)(GEHealthcare,Pittsburgh,PA))、Bio_lyte?(加利福尼亞州埃庫(kù)萊斯的伯樂(lè)公司 (BioRad,Hercules,CA))、Servalyt?(內(nèi)華達(dá)州里諾的百弗瑞公司(Biophoretics,Inc., Reno,NV))以及Amph〇lineTM(賓夕法尼亞州匹茲堡的通用電氣醫(yī)療集團(tuán))。
[0050]Pharmalyte?是用于cIEF的在寬pH范圍(在約3與約10之間)和不同窄pH范 圍(在約2. 5與約5之間;在約4與約6. 5之間;在約5與約8之間;在約8與約10. 5之 間;在約4. 2與約4. 9之間;在約4. 5與約5. 4之間;在約5與約6之間;以及在約6. 7與 約7. 7之間)中可供使用的兩性電解質(zhì)緩沖液。在一些情況下,尤其在使用cIEF時(shí),可能 所希望的是使用具有低背景UV吸收的CA。Pharmalyte?可能因此是所希望的,歸因于它沿 著它整個(gè)pH梯度的低背景UV吸收。
[0051]Bio-Lyte?是用于cIEF的在寬pH范圍(在約3. 5與約9. 5之間)和不同窄范圍 (在約3與約5之間;在約4與約6之間;在約5與約7之間;在約5與約8之間;在約6與 約8之間;在約7與約9之間;以及在約8與約10之間)中可供使用的兩性電解質(zhì)緩沖液。
[0052] Servalyt?載體兩性電解質(zhì)是兩性離子特征的低分子量分子。這些Servalyt?載 體兩性電解質(zhì)是合成衍生的物質(zhì)的混合物,這些合成衍生的物質(zhì)的平均分子量分布為400 到1000道爾頓并且出現(xiàn)多種pH范圍,包括窄pH范圍(在約2與約4之間;在約3與約4 之間;在約3與約5之間;在約3與約6之間;在約4與約5之間;在約4與約6之間;在約 4與約7之間;在約5與約6之間;在約5與約7之間;在約5與約8之間;在約6與約7之 間;在約6與約8之間;在約6與約9之間;在約7與約9之間;以及在約9與約11之間) 和寬pH范圍(在約2與約9之間;在約2與約11之間;在約3與約7之間;在約3與約10 之間;在約4與約9之間;在約5與約9之間)。
[0053]Ampholine?是包括不同的低分子量聚氨基-聚羧酸并且覆蓋在3. 5到10范圍內(nèi) pH的兩性電解質(zhì)緩沖液。然而,Ampholine?生產(chǎn)在2007年停止。
[0054] 在一個(gè)實(shí)施例中,分離溶液包括在約0. 1 %與約10%之間的CA、在約0. 1 %與 1. 0 %之間的CA或在約0. 2 %與0. 8 %之間的CA。在其他實(shí)施例中,分離溶液包括在約1 % 與10%之間的CA或在約2%與約8%之間的CA。如在此所用,100%是指CA的儲(chǔ)備溶液。 在更特定實(shí)施例中,分離溶液包括至少約〇. 1 %、至少約〇. 2%、至少約0. 3%、至少約0. 4% 以及高達(dá)約0. 5%、高達(dá)約0. 6%、高達(dá)約0. 7%以及高達(dá)約0. 8%、高達(dá)約0. 9%或高達(dá)約 1%CA。在另一個(gè)實(shí)施例中,分離溶液包括至少約1%、至少約2%、至少約3%、至少約4% 以及高達(dá)約5%、高達(dá)約6%、高達(dá)約7%、高達(dá)約8%、高達(dá)約9%以及高達(dá)約10%CA。在一 個(gè)實(shí)施例中,CA用惰性稀釋劑(如去離子水、碳酸氫銨、乙酸銨或其他緩沖液)稀釋。
[0055] 接近陽(yáng)極141的儲(chǔ)槽131中的緩沖液具有低pH(即,是一種酸)并且在此被稱為 "陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液"??傮w上,陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液的pH小于約7、小于約6. 5、小于約6、小 于約5. 5、小于約5、小于約4. 5、小于約4、小于約3. 5、小于約3、小于約2. 5或小于約2。接 近陰極142的儲(chǔ)槽132中的緩沖液具有高pH(S卩,是一種堿)并且在此被稱為"陰極電解質(zhì) 緩沖液"。總體上,陰極電解質(zhì)緩沖液的pH大于約7、大于約7. 5、大于約8、大于約8. 5、大 于約9、大于約9. 5、大于約10、大于約10. 5、大于約11、大于約11. 5或大于約12。
[0056] 適合的陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液的實(shí)例包括甲酸、磷酸、天冬氨酸或其組合。在一個(gè)實(shí) 施例中,陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液包括在約50mM與500mM之間的酸,總體上至少約50mM、至少約 100mM、至少約150mM、至少約200mM、或至少約250mM、以及高達(dá)約250mM、高達(dá)約300mM、高 達(dá)約350mM、高達(dá)約400mM、高達(dá)約450mM或高達(dá)約500mM的酸。在更具體實(shí)施例中,陽(yáng)極電 解質(zhì)緩沖液包括在約50mM與500mM之間的磷酸,總體上至少約50mM、至少約100mM、至少 約150mM、至少約200mM、或至少約250mM、以及高達(dá)約250mM、高達(dá)約300mM、高達(dá)約350mM、 高達(dá)約400mM、高達(dá)約450mM或高達(dá)約500mM的磷酸。在一個(gè)實(shí)施例中,陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖 液可以包括陽(yáng)極穩(wěn)定劑,如亞氨基二乙酸。在一個(gè)實(shí)施例中,陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液包括在約 50mM與500mM之間的穩(wěn)定劑(如亞氨基二乙酸),總體上至少約50mM、至少約100mM、至少 約150mM、至少約200mM、或至少約250mM、以及高達(dá)約250mM、高達(dá)約300mM、高達(dá)約350mM、 高達(dá)約400mM、高達(dá)約450mM、或高達(dá)約500mM穩(wěn)定劑(如亞氨基二乙酸)。
[0057] 適合的陰極電解質(zhì)緩沖液的實(shí)例包括(但不限于)氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化 銨、碳酸鈉、賴氨酸、碳酸鉀以及其組合。在一個(gè)實(shí)施例中,陰極電解質(zhì)緩沖液包括在約50mM與500mM之間的堿,總體上至少約50mM、至少約100mM、至少約150mM、至少約200mM、或至少 約250mM、以及高達(dá)約250mM、高達(dá)約300mM、高達(dá)約350mM、高達(dá)約400mM、高達(dá)約450mM、或 高達(dá)約500mM的堿。在一個(gè)實(shí)施例中,陰極電解質(zhì)緩沖液包括在約50mM與500mM之間的氫 氧化鈉,總體上至少約50mM、至少約100mM、至少約150mM、至少約200mM、或至少約250mM、以 及高達(dá)約250mM、高達(dá)約300mM、高達(dá)約350mM、高達(dá)約400mM、高達(dá)約450mM或高達(dá)約500mM 的氫氧化鈉。在更特定實(shí)施例中,陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液包括在約〇. 01%v/v與約5%v/v之間 的酸,或至少約〇. 01 %v/v、至少約0. 05%v/v、至少約0. 1 %v/v、至少約0. 5%v/v、以及 高達(dá)約〇. 5%v/v、高達(dá)約1%v/v、高達(dá)約5%v/v的酸。在一個(gè)實(shí)施例中,陰極電解質(zhì)緩沖 液包括在約〇. 01%v/v與約5%v/v之間的堿,或至少約0. 01%v/v、至少約0. 05%v/v、 至少約0. 1 %v/v、至少約0. 5%v/v、以及高達(dá)約0. 5%v/v、高達(dá)約1 %v/v、高達(dá)約5%v/ v的堿。在一些實(shí)施例中,陰極電解質(zhì)緩沖液包括陰極穩(wěn)定劑,例如精氨酸。在一個(gè)實(shí)施例 中,陰極電解質(zhì)緩沖液包括在約lOOmM與500mM之間的穩(wěn)定劑(如精氨酸),總體上至少約 50mM、至少約100mM、至少約150mM、至少約200mM、或至少約250mM、以及高達(dá)約250mM、高達(dá) 約300mM、高達(dá)約350mM、高達(dá)約400mM、高達(dá)約450mM、或高達(dá)約500mM穩(wěn)定劑(如精氨酸)。 在cIEF的操作期間,pH梯度在分離腔室內(nèi)在陽(yáng)極141與陰極142之間形成。
[0058]任何適合的電源均可以用于cIEF。總體上,使用電壓在約lkV到約50kV之間的高 電壓直流電源,例如電壓為至少約lkV、至少約5kV、至少約10kV、至少約15kV、至少約20kV、 以及至少約25kV和/或高達(dá)約20kV、高達(dá)約25kV、高達(dá)約30kV、高達(dá)約35kV、高達(dá)約40kV、 高達(dá)約45kV或高達(dá)約50kV的電源。所產(chǎn)生的電場(chǎng)總體上為至少約300V/cm、至少約325V/ cm、至少約350V/cm、至少約375V/cm以及高達(dá)約400V/cm、高達(dá)約425V/cm、高達(dá)約450V/ cm、高達(dá)約475V/cm、高達(dá)約500V/cm、高達(dá)約525V/cm、高達(dá)約550V/cm、高達(dá)約575V/cm、或 高達(dá)約600V/cm。
[0059] 在一個(gè)實(shí)施例中,cIEF儀器是Beckman-CoulterP/ACEMDQ毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(加 利福尼亞州富勒頓的貝克曼-庫(kù)爾特儀器公司(Beckman-CoulterInstruments,Inc., Fullterton,CA))〇
[0060] 總的來(lái)說(shuō),cIEF可以是分解成五個(gè)階段:
[0061] 1?樣品制備;
[0062] 2.將樣品引入到分離腔室中;
[0063] 3.在外加電壓下將分離腔室中的樣品聚焦;
[0064] 4.將聚焦的樣品動(dòng)員出分離腔室;并且
[0065] 5.檢測(cè)并分析已聚焦并動(dòng)員的樣品。
[0066] 當(dāng)發(fā)展cIEF方法時(shí),可以改變數(shù)個(gè)參數(shù)來(lái)改進(jìn)方法性能,包括例如陽(yáng)極電解質(zhì)和 陰極電解質(zhì)緩沖液的組成、分離腔室尺寸和材料、載體兩性電解質(zhì)、聚焦時(shí)間和電壓、動(dòng)員 方法、樣品濃度以及其他添加劑的包括或除去。
[0067] 樣品制各
[0068] 在此所描述的系統(tǒng)和方法可以用于檢測(cè)樣品中的組分,例如樣品中的蛋白質(zhì),如 耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物中的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"耗乏的"細(xì)胞培養(yǎng)基是指 在已移出所關(guān)注的的重組蛋白之后來(lái)自純化過(guò)程的細(xì)胞培養(yǎng)基的流過(guò)部分。在一個(gè)實(shí)施例 中,樣品是來(lái)自重組單克隆抗體細(xì)胞培養(yǎng)物的耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0069] 蛋白質(zhì)純化在從簡(jiǎn)單的一步沉淀程序到大規(guī)模生產(chǎn)工藝之間變化。通常,使用一 個(gè)以上純化步驟來(lái)獲得具有所希望的純度水平的產(chǎn)品。許多純化流程涉及一些形式的色 譜。具有不同選擇性的不同色譜技術(shù)可以形成強(qiáng)大的組合以用于純化生物分子。許多純化 方案需要一個(gè)以上步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)所希望的產(chǎn)品純度水平??傮w上,純化方案具有三個(gè)階段: (1)捕獲階段,在捕獲階段中目標(biāo)產(chǎn)品被分離并濃縮;(2)中間純化,在中間純化中大部分 塊狀雜質(zhì)被移出;以及(3)精制,在精制中痕量雜質(zhì)被移出。一旦從細(xì)胞培養(yǎng)物純化出重組 蛋白,耗乏的(流過(guò))部分就可以接著針對(duì)HCP進(jìn)行分析。
[0070] 蛋白質(zhì)變性
[0071] 在蛋白質(zhì)的天然形式中,蛋白質(zhì)折疊成多種形狀,一些壓實(shí),一些伸長(zhǎng)。天然蛋白 質(zhì)通過(guò)篩分介質(zhì)的遷移速率因此更多是它們相對(duì)緊密性的反映,而不太是分子量的準(zhǔn)確測(cè) 量。如在此所用,"蛋白質(zhì)變性"是指改變蛋白質(zhì)分子的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 的任何非共價(jià)變化。使蛋白質(zhì)變性會(huì)使對(duì)移動(dòng)性的結(jié)構(gòu)影響無(wú)效,允許以真實(shí)電荷/質(zhì)量 比為基礎(chǔ)進(jìn)行分離。變性還會(huì)分離多聚蛋白質(zhì)中的亞基,允許分析較大的復(fù)雜聚集體。另 夕卜,大部分天然蛋白質(zhì)對(duì)蛋白水解酶的作用具有抗性。蛋白質(zhì)變性會(huì)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并 且可以將適當(dāng)基團(tuán)暴露于蛋白水解酶,并且因此增加蛋白分解。因此,通常在電泳之前使蛋 白質(zhì)分子變性。
[0072] 許多使蛋白質(zhì)變性的方法是已知的并且可以結(jié)合本發(fā)明的系統(tǒng)和方法使用。常 見(jiàn)變性劑的一個(gè)實(shí)例是清潔劑,如陰離子表面活性劑,例如十二烷基硫酸鈉(SDS)或脫氧 膽酸鈉(SDC),或非離子表面活性劑,如NP40、TWEEN20、或TritonX??傮w上,蛋白質(zhì)可以 通過(guò)將蛋白質(zhì)溶液與在一定表面活性劑濃度下的表面活性劑一起孵育來(lái)變性,該濃度在約 0.ImM與約50mM之間,總體上為至少約0.ImM、至少約0. 2mM、至少約0. 3mM、至少約0. 4mM、 至少約0. 5mM、至少約0. 6mM、至少約0. 7mM、至少約0. 8mM、至少約0. 9mM、或至少約1.OmM、 以及高達(dá)約ImM、高達(dá)約5mM、高達(dá)約10mM、高達(dá)約15mM、高達(dá)約20mM、高達(dá)約25mM、或高達(dá) 約50mM。熱變性是另一種已知的用于使蛋白質(zhì)變性的方法??傮w上,蛋白質(zhì)可以通過(guò)將它 們?cè)谥辽偌s50°C、至少約55°C、至少約60°C、至少約65°C、至少約70°C、以及高達(dá)約75°C、 高達(dá)約80°C、高達(dá)約85°C、以及高達(dá)約90°C的溫度下孵育至少約1分鐘、至少約5分鐘、至 少約10分鐘、至少約15分鐘、以及高達(dá)約30分鐘、高達(dá)約45分鐘、或高達(dá)約60分鐘來(lái)變 性。取決于所研究的蛋白質(zhì)和加熱的強(qiáng)度,熱變性可能是或可能不是可逆的。樣品中的蛋 白質(zhì)還可以通過(guò)將樣品溶液與酸組合以形成pH在約2與約3之間的酸溶液來(lái)變性。適合 的酸的實(shí)例包括(但不限于)鹽酸胍。在另一個(gè)實(shí)施例中,樣品中的蛋白質(zhì)可以通過(guò)將樣 品溶液與堿組合以形成pH在約8與約10之間的堿溶液來(lái)變性。適合的堿的實(shí)例包括(但 不限于)尿素。在再另一個(gè)實(shí)施例中,樣品溶液中的蛋白質(zhì)可以通過(guò)將樣品溶液與具有高 鹽濃度(如濃度為從2M到5M的NaCl或LiCl)的溶液組合來(lái)變性。在一個(gè)實(shí)施例中,在等 電聚焦之前從蛋白質(zhì)中移出該鹽(例如通過(guò)尺寸排阻色譜進(jìn)行)。
[0073] 由于二硫鍵還可以阻礙蛋白分解,故已知的還原和烷基化方法還可以用于輔助完 成樣品中的蛋白質(zhì)變性。術(shù)語(yǔ)"還原"是指二硫鍵的還原,并且可以通過(guò)將變性的蛋白質(zhì)與 還原劑一起孵育來(lái)實(shí)現(xiàn),該還原劑如二硫蘇糖醇OTT)、2_巰基乙醇(BME)、氯化三(2-羧乙 基)膦(TCEP)或三丁基膦(TBP)[其他?]。總體上,蛋白質(zhì)通過(guò)將蛋白質(zhì)樣品孵育在溶 液中來(lái)還原,該溶液包含介于約〇.ImM與10mM之間的還原劑,總體上至少約0.ImM、至少約 0. 2mM、至少約0. 3mM、至少約0. 4mM、或至少約0. 5mM還原劑、以及高達(dá)約ImM、高達(dá)約5mM或 高達(dá)約10mM還原劑。烷基化是指硫醇的烷基化并且可以通過(guò)將變性的蛋白質(zhì)與烷化劑一 起孵育來(lái)實(shí)現(xiàn),該烷化劑如乙基順丁烯二酰亞胺(NEM)、碘乙酰胺(IAM)、4-乙烯基吡啶、或 鵬乙酸(IAA)、甲燒硫代橫酸甲醋(MMTS)??傮w上,將蛋白質(zhì)樣品鮮育在溶液中,該溶液包 含介于約10mM與500mM之間的烷化劑,總體上至少約10mM、至少約20mM、至少約30mM、至 少約40mM、或至少約50mM燒化劑、以及高達(dá)約100mM、高達(dá)約200mM、高達(dá)約300mM、高達(dá)約 400、或高達(dá)約500mM烷化劑。
[0074] 降解
[0075] 在一些情況下,可能所希望的是在電泳之前降解該樣品中的蛋白質(zhì)。許多蛋白質(zhì) 降解的方法是已知的并且包括例如蛋白分解。術(shù)語(yǔ)"蛋白分解"是指利用稱為蛋白酶(或蛋 白水解酶)的酶降解蛋白質(zhì),這些酶包括例如絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白 酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、谷氨酸蛋白酶以及其組合。絲氨酸蛋白酶的實(shí)例包括胰 蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的實(shí)例包括木瓜蛋白酶。其他蛋白酶包括Lys-C、 Glu-C以及Asp-N。在更特定實(shí)施例中,樣品中的蛋白質(zhì)是利用胰蛋白酶降解的。在一個(gè)實(shí) 施例中,該蛋白水解酶被固定在固體支撐物上。在另一個(gè)實(shí)施例中,胰蛋白酶被固定在固體 支撐物上。有利的是,固定的胰蛋白酶可以用于痕量(低nM或ng)蛋白質(zhì)降解。固體支 撐物的實(shí)例包括(但不限于)聚合物粒子、玻璃、膜、凝膠珠粒、溶膠-凝膠支撐物、多孔硅 基體、多孔整體材料以及磁性材料??傮w上,蛋白質(zhì)是通過(guò)以一定的蛋白酶與蛋白質(zhì)比率將 包含蛋白質(zhì)的樣品溶液與蛋白酶一起孵育來(lái)降解的,該蛋白酶與蛋白質(zhì)比率為至少約1:5、 至少約1:10、至少約1:15、至少約1:20、至少約1:25、至少約1:30、以及高達(dá)約1:40、高達(dá) 約1:50、高達(dá)約1:75、或高達(dá)約1:100。對(duì)于固定的胰蛋白酶來(lái)說(shuō)比率可能更高,例如大于 1:100。在一個(gè)實(shí)施例中,將樣品溶液與蛋白水解酶一起孵育持續(xù)介于約5小時(shí)與20小時(shí) 之間,或至少約5小時(shí)、至少約10小時(shí)、至少約11小時(shí)、至少約12小時(shí)、至少約13小時(shí)、至 少約14小時(shí)、至少約15小時(shí)、以及高達(dá)約15小時(shí)或高達(dá)約20小時(shí)??傮w上,降解是在至 少約25°C、至少約30°C、至少約35°C、以及高達(dá)約40°C、高達(dá)約45°C或高達(dá)約50°C的溫度 下執(zhí)行的。
[0076] 聚焦溶液的制備
[0077] 如在此所用的術(shù)語(yǔ)"聚焦溶液"是指被引入到cIEF分離腔室中的包含樣品的溶 液。聚焦溶液可以包括樣品溶液和一種或多種其他組分(包括例如載體兩性電解質(zhì)(CA)、 惰性稀釋劑如蒸餾或去離子水、或其他添加劑)的混合物。在一個(gè)實(shí)施例中,樣品溶液包括 耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0078] 載體兩性電解質(zhì)(CA)
[0079] 在一個(gè)實(shí)施例中,聚焦溶液包括載體兩性電解質(zhì)(CA)。如上文所論述,有四種可商 購(gòu)的CA:PharmalyteTM(賓夕法尼亞州匹茲堡的通用電氣醫(yī)療集團(tuán))、Bi〇-lyteTM(加利福尼 亞州埃庫(kù)萊斯的伯樂(lè)公司)、Servalyt?(內(nèi)華達(dá)州里諾的百弗瑞公司以及Ampholine?(賓 夕法尼亞州匹茲堡的通用電氣醫(yī)療集團(tuán))??偟膩?lái)說(shuō),聚焦溶液包括介于約0. 1%與約10% 之間的CA。在一個(gè)實(shí)施例中,聚焦溶液包括至少約0. 1%、至少約0. 2%、至少約0. 3%、至 少約0. 4%、至少約0. 5 %、以及高達(dá)約0. 6 %、高達(dá)約0. 7 %、高達(dá)約0. 8 %、高達(dá)約0. 9 %或 高達(dá)約1. 0%CA。在其他實(shí)施例中,聚焦溶液包括至少約1 %、至少約2%、至少約3%、至少 約4%、至少約5 %、以及高達(dá)約6 %、高達(dá)約7 %、高達(dá)約8 %、高達(dá)約9 %或高達(dá)約10 %CA。 在其他實(shí)施例中,聚焦溶液并不包括載體兩性電解質(zhì)。
[0080] 鹽濃度
[0081] 在將聚焦溶液引入到分離腔室中之前可能調(diào)整的另一個(gè)參數(shù)是離子強(qiáng)度。術(shù)語(yǔ) "離子強(qiáng)度"是指溶液中離子的濃度。對(duì)于CIEF來(lái)說(shuō),可能所希望的是具有低離子強(qiáng)度,例 如小于約100mM、小于約75mM、小于約50mM、小于約40mM、小于約30mM、小于約20mM??偟?來(lái)說(shuō),隨著鹽濃度增大,在聚焦期間出現(xiàn)蛋白質(zhì)沉淀的風(fēng)險(xiǎn)增大。樣品溶液的離子強(qiáng)度可 以例如通過(guò)已知脫鹽方法(包括例如稀釋、透析、凝膠過(guò)濾、超濾以及固相萃取(SPE)(例如 Ziptip?))改變。
[0082] 樣品的稀釋
[0083] 總的來(lái)說(shuō),至少約0. 1 Ug/mL/蛋白質(zhì)、至少約0. 5 iig/mL/蛋白質(zhì)、至少約1 iig/ mL/蛋白質(zhì)、至少約5iig/mL/蛋白質(zhì)、至少約10iig/mL/蛋白質(zhì)、至少約50iig/mL/蛋白質(zhì)、 至少約0.lmg/mL/蛋白質(zhì)、至少約0. 5mg/mL/蛋白質(zhì)、至少約lmg/ml/蛋白質(zhì)、至少約5mg/ ml/蛋白質(zhì)、以及高達(dá)約10mg/ml/蛋白質(zhì)的最終濃度是所希望的,以達(dá)到使用cIEF足夠的 靈敏性、聚焦以及動(dòng)員。
[0084] 為了獲得所希望的蛋白質(zhì)濃度,樣品溶液15可能與稀釋劑組合以形成聚焦溶液 10,該聚焦溶液接著被引入到分離腔室120中。在一個(gè)實(shí)施例中,稀釋劑是載體兩性電解質(zhì) 溶液,并且聚焦溶液是通過(guò)將包含一種或多種樣品組分的樣品溶液與載體兩性電解質(zhì)溶液 例如以一定的樣品溶液與載體兩性電解質(zhì)溶液比率混合來(lái)制備的,該樣品溶液與載體兩性 電解質(zhì)溶液比率在約5:1與約1:5之間、在約2:1與約1:2之間;或在約1. 5:1與約1:1. 5 之間,或在約1:1下。在另一個(gè)實(shí)施例中,樣品溶液與載體兩性電解質(zhì)的比率可以是在約 100:1與約1:1之間、或在約60:1與約1:1之間、或在約100:1與約10:1之間。在另一個(gè) 實(shí)施例中,聚焦溶液是通過(guò)將包含一種或多種分析物組分的樣品溶液與惰性稀釋劑(如去 離子水)以一定的樣品溶液與稀釋劑比率組合來(lái)制備的,該樣品溶液與稀釋劑比率為從約 5:1到約1:5、從約2:1到約1:2 ;從約1. 5:15到約1:1. 5、或約1:1。
[0085] 在一個(gè)實(shí)施例中,蛋白質(zhì)溶液在cIEF之前例如通過(guò)凍干程序進(jìn)行濃縮。
[0086] 其他添加劑
[0087] 在cIEF完成時(shí),將樣品的組分聚焦到分離腔室內(nèi)的窄區(qū)中并且濃縮數(shù)百倍。將蛋 白質(zhì)限制在其pi點(diǎn)(零凈電荷)和高濃度下可能增大沉淀和/或聚集的可能性。因此, 可能所希望的是在聚焦溶液中包括一種或多種添加劑以減少沉淀和/或聚集,包括例如尿 素、糖以及非離子或兩性離子表面活性劑。
[0088] 在一個(gè)實(shí)施例中,尿素被包括在聚焦溶液中以改進(jìn)蛋白質(zhì)溶解性。在更特定實(shí) 施例中,尿素以一定濃度包括在聚焦溶液中,該濃度介于約〇. 1M與約20M之間,或至少約 0. 1M、至少約0. 5M、至少約1M以及高達(dá)約5M、高達(dá)約10M、高達(dá)約15M、或高達(dá)約20M。
[0089] 樣品裝載
[0090] 典型地,在將聚焦溶液10引入到分離腔室120中之前,用一種或多種預(yù)適應(yīng)沖洗 液準(zhǔn)備腔室120。在腔室120包括共價(jià)聚合涂層的一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120用5到10 個(gè)體積的溶劑(如有機(jī)溶劑,例如極性有機(jī)溶劑)沖洗,隨后引入聚焦溶液。術(shù)語(yǔ)"極性有 機(jī)溶劑"包括極性質(zhì)子溶劑和極性非質(zhì)子溶劑兩者。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"極性質(zhì)子溶劑"是 指具有可離解的氫的溶劑,例如包括與氧原子結(jié)合的氫原子的醇。術(shù)語(yǔ)"極性非質(zhì)子溶劑" 是指缺乏酸性氫的溶劑。適合醇的實(shí)例包括脂肪醇,如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇以及 其組合。在分離腔室120未經(jīng)涂布的另一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120可以用10到15個(gè)體 積的陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液(例如磷酸、甲酸、天冬氨酸或其組合)或陰極電解質(zhì)緩沖液(例如 氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸鉀或其組合)沖洗。如果希望的話,分離腔室120還可以 用10到15個(gè)體積的去離子水和/或5到10個(gè)體積的分離溶液沖洗??傮w上,預(yù)適應(yīng)流體 是通過(guò)以下方式經(jīng)由分離腔室輸送的:或者在分離腔室120的入口 121處例如通過(guò)以介于 約0. 5psi與約50psi之間的壓力使用注射泵來(lái)施加壓力,或者在分離腔室122的出口 122 處例如通過(guò)以介于約〇? 5psi與約50psi之間的壓力施加真空來(lái)減小壓力。預(yù)適應(yīng)沖洗液 的流速總體上是至少約1UL/min、或至少約2yL/min、以及高達(dá)約3yL/min、高達(dá)約4yL/ min、或高達(dá)約5yL/min〇
[0091] -旦分離腔室120就緒,就可以引入該聚焦溶液10。兩種常用注射方法包括水動(dòng) 力注射和電動(dòng)注射。水動(dòng)力注射是通過(guò)在該分離腔室120的兩端之間施加介于約0. 5psi與 約50psi之間的壓力差,S卩,通過(guò)在入口 121處使用注射器或在出口 122處使用真空來(lái)實(shí)現(xiàn) 的。電動(dòng)注射是通過(guò)用包含聚焦溶液10的儲(chǔ)槽暫時(shí)替換掉陽(yáng)極電解質(zhì)儲(chǔ)槽131或陰極電解 質(zhì)緩沖液儲(chǔ)槽132中的一者并且將電壓打開持續(xù)某一時(shí)間段來(lái)執(zhí)行的。在一個(gè)實(shí)施例中, 聚焦溶液10是通過(guò)施加一定電壓來(lái)引入的,典型地使用在約lkV到約50kV之間的電壓,例 如至少約lkV、至少約5kV、至少約10kV、至少約15kV、至少約20kV、以及至少約25kV和/或 聞達(dá)約20kV、聞達(dá)約25kV、聞達(dá)約30kV、聞達(dá)約35kV、聞達(dá)約40kV、聞達(dá)約45kV或聞達(dá)約 50kV。聚焦電壓總體上為至少約300V/cm、至少約325V/cm、至少約350V/cm、至少約375V/cm 以及高達(dá)約400V/cm、高達(dá)約425V/cm、高達(dá)約450V/cm、高達(dá)約475V/cm、高達(dá)約500V/cm、高 達(dá)約550V/cm、或高達(dá)約600V/cm。在電動(dòng)注射期間,總體上將電壓施加持續(xù)在約1分鐘與 約30分鐘之間,例如至少約1分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約15分鐘、以及高 達(dá)約10分鐘、高達(dá)約15分鐘、高達(dá)約20分鐘、高達(dá)約25分鐘、或高達(dá)約30分鐘。所引入 的樣品的特定量可以通過(guò)控制注射壓力、注射電壓和/或注射時(shí)間來(lái)控制。
[0092] 在一個(gè)實(shí)施例中,聚焦溶液10與分離溶液組合,隨后引入到分離腔室120中。在 替代實(shí)施例中,分離腔室120首先經(jīng)分離溶液填充并且接著將聚焦溶液10引入到分離腔室 120中。在再另一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120部分經(jīng)分離溶液填充,接著注射該聚焦溶液10, 并且接著用分離溶液填充該分離腔室120的其余部分。
[0093] 足夠量的聚焦溶液10應(yīng)裝載于聚焦腔室120中使得聚焦腔室120包含均勻的樣 品混合物。在一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120用一定體積的聚焦溶液10注射,該體積小于或 等于由分離腔室120的內(nèi)表面125界定的體積。在一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120用一定體 積的聚焦溶液10注射,該體積是在分離腔室體積的約25%與約100%之間,具體來(lái)說(shuō),是 至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、或至少約50%、以及高 達(dá)約50 %、高達(dá)約75 %、高達(dá)約80 %、高達(dá)約85 %、高達(dá)約90 %、高達(dá)約95 %、或高達(dá)約 100%的分離腔室體積。總的來(lái)說(shuō),注射到分離腔室120中的聚焦溶液的體積將隨著腔室的 尺寸而改變。然而,總的來(lái)說(shuō),分離腔室120用一定體積的聚焦溶液注射,該體積是至少約 0? 1或至少約1y1、至少約1、至少約1、至少約1、至少約1、至少約1、 至少約7ill、至少約8ill、至少約9ill、或至少約10ill、并且取決于分離腔室的尺寸,高達(dá) 約聞達(dá)約2u1、聞達(dá)約3u1、聞達(dá)約4u1、聞達(dá)約5u1、聞達(dá)約10u1、聞達(dá)約15u1、聞達(dá) 約20iU、或高達(dá)約25iil。
[0094] MM
[0095] 在聚焦溶液10經(jīng)制備并且引入到分離腔室120中之后,聚焦可以通過(guò)以下方式起 始:將分離腔室120的第一端121偶聯(lián)于第一緩沖液儲(chǔ)槽131 (包含或者陽(yáng)極電解質(zhì)或者陰 極電解質(zhì)緩沖液)并且將分離腔室120的第二端122偶聯(lián)于第二緩沖液儲(chǔ)槽132 (包含或 者陽(yáng)極電解質(zhì)或者陰極電解質(zhì)緩沖液,無(wú)論哪個(gè)不用于第一緩沖液儲(chǔ)槽),之后施加電場(chǎng)。 如在此所用,術(shù)語(yǔ)"偶聯(lián)"意指分離腔室120的末端121U22與對(duì)應(yīng)的儲(chǔ)槽131U32處于流 體聯(lián)通。術(shù)語(yǔ)"流體連通"意指流體可以在分離腔室120的末端121U22與鄰近儲(chǔ)槽131、 132之間自由傳遞。在一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120通過(guò)將分離腔室120的對(duì)應(yīng)末端121、 122浸沒(méi)在存在于鄰近儲(chǔ)槽131、132中的溶液中而與第一 131和第二132緩沖液儲(chǔ)槽偶聯(lián)。 [0096] 在電場(chǎng)的影響下,氫離子開始從包含陽(yáng)極電解質(zhì)的儲(chǔ)槽朝著包含陰極電解質(zhì)的儲(chǔ) 槽遷移,并且來(lái)自陰極電解質(zhì)的氫氧根離子開始以相反方向移動(dòng),使得載體兩性電解質(zhì)產(chǎn) 生pH梯度。典型地使用在約lkV到約50kV之間的聚焦電壓,例如至少約lkV、至少約5kV、 至少約10kV、至少約15kV、至少約20kV、以及至少約25kV和/或高達(dá)約20kV、高達(dá)約25kV、 高達(dá)約30kV、高達(dá)約35kV、高達(dá)約40kV、高達(dá)約45kV或高達(dá)約50kV。聚焦電壓總體上為至 少約300V/cm、至少約325V/cm、至少約350V/cm、至少約375V/cm以及高達(dá)約400V/cm、高達(dá) 約425V/cm、高達(dá)約450V/cm、高達(dá)約475V/cm、高達(dá)約500V/cm、高達(dá)約550V/cm、或高達(dá)約 600V/cm〇
[0097] 施加該聚焦電壓直到樣品組分被聚焦,即當(dāng)樣品組分處于對(duì)應(yīng)于其對(duì)應(yīng)等電點(diǎn)的 pH下并且遷移終止時(shí),使得每一組分都分離成定位在其等電點(diǎn)的pH下的窄帶。一旦每一分 析物都已遷移到其凈電荷為中性的區(qū)域,帶的位置就變得恒定并且不再隨著時(shí)間變化。在 一些情況下,一旦樣品組分被聚焦,就可以檢測(cè)到電壓降。
[0098] 許多因素可以影響聚焦時(shí)間。舉例來(lái)說(shuō),聚焦時(shí)間可以受樣品中的鹽濃度影響???體上,更高鹽濃度將引起更快的聚焦過(guò)程,因?yàn)閜H梯度傾向于因存在鹽而變窄。替代地,聚 焦速度在CA的濃度更高或電壓改變時(shí)可能變得更慢??傮w上,聚焦時(shí)間在介于約1分鐘與 約120分鐘之間的范圍內(nèi),例如從至少約1分鐘、至少約5分鐘、至少約10分鐘、至少約15 分鐘、至少約20分鐘、至少約25分鐘、至少約30分鐘、以及高達(dá)約40分鐘、高達(dá)約45分鐘、 高達(dá)約50分鐘、高達(dá)約55分鐘、高達(dá)約60分鐘、高達(dá)約90分鐘、以及高達(dá)120分鐘??梢?采用電壓梯度,在更低電壓下開始,并且隨著時(shí)間推進(jìn)而增大電壓。
[0099] 在cIEF期間的溫度控制可能是重要的,因?yàn)閜i可能取決于溫度。在一個(gè)實(shí)施 例中,聚焦在至少約〇°C、至少約5°C、至少約10°C、至少約15°C、至少約20°C、以及高達(dá)約 25°C、高達(dá)約30°C、高達(dá)約35°C、或高達(dá)約40°C的溫度下執(zhí)行。
[0100] 動(dòng)員
[0101] 在樣品溶液的組分被聚焦之后,它們被動(dòng)員出該分離腔室120??傮w上,動(dòng)員可以 水動(dòng)力地或化學(xué)地實(shí)現(xiàn)。水動(dòng)力動(dòng)員使用或者壓力或者真空(總體上介于約〇? 5psi與約 50psi之間)以便動(dòng)員所聚焦的蛋白質(zhì)?;瘜W(xué)動(dòng)員通過(guò)改變陽(yáng)極電解質(zhì)或陰極電解質(zhì)緩沖 液的化學(xué)組成來(lái)進(jìn)行,這會(huì)引起pH梯度的偏移,該偏移引起所聚焦的樣品組分的遷移。常 見(jiàn)化學(xué)動(dòng)員方法包括將中性鹽(如氯化鈉)加入到或者陽(yáng)極電解質(zhì)和/或陰極電解質(zhì)緩沖 液中。鈉離子充當(dāng)陽(yáng)極動(dòng)員中的非質(zhì)子陽(yáng)離子,而氯離子充當(dāng)陰極動(dòng)員中的非羥基陰離子。 在其他已知化學(xué)動(dòng)員方法中,用陰極緩沖液替換陽(yáng)極緩沖液(或反過(guò)來(lái))。動(dòng)員的方向(或 者陽(yáng)極或者陰極)可以選擇,取決于分析物組分的特性,例如根據(jù)分析物的酸性特征。對(duì)于 陰極動(dòng)員來(lái)說(shuō),用包含另一種陰離子的溶液替換陰極電解質(zhì)緩沖液。對(duì)于陽(yáng)極動(dòng)員來(lái)說(shuō),用 包含另一種陽(yáng)離子的溶液替換陽(yáng)極電解質(zhì)緩沖液。
[0102] 于在此所描述的新穎方法和系統(tǒng)中,動(dòng)員緩沖液是鞘流緩沖液。與常規(guī)CEIF-ESI 偶聯(lián)(在該常規(guī)cEIF-ESI偶聯(lián)中,除用于ESI的電離緩沖液之外,用于cIEF的動(dòng)員緩沖液 是分離溶液)對(duì)比,使用組合的"鞘流緩沖液",該鞘流緩沖液既充當(dāng)用于cIEF的動(dòng)員緩沖 液又充當(dāng)用于ESI的電離緩沖液。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"鞘流緩沖液"是指包含極性有機(jī)溶劑 和有機(jī)酸的溶液??傮w上,鞘流緩沖液包含介于約25%v/v與約75%v/v之間的極性有機(jī) 溶劑,總體上至少約25%v/v、至少約30%v/v、至少約35%v/v、至少約40%v/v、至少約 45%v/v或至少約50%v/v、以及高達(dá)約50%v/v、高達(dá)約55%v/v、高達(dá)約60%v/v、高達(dá) 約65%v/v、高達(dá)約70%v/v、或高達(dá)約75%v/v極性有機(jī)溶劑。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"極性 有機(jī)溶劑"包括極性質(zhì)子溶劑和極性非質(zhì)子溶劑兩者。術(shù)語(yǔ)"極性質(zhì)子溶劑"是指具有可離 解的氫的溶劑,例如包括與氧原子結(jié)合的氫原子的醇。術(shù)語(yǔ)"極性非質(zhì)子溶劑"是指缺乏酸 性氫的溶劑。適合極性質(zhì)子溶劑的實(shí)例包括脂肪醇,包括(但不限于)甲醇、乙醇、丙醇、丁 醇、異丙醇以及其組合。適合極性非質(zhì)子溶劑的實(shí)例包括乙腈??傮w上,鞘流緩沖液還包含 在約0. 01 %v/v與約1 %v/v之間的有機(jī)酸,總體上至少約0. 01 %v/v、至少約0. 05%v/ v、或至少約0. 1%v/v以及高達(dá)約0. 1%v/v、高達(dá)約0. 5%v/v或高達(dá)約1. 0%v/v的有 機(jī)酸。在一個(gè)實(shí)施例中,有機(jī)酸為羧酸。羧酸是包含至少一個(gè)羧基并且具有通式R-C00H的 有機(jī)酸。在一個(gè)實(shí)施例中,R-為烷烴。在一個(gè)實(shí)施例中,羧酸的pKa在約3. 5與5.0之間。 適合羧酸的實(shí)例包括(但不限于)甲酸(HC02H,pKa3. 75)、乙酸(CH3COOH,pKa4. 76)、乙 酸(CH3C02H,pKa4. 7)以及丙酸(CH3CH2C02H,pKa4. 9)。
[0103] 在一個(gè)實(shí)施例中,鞘流緩沖液包含介于約25%v/v與約75%v/v之間的脂肪醇, 總體上至少約25%v/v、至少約30%v/v、至少約35%v/v、至少約40%v/v、至少約45%v/ v或至少約50%v/v、以及高達(dá)約50%v/v、高達(dá)約55%v/v、高達(dá)約60%v/v、高達(dá)約65% v/v、高達(dá)約70%v/v、或高達(dá)約75%v/v脂肪醇。在一個(gè)實(shí)施例中,鞘流緩沖液包含介于 約25%v/v與約75%v/v之間的甲醇,總體上至少約25%v/v、至少約30%v/v、至少約 35%v/v、至少約40%v/v、至少約45%v/v或至少約50%v/v、以及高達(dá)約50%v/v、高達(dá) 約55%v/v、高達(dá)約60%v/v、高達(dá)約65%v/v、高達(dá)約70%v/v、或高達(dá)約75%v/v甲醇。 在另一個(gè)實(shí)施例中,鞘流緩沖液包含介于約25%v/v與約75%v/v之間的乙腈,總體上至 少約25%v/v、至少約30%v/v、至少約35%v/v、至少約40%v/v、至少約45%v/v或至少 約50%v/v、以及高達(dá)約50%v/v、高達(dá)約55%v/v、高達(dá)約60%v/v、高達(dá)約65%v/v、高達(dá) 約70%v/v、或高達(dá)約75%v/v乙腈。在其他實(shí)施例中,鞘流緩沖液還包含在約0. 01%v/ v與約1%v/v之間的羧酸,總體上至少約0. 01%v/v、至少約0. 05%v/v、或至少約0. 1% v/v以及高達(dá)約0. 1%v/v、高達(dá)約0. 5%v/v或高達(dá)約1. 0%v/v的羧酸。在更具體實(shí)施例 中,鞘流緩沖液包含在約〇. 01%v/v與約1%v/v之間的甲酸,總體上至少約0. 01%v/v、 至少約0. 05%v/v、或至少約0. 1 %v/v以及高達(dá)約0. 1 %v/v、高達(dá)約0. 5%v/v或高達(dá)約 1. 0%v/v的甲酸。在更具體實(shí)施例中,鞘流緩沖液包含介于約25%v/v與約75%v/v之 間的甲醇,總體上至少約25%v/v、至少約30%v/v、至少約35%v/v、至少約40%v/v、至 少約45%v/v或至少約50%v/v、以及高達(dá)約50%v/v、高達(dá)約55%v/v、高達(dá)約60%v/ v、高達(dá)約65%v/v、高達(dá)約70%v/v、或高達(dá)約75%v/v甲醇以及介于約0. 01 %v/v與約 1%v/v之間的甲酸,總體上至少約0. 01%v/v、至少約0. 05%v/v、或至少約0. 1%v/v以 及高達(dá)約〇. 1%v/v、高達(dá)約0. 5%v/v或高達(dá)約1. 0%v/v甲酸。
[0104] 于在此所描述的新穎系統(tǒng)中,CIEF分離腔室120的出口端122在線偶聯(lián)于電噴霧 電離儀器的發(fā)射器210的輸入端211,并且所分離的樣品組分從分離腔室120化學(xué)動(dòng)員到發(fā) 射器210是使用鞘流緩沖液實(shí)現(xiàn)的。如在此所用,術(shù)語(yǔ)"偶聯(lián)"意指cIEF分離腔室的出口 端122與發(fā)射器210處于流體連通。在一個(gè)實(shí)施例中,分離腔室120的出口端122通過(guò)將 分離腔室的出口端122引入到發(fā)射器210的入口端210中而與發(fā)射器210偶聯(lián)。
[0105] 與將來(lái)自分離腔室120的洗脫液與電離溶液組合的常規(guī)cEIF-ESI偶聯(lián)對(duì)比,在本 發(fā)明的方法中將鞘流緩沖液(上述)用作動(dòng)員溶液。鞘流的低流速相對(duì)于常規(guī)技術(shù)有利地 減少樣品的稀釋度。
[0106] 在動(dòng)員期間,可能重要的是維持適當(dāng)?shù)耐饧与妷菏沟梅治鑫锝M分保持聚焦并且不 因動(dòng)員步驟而散開。在動(dòng)員開始時(shí),電流最初保持在低值下,與在聚焦結(jié)束時(shí)觀察到的值 相似,例如介于約luA與約10iiA之間,或至少約liiA、至少約2iiA、至少約3iiA、至少 約4iiA、至少約5iiA、以及高達(dá)約6iiA、高達(dá)約7iiA、高達(dá)約8iiA、高達(dá)約9iiA、或高達(dá)約 10UA。隨著動(dòng)員進(jìn)展,電流隨著鹽離子進(jìn)入毛細(xì)管而逐漸開始上升。稍后在動(dòng)員中,當(dāng)鹽 離子存在于整個(gè)柱中時(shí),電流快速上升指示動(dòng)員完成,例如,可以觀察到介于約10UA與約 20yA之間的增大。在一個(gè)實(shí)施例中,所聚焦的分析物在動(dòng)員期間維持其相對(duì)位置。
[0107] 在動(dòng)員期間,使用總體上保持在約lkV到約50kV之間的電壓,例如至少約lkV、至 少約5kV、至少約10kV、至少約15kV、至少約20kV、以及至少約25kV和/或高達(dá)約20kV、高 達(dá)約25kV、高達(dá)約30kV、高達(dá)約35kV、高達(dá)約40kV、高達(dá)約45kV、或高達(dá)約50kV。電場(chǎng)總 體上保持為至少約300V/cm、至少約325V/cm、至少約350V/cm、至少約375V/cm以及高達(dá)約 400V/cm、高達(dá)約425V/cm、高達(dá)約450V/cm、高達(dá)約475V/cm、高達(dá)約500V/cm、高達(dá)約550V/ cm、或高達(dá)約600V/cm。動(dòng)員總體上耗時(shí)在約1分鐘與約30分鐘之間,例如至少約1分鐘、 至少約5分鐘、至少約10分鐘、或至少約15分鐘、以及高達(dá)約20分鐘、高達(dá)約20分鐘、高 達(dá)約25分鐘或高達(dá)約30分鐘。
[0108]電啼霧電離(ESI)
[0109]cEIF和ESI的偶聯(lián)可以在線或離線執(zhí)行。在在線偶聯(lián)中,從分離腔室120動(dòng)員的 溶液例如使用同軸鞘流接口、無(wú)鞘接口或液體接合接口直接進(jìn)料到電噴霧發(fā)射器210中。 偶聯(lián)的離線方法包括收集例如從稍后有待分析的的分離腔室120洗脫的洗脫份。
[0110] 在典型的cEIF-ESI偶聯(lián)中,來(lái)自分離腔室的洗脫液與揮發(fā)性有機(jī)溶劑組合以形 成電離溶液20,該電離溶液接著被引入到電噴霧發(fā)射器210中。參見(jiàn)圖3。用于形成電離 溶液的典型揮發(fā)性有機(jī)溶劑的實(shí)例包括甲醇和乙腈。電離溶液還可以包括電離劑,例如H+、 Na+或K+。
[0111] 如先前論述,與將來(lái)自分離腔室120的洗脫液與電離溶液組合的常規(guī)cEIF-ESI偶 聯(lián)對(duì)比,相同的鞘流緩沖液可以既用作用于cEIF的動(dòng)員溶液又用作用于ESI的電離溶液。
[0112] 如圖3中所示,電噴霧發(fā)射器210典型地為具有入口 211和出口 212的細(xì)長(zhǎng)容器, 其中該出口 212具有小直徑孔口 213(S卩,在約liim與約lOiim之間、在約liim與約5iim 之間或在約2iim與約3iim之間的孔口)。電源250產(chǎn)生電位(典型地在約lkV與約10kV 之間、在約2kV到約6kV之間或在約3kV與約4kV之間),將該電位施加在電噴霧發(fā)射器 210與反電極220之間。電離溶液20中具有相同極性表面電荷的離子與發(fā)射器210的電 荷之間的排斥引起離子遷移到發(fā)射器210的出口 212并且形成錐體(稱為泰勒錐(Taylor cone) 214)。一旦排斥力變得比電離溶液20的表面張力更大,細(xì)微的氣溶膠噴霧就從發(fā)射 器210的出口 212朝著反電極220發(fā)射。當(dāng)液滴時(shí)橫穿發(fā)射器出口 212與反電極220之間 的空間時(shí),溶劑蒸發(fā)。典型地,電離/蒸發(fā)過(guò)程是在大氣壓下執(zhí)行的。
[0113] 電離溶液以一定流速引入到發(fā)射器210中,該流速為至少約0.001iU/min、至少 約 0. 005u1/min、至少約 0. 01u1/min、至少約 0. 05u1/min、至少約 0. 1u1/min、至少約 0? 5y1/min、以及高達(dá)約0? 1y1/min、高達(dá)約0? 5y1/min、高達(dá)約1y1/min、高達(dá)約5y1/ min、高達(dá)約lOy1/min、高達(dá)約 50ii1/min、以及高達(dá)約lOOii1/min。
[0114] 電噴霧電壓可以在約lkv與約10kv之間。毛細(xì)管出口與發(fā)射器尖端之間的距離 可以在約1mm與約2mm之間。發(fā)射器末端與MS入口之間的距離可以在約1mm與約10mm之 間。發(fā)射器的大小可以在約2iim與約20iim之間。
[0115] 一旦樣品溶液的組分通過(guò)cIEF分離,就可以通過(guò)質(zhì)譜(MS)對(duì)它們進(jìn)行分析。cIEF 可以使用電噴霧電離(ESI)作為接口與MS偶聯(lián)。電噴霧電離(ESI)時(shí)常用于電離熱不穩(wěn) 定和高分子量化合物,如肽和其他聚合物聚合物。在此所述的本發(fā)明提供了用于將CIEF與 ESI-MS在線偶聯(lián)的系統(tǒng)。
[0116] 遺遒
[0117] 圖4是示出了質(zhì)譜儀350的基本組件的方框圖。離子源200(ESI,上述)是中性樣 品分子被電離的地方。在質(zhì)量分析器300中,離子使用外加電場(chǎng)根據(jù)它們的質(zhì)荷比(m/z) 或者在空間方面或者在時(shí)間方面進(jìn)行加速與分離。
[0118] 在離子被分離之后,通過(guò)檢測(cè)器400檢測(cè)這些離子,并且將信號(hào)傳送到數(shù)據(jù)系統(tǒng) 600以便分析。檢測(cè)可以基于電荷或動(dòng)量。更老的儀器使用攝影板來(lái)測(cè)量每一質(zhì)荷比下的 離子豐度。目前使用的大部分檢測(cè)器使用與光電倍增管相似的集光器來(lái)放大離子信號(hào)。這 些放大檢測(cè)器包括:電子倍增器、通道倍增器以及多通道板。檢測(cè)器針對(duì)它的速度、動(dòng)態(tài)范 圍、增益以及幾何結(jié)構(gòu)加以選擇。一些檢測(cè)器靈敏到足以檢測(cè)單一離子。數(shù)據(jù)分析可以通 過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索來(lái)執(zhí)行例如以確定宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的存在。
[0119] 質(zhì)譜儀典型地還具有真空系統(tǒng)500來(lái)維持低壓,從而減少離子與質(zhì)量分析器300 中的其它分子碰撞的機(jī)率。碰撞可以引起離子反應(yīng)、中和、散射、或碎裂,這些可以干擾質(zhì) 譜。為了將碰撞減到最少,實(shí)驗(yàn)在高真空條件(典型地1(T2到l(T5Pa(l(r4到1(T7托))下 進(jìn)行,取決于儀器的幾何結(jié)構(gòu)。
[0120] 質(zhì)量分析器的選擇取決于分辨率、質(zhì)量范圍、掃描速率以及檢測(cè)限。每一分析器 具有極為不同的工作特征,并且儀器的選擇涉及重要權(quán)衡并且可以是連續(xù)或脈沖的??傮w 上有五種不同類型的質(zhì)譜儀:(1)磁扇形和雙聚焦儀器,該儀器使用磁場(chǎng)依據(jù)離子的動(dòng)量 來(lái)分離離子;(2)透過(guò)式四極,它使用四極場(chǎng)以允許僅單一m/z值的離子從離子源傳遞到檢 測(cè)器;(3)四極離子阱,它使用四極場(chǎng)以儲(chǔ)存所有m/z值的離子并且接著將它們?nèi)シ€(wěn)定化, 一次一種m/z值,從而獲得質(zhì)譜;(4)飛行時(shí)間(T0F)質(zhì)譜儀,它依據(jù)通過(guò)無(wú)場(chǎng)區(qū)的飛行時(shí) 間實(shí)現(xiàn)不同m/z值的經(jīng)加速離子的分離;以及(5)傅里葉變換離子回旋共振(FTICR)質(zhì)譜 儀(有時(shí)稱為FTMS),它產(chǎn)生一系列共振頻率的傅里葉變換,該傅里葉變換對(duì)應(yīng)于儲(chǔ)存在磁 性離子阱中的不同m/z值的離子。這些類型質(zhì)譜儀中的任一者都可以結(jié)合本發(fā)明的系統(tǒng)使 用。
[0121] LTQ-〇rbitrap-velos可以包括約30CTC的毛細(xì)管溫度。MSlOrbitrap分析器可以 在60, 000的分辨率下。MSlOrbitrap分析器的參數(shù)可以包括約395m/z到約1800m/z的掃 描范圍。12個(gè)最強(qiáng)峰可以用于MS2(離子阱)。MSlOrbitrap分析器的參數(shù)可以包括35% 正規(guī)化的碰撞。
[0122] 如在此所用,術(shù)語(yǔ)"約"用于修飾例如在描述本發(fā)明中使用的組合物中成分的數(shù) 量、濃度、體積、工藝溫度、工藝時(shí)間、產(chǎn)率、流速、壓力以及它們的范圍。術(shù)語(yǔ)"約"是指可能 發(fā)生的數(shù)值量的變化,例如經(jīng)由用于制備化合物、組合物、濃縮物或使用配制品的典型的測(cè) 量和操作程序;經(jīng)由這些程序中無(wú)意的誤差;經(jīng)由用于進(jìn)行這些方法的起始材料或成分的 制造、來(lái)源或純度中的差異以及其他類似考慮因素。術(shù)語(yǔ)"約"還涵蓋因配制品的老化而與 具體起始濃度或混合物不同的量,和因混合或處理配制品而與具體起始濃度或混合物不同 的量。當(dāng)利用術(shù)語(yǔ)"約"修飾時(shí),在此隨附的權(quán)利要求書包括這些等效量。
[0123] 應(yīng)注意,除非內(nèi)容另外明確指明,否則如本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中所用,單數(shù) 形式"一個(gè)(a)"、"一個(gè)(an)"和"該(the)"包括多個(gè)指示物。還應(yīng)注意的是除非內(nèi)容另外 明確指明,否則術(shù)語(yǔ)"或"總體上是以它包括"和/或"的含義使用。
[0124] 還應(yīng)注意到,如所使用,在本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求書中,短語(yǔ)"配置"描述系統(tǒng)、 設(shè)備或其他結(jié)構(gòu)被構(gòu)建成或被配置成執(zhí)行具體任務(wù)或采用具體配置。短語(yǔ)"配置"與其他 類似短語(yǔ)如"安排"、"安排和配置"、"構(gòu)建和安排"、"構(gòu)建"、"制造和安排"等可以互換使用。
[0125] 本說(shuō)明書中的所有公開和專利申請(qǐng)均表現(xiàn)出本發(fā)明所涉及的領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員的水平。所有公開和專利申請(qǐng)?jiān)诖司ㄟ^(guò)引用并入,其程度就如同每一篇單獨(dú)的公開或 專利申請(qǐng)案特定并且單獨(dú)地表明為通過(guò)引用并入。
[0126] 本申請(qǐng)打算涵蓋本發(fā)明主題的改編形式或變化形式。應(yīng)理解,以上說(shuō)明旨在是說(shuō) 明性并且非限制性的。應(yīng)易于清楚的是,在此所描述任何一種或多種設(shè)計(jì)特征都可以與任 何具體配置形成任何組合使用。在使用成型工藝的情況下,這些設(shè)計(jì)特征可以在無(wú)實(shí)質(zhì)性 額外制造成本的情況下并入。組合的數(shù)目大多以致無(wú)法描述,并且本發(fā)明不被在此所描述 的任一具體說(shuō)明性組合限制或限于該組合。應(yīng)參考所附權(quán)利要求,以及這些權(quán)利要求所授 權(quán)的等效物的全部范圍,判定本發(fā)明主題的范圍。
[0127] 工作實(shí)例
[0128] 除非另行說(shuō)明,否則所有試劑均購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司(SigmaAldrich Co.;美 國(guó)密蘇里州圣路易斯(St. Louis,M0, USA))。
[0129] 實(shí)例1:樣品制備
[0130] 制各BSA降解物
[0131] 牛血清白蛋白(BSA)降解物(0?lmg/mL)用于評(píng)估cIEF-ESI-MS/MS系統(tǒng)的再現(xiàn) 性。將BSA(0. 5mg/mL)溶解于100mM碳酸氫銨(pH 8. 0)中并且在90°C下變性10分鐘,之后 通過(guò)用二硫蘇糖醇〇)TT)(8mM)在65°C下還原lh并且用碘乙酸(IAA) (20mM)在室溫下在黑 暗中烷基化30分鐘來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)還原和烷基化過(guò)程。降解通過(guò)將蛋白質(zhì)與胰蛋白酶一起以 l:30(w/w)的胰蛋白酶:蛋白質(zhì)比率在37°C下孵育12小時(shí)來(lái)執(zhí)行。羧基官能化的磁性微球 (BioMag?Plus羧基,平均直徑約是購(gòu)自鎊斯實(shí)驗(yàn)室公司(Bangs Laboratories, Inc.;美國(guó)印第安納州費(fèi)歇爾斯(Fishers,IN,USA)),并且羧基官能化的磁性微球的活化 和胰蛋白酶固定是如李(Li)等人,色譜A雜志(J.Chromatogr.A)2011,1218,2007-2011所 描述的執(zhí)行的。
[0132] 三蛋白混合物的制各
[0133] 還使用三蛋白混合物來(lái)評(píng)估cIEF-ESI-MS/MS系統(tǒng)的性能。三蛋白混合物以50倍 濃度范圍制備并且包含BSA(0. 5mg/mL)、0. 7iiM細(xì)胞色素c(0. 0095mg/mL)以及140nM 肌紅蛋白(0. 〇〇25mg/mL)。將蛋白混合物溶解于lOOmM碳酸氫銨(pH8. 0)中并且在90°C下 變性10分鐘,之后如先前所述用二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙酸(IAA)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)還原和烷基化 過(guò)程。對(duì)于固定的胰蛋白酶降解,將30yL蛋白質(zhì)溶液與200yg胰蛋白酶固定的珠粒一起 在37°C下孵育10分鐘。降解物用通過(guò)來(lái)自賽默科技公司(Thermoscientific;美國(guó)俄亥俄 州瑪麗埃塔(Marietta,0H,USA))的NanoPure系統(tǒng)去離子的水1:1稀釋并且儲(chǔ)存在-20°C 下以供使用。
[0134] 耗乏的重鉬人類IgG細(xì)朐培養(yǎng)某
[0135] 重組人類IgG是由醫(yī)學(xué)免疫公司(Medlmmune,Inc)使用已知的細(xì)胞培養(yǎng)方法制備 的。重組人類IgG接著使用NAb蛋白A(賽默科技公司)和蛋白質(zhì)L(賽默科技公司)離心 柱從測(cè)試樣品中耗乏。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō),蛋白A離心柱用IX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS;pH7.2)平 衡。IgG樣品用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)稀釋并且加入到柱中。在室溫下在通過(guò)倒轉(zhuǎn)輕輕混 合下孵育十分鐘之后,收集流過(guò)物并且將它立即加入平衡的蛋白質(zhì)L離心柱中。如上文所 述對(duì)蛋白質(zhì)L柱進(jìn)行孵育和混合。對(duì)蛋白質(zhì)L流過(guò)物(耗乏的培養(yǎng)基)進(jìn)行收集并且儲(chǔ)存 在-80°C下以供使用。
[0136] 將從蛋白質(zhì)A/L柱獲得的流過(guò)部分(0? 045mg/mL,500iiL)(上述)在艾本德濃縮 器(Eppendorfconcentrator)中干燥。將干燥的樣品溶解于具有1M尿素的100yL100mM 碳酸氫銨(NH4HC03)中并且在90°C下變性10分鐘,之后如上述用二硫蘇糖醇(DTT)和碘乙 酸(IAA)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)還原和烷基化過(guò)程。降解通過(guò)將50yL變性的蛋白質(zhì)與400yg固定的 胰蛋白酶磁性珠粒一起在37°C下孵育10分鐘來(lái)執(zhí)行。將降解物儲(chǔ)存在-20°C下以供使用。
[0137]實(shí)例 2:cIEF
[0138] 本實(shí)例中所用的儀器是基于由沃伊齊克(Wojcik)等人,質(zhì)譜快訊(Rapid Commun.MassSpectrom.) 2010, 24, 2554-2560所描述的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。商業(yè)線性聚丙 烯酰胺(LPA)涂布的毛細(xì)管(50 內(nèi)徑,150 外徑,50cm長(zhǎng),亞利桑那州菲尼克斯的聚 微技術(shù)公司(PolymicroTechnologies,Phoenix,AZ))用于cIEF分離。將毛細(xì)管的陽(yáng)極 端置放于甲酸(0.1%,pH2. 5)中,并且將陰極端置放于0.3%氫氧化銨(pH11)中。毛 細(xì)管用在〇. 4%Pharmalyte(3-10)溶液(新澤西州皮斯卡塔威的通用電氣醫(yī)療集團(tuán)(GE Healthcare,Piscataway,NJ))中制備的樣品通過(guò)將該溶液以2psi吹掃通過(guò)毛細(xì)管持續(xù)3 分鐘來(lái)填充。這個(gè)實(shí)驗(yàn)中使用的注射體積等于毛細(xì)管體積。聚焦電壓以360V/cm施加10 分鐘。
[0139]實(shí)例 3:ESI
[0140] 在聚焦之后,將毛細(xì)管的陰極端插入到電噴霧接口的發(fā)射器中(沃伊齊克等人, 質(zhì)譜快訊2010, 24, 2554-2560),并且化學(xué)動(dòng)員用鞘流緩沖液執(zhí)行,使得該鞘流緩沖液既用 作用于cIEF的化學(xué)動(dòng)員溶液又用作用于電噴霧電離的電離緩沖液。研究了三種類別的鞘 流緩沖液:50%甲醇和0. 05%乙酸;50%甲醇和0. 05%甲酸;50%甲醇和0. 1%甲酸。甲酸 (FA)是購(gòu)自飛世爾科技公司(美國(guó)賓夕法尼亞州匹茲堡)。電場(chǎng)在動(dòng)員期間保持在330V/ cm下。
[0141] 圖5呈現(xiàn)三種鞘流緩沖液的電流特征曲線。曲線a示出了在鞘流中使用0. 05%乙 酸的cIEF化學(xué)動(dòng)員。曲線b和c分別使用0.05%甲酸和0.1%甲酸作為鞘流緩沖液。電 流在使用50%甲醇和0.05%乙酸的化學(xué)動(dòng)員期間較低并且不顯著變化。
[0142] 相比之下,在使用50%甲醇與0. 05%甲酸和50%甲醇與0. 1%甲酸的化學(xué)動(dòng)員期 間電流增大。電流在0.1%甲酸的情況下比在0.05%甲酸的情況下更快速地增大。似乎更 高濃度的甲酸加速動(dòng)員并且產(chǎn)生窄分離窗。在一些情況下,短分離窗可能不是所希望的,因 為它可以限制可以在分離期間聚集的串聯(lián)質(zhì)譜的數(shù)目。為了加寬分離窗并且增加肽數(shù)目和 蛋白質(zhì)序列覆蓋率,在以下實(shí)驗(yàn)中將50%甲醇與0. 05%甲酸用作鞘流。
[0143] 實(shí)例4 :數(shù)據(jù)獲取和處理
[0144] 所有質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)均使用LTQ-〇rbitrap Velos儀器(賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific))執(zhí)行。全MS掃描在Orbitrap質(zhì)量分析器中在395_1900m/z范圍內(nèi) 以分辨率60, 000 (在400m/z下)獲得。選擇電荷態(tài)彡2的十二個(gè)最強(qiáng)峰以便定序并且在 35%正規(guī)化的碰撞能量、活化q= 0. 25、10微秒活化時(shí)間以及一個(gè)微掃描下在離子阱中碎 裂。將針對(duì)在45秒窗內(nèi)碎裂兩次或更多次選擇的峰從用于另外45秒的選擇中排除。
[0145] 對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品,原始文件的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索是在Proteome Discoverer 1.2 中用SEQUEST搜索引擎對(duì)照ipi.bovin.v3. 68.fasta(針對(duì)BSA和細(xì)胞色素c)、equine.fasta(針對(duì)肌紅蛋白)執(zhí)行的。所鑒別的置信度值為"高"的肽被認(rèn)為是陽(yáng)性鑒別。
[0146] 對(duì)于HCP樣品,首先將原始文件傳送成mgf文件。mgf文件的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索是用 MASCOT搜索引擎對(duì)照SwissProt卩齒齒動(dòng)物執(zhí)行的。Trans-ProteomicPipeline(TPP)4. 4 用于過(guò)濾數(shù)據(jù)庫(kù)搜索結(jié)果,其中肽機(jī)率和蛋白質(zhì)機(jī)率均高于0. 9。
[0147] 肽(25±4)在一式三份的分析中以商置信度鑒別出,產(chǎn)生44% ±6%的序列覆蓋 率。還分析了三次運(yùn)行中的肽強(qiáng)度。表1(以下)呈現(xiàn)出從在一式三份的運(yùn)行中獲得的光 譜提取的五種肽的峰強(qiáng)度。峰強(qiáng)度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在從3%到8%的范圍內(nèi)。
[0148] 表1BSA降解物的一式三份分析中的提取的肽強(qiáng)度
[0149]
【權(quán)利要求】
1. 用于鑒別并分析樣品中的一種或多種組分的方法,該方法包括: a. 通過(guò)毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)分離該樣品中的一種或多種組分,其中將該樣品和一 種兩性電解質(zhì)緩沖液引入到分離腔室中并且在外加電壓下聚焦; b. 使用鞘流溶液將這些分離的組分從該分離腔室轉(zhuǎn)移到電離儀器,該鞘流溶液包含在 約30%與約50%之間的極性有機(jī)溶劑和在約0. 01 %與0. 1 %之間的有機(jī)酸; c. 將這些樣品組分電離;并且 d. 通過(guò)質(zhì)譜(MS)鑒別并分析該樣品中的一種或多種組分。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該鞘流溶液既充當(dāng)用于該分離腔室的動(dòng)員溶液又 充當(dāng)用于該電離儀器的電離溶液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該極性有機(jī)溶劑是選自極性質(zhì)子溶劑和極性非質(zhì) 子溶劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中該極性質(zhì)子溶劑包括脂肪醇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中該脂肪醇是選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇以 及其組合。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其中該極性非質(zhì)子溶劑包括乙腈。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該有機(jī)酸是選自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸以 及其組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該有機(jī)酸的pKa在約4. 0與5. 0之間。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其中該脂肪醇是甲醇并且該有機(jī)酸是甲酸。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中分離包括: a. 將一定體積的該樣品和兩性電解質(zhì)緩沖液引入到該分離腔室中,其中該分離腔室包 括毛細(xì)管;并且 b. 在高達(dá)約50kV的聚焦電壓下將該樣品和該兩性電解質(zhì)緩沖液在該分離毛細(xì)管中聚 焦。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該聚焦電壓是在約5kV與約30kV之間。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該樣品在介于約300V/cm與約600V/cm之間的 外加電場(chǎng)下聚焦。
13. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該外加電場(chǎng)是在約300V/cm與約400V/cm之間。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品在高達(dá)約50kV的動(dòng)員電壓下轉(zhuǎn)移到該電 離儀器。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法,其中該動(dòng)員電壓是在約lkV與約50kV之間。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品在介于約300V/cm與約600V/cm之間的外 加電場(chǎng)下轉(zhuǎn)移到該電離儀器。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品在介于約300V/cm與約350V/cm之間的外 加電場(chǎng)下轉(zhuǎn)移到該電離儀器。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品通過(guò)水動(dòng)力注射轉(zhuǎn)移到該電離儀器。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中水動(dòng)力注射包括在該分離腔室的入口處使用注 射器施加介于約〇? 5psi與約50psi之間的壓力。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法,其中水動(dòng)力注射包括在該分離腔室的出口處施加介 于約0. 5psi與約50psi之間的真空。
21. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該分離毛細(xì)管具有體積,并且該引入的樣品體 積小于或等于該毛細(xì)管體積。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法,其中該樣品體積是在該毛細(xì)管體積的約25%與約 100 %之間。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法,其中該引入的樣品體積是在約1 y L與25 y L之間。
24. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該樣品包含各在約0. 1 ii g/ml與10mg/ml之間 的一種或多種兩性樣品組分。
25. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該分離毛細(xì)管包括熔融硅石(Si02)毛細(xì)管。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法,其中該毛細(xì)管包括聚合涂層。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法,其中該聚合涂層是選自聚丙烯酰胺(LPA)、甲基纖維 素、聚乙烯醇(PVA)以及其組合。
28. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括選自Amph〇lineTM、Bi〇lyt eTM、 Pharmalyte?、Servalyt?以及其組合的載體兩性電解質(zhì)(CA)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括介于約1%與約10%之間的 Pharmalyte?。
30. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括窄pH范圍的載體兩性電解 質(zhì)。
31. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括寬pH范圍的載體兩性電解 質(zhì)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括選自PharmalyteTM(l-3)、 Pharmalyte?(5-8)以及 Pharmalyte?(3-10)的 Pharmalyte?。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括介于約2%與約8%之間的 Pharmalyte? (3-10)溶液。
34. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法,進(jìn)一步包括在將該樣品引入到該分離毛細(xì)管中之前 降解該樣品中的一種或多種組分的步驟。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是用蛋白水解酶降 解的。
36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中該蛋白水解酶是選自絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋 白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、谷氨酸蛋白酶以及其組合。
37. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是用胰蛋白酶降解 的。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法,其中該胰蛋白酶被固定在固體支撐物上。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法,其中該固體支撐物是選自聚合物粒子、玻璃、膜、凝 膠珠粒、溶膠-凝膠支撐物、多孔硅基體、多孔整體材料、磁性材料以及其組合。
40. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是在介于約35°C與 約40°C之間的溫度下降解的。
41. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品與 該蛋白水解酶一起孵育歷時(shí)在約5小時(shí)與約20小時(shí)之間來(lái)降解的。
42. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品與 該蛋白水解酶一起孵育歷時(shí)在約10小時(shí)與約15小時(shí)之間來(lái)降解的。
43. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品與 蛋白水解酶一起孵育至少約12小時(shí)來(lái)降解的。
44. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法,其中該樣品在降解之后用水稀釋,與載體兩性電解 質(zhì)組合并且被引入到該分離腔室中。
45. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法,其中該樣品以在約2:1與1:2之間的水與樣品比率 用水稀釋。
46. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中電離儀器包括電噴霧電離(ESI)儀器。
47. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品包括異質(zhì)的生物分子混合物。
48. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品包括重組蛋白耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物。
49. 根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法,其中一種或多種組分包括宿主細(xì)胞蛋白。
50. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中該樣品包括重組單克隆抗體耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物。
51. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法,其中一種或多種組分包括宿主細(xì)胞蛋白。
52. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其中一種或多種組分包括蛋白質(zhì)并且該方法包括在 將樣品引入到該分離腔室中之前將該樣品中的蛋白質(zhì)變性。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括熱變性。
54. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品溶液與 非離子表面活性劑一起孵育。
55. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與堿組 合以形成pH在約8與約10之間的堿性溶液。
56. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與酸一 起孵育以形成pH在約2與約3之間的酸性溶液。
57. 根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法,其中熱變性包括將該樣品在介于約60°C與約80°C之 間的高溫下孵育至少約5分鐘。
58. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法,其中將該樣品中的這些蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與 包括碳酸氫銨的變性溶液一起孵育。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法,其中該變性溶液進(jìn)一步包括尿素。
60. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法,其中該方法進(jìn)一步包括將該樣品與還原和烷基化溶 液一起孵育。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法,其中該還原溶液是選自包括二硫蘇糖醇(DTT)、三 (2-羧乙基)膦(TCEP)、三丁基膦(TBP)以及其組合的溶液。
62. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法,其中該烷基化溶液包括碘乙酰胺(IAA)、P-巰基乙 醇或其組合。
63. 用于將毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)和質(zhì)譜(MS)接口連接的系統(tǒng),包括: a. cIEF儀器,包括用于將液體樣品中的一種或多種組分分離并聚焦的分離腔室; b. 電壓電源,用于將電位施加在該分離腔室兩端,其中該分離腔室包含樣品和載體兩 性電解質(zhì)并且該電位將該樣品中的一種或多種組分分離并聚焦; c. 鞘流溶液,用于將一種或多種已分離并聚焦的組分從該cIEF儀器的該分離腔室直 接轉(zhuǎn)移到發(fā)射器,該發(fā)射器被配置成將該溶液供應(yīng)到電噴霧電離(ESI)儀器,其中該鞘流 溶液包含在約30%與約50%之間的極性有機(jī)溶劑和在約0.01%與0. 1%之間的有機(jī)酸;以 及 d. MS儀器,用于分析樣品分析物。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的系統(tǒng),其中該極性有機(jī)溶劑是選自極性質(zhì)子溶劑和極性非 質(zhì)子溶劑。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的系統(tǒng),其中該極性質(zhì)子溶劑包括脂肪醇。
66. 根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng),其中該脂肪醇是選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇 以及其組合。
67. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的系統(tǒng),其中該極性非質(zhì)子溶劑包括乙腈。
68. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的系統(tǒng),其中該有機(jī)酸是選自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸 以及其組合。
69. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的系統(tǒng),其中該有機(jī)酸的pKa在約4. 0與5. 0之間。
70. 根據(jù)權(quán)利要求65所述的系統(tǒng),其中該脂肪醇是甲醇并且該有機(jī)酸是甲酸。
71. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的系統(tǒng),其中該cIEF儀器包括陽(yáng)極、陰極、陽(yáng)極電解質(zhì)儲(chǔ)槽以 及陰極電解質(zhì)儲(chǔ)槽。
72. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的系統(tǒng),其中該陽(yáng)極電解質(zhì)儲(chǔ)槽包含了包括酸的陽(yáng)極電解 質(zhì)。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的系統(tǒng),其中該陽(yáng)極電解質(zhì)包括磷酸、甲酸、天冬氨酸或其組 合。
74. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的系統(tǒng),其中該陰極電解質(zhì)儲(chǔ)槽包含了包括一種堿的陰極電 解質(zhì)。
75. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的系統(tǒng),其中該堿是選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸 鉀以及其組合。
76. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的系統(tǒng),包括將該鞘流溶液引入到該陽(yáng)極電解質(zhì)和/或陰極 電解質(zhì)儲(chǔ)槽中以動(dòng)員這些聚焦的樣品組分。
77. 根據(jù)權(quán)利要求71所述的系統(tǒng),包括被配置成將該分離腔室的一端與該發(fā)射器偶聯(lián) 的接口偶聯(lián)裝置。
78. 根據(jù)權(quán)利要求77所述的系統(tǒng),其中該分離腔室包括具有陽(yáng)極端的毛細(xì)管,其中在 將該樣品中的一種或多種組分聚焦之后將該毛細(xì)管的該陽(yáng)極端插入到該發(fā)射器的輸入端 中以動(dòng)員這些聚焦的組分。
79. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的系統(tǒng),其中該鞘流溶液被引入到該陰極電解質(zhì)儲(chǔ)槽中。
80. 根據(jù)權(quán)利要求77所述的系統(tǒng),其中該分離腔室包括具有陰極端的毛細(xì)管,其中在 將該樣品中的一種或多種組分聚焦之后將該毛細(xì)管的該陰極端插入到該發(fā)射器的輸入端 中以動(dòng)員這些聚焦的組分。
81. 根據(jù)權(quán)利要求80所述的系統(tǒng),其中該鞘流溶液被引入到該陽(yáng)極電解質(zhì)儲(chǔ)槽中。
82. 用于鑒別耗乏的細(xì)胞培養(yǎng)物樣品中的宿主細(xì)胞蛋白(HCP)組分的方法,該方法包 括: a.通過(guò)毛細(xì)管等電聚焦(cIEF)分離該樣品中的一種或多種HCP組分,其中將該樣品和 兩性電解質(zhì)緩沖液引入到分離腔室中并且在外加電壓下聚焦這一種或多種HCP組分,該分 離腔室包括熔融硅石毛細(xì)管并具有入口端和出口端; b. 將該分離腔室的該出口端與電噴霧電離(ESI)儀器的入口端偶聯(lián); c. 通過(guò)將鞘流溶液引入到該分離腔室的該入口端中來(lái)將這些分離的HCP組分從該分 離腔室轉(zhuǎn)移到該ESI儀器的發(fā)射器,該鞘流溶液包含在約30%與約50%之間的極性有機(jī)溶 劑和在約0. 01 %與0. 1 %之間的有機(jī)酸,其中該鞘流溶液既充當(dāng)用于該分離腔室的動(dòng)員溶 液又充當(dāng)用于該電離儀器的電離溶液; d. 將這些樣品組分電離;并且 e. 通過(guò)質(zhì)譜(MS)鑒別并分析該樣品中的一種或多種組分。
83. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該極性有機(jī)溶劑是選自極性質(zhì)子溶劑和極性非 質(zhì)子溶劑。
84. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該極性質(zhì)子溶劑包括脂肪醇。
85. 根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法,其中該脂肪醇是選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、異丙醇 以及其組合。
86. 根據(jù)權(quán)利要求83所述的方法,其中該極性非質(zhì)子溶劑包括乙腈。
87. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該有機(jī)酸是選自甲酸、醋酸、乙酸、丙酸、苯甲酸 以及其組合。
88. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該有機(jī)酸的pKa在約4. 0與5. 0之間。
89. 根據(jù)權(quán)利要求84所述的方法,其中該脂肪醇是甲醇并且該有機(jī)酸是甲酸。
90. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中分離包括在高達(dá)約50kV的聚焦電壓下在該分離 毛細(xì)管中聚焦該樣品和該兩性電解質(zhì)緩沖液。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的方法,其中該聚焦電壓是在約5kV與約30kV之間。
92. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該樣品在介于約300V/cm與約600V/cm之間的 外加電場(chǎng)下聚焦。
93. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的方法,其中該外加電場(chǎng)是在約300V/cm與約400V/cm之間。
94. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該樣品在高達(dá)約50kV的動(dòng)員電壓下轉(zhuǎn)移到該電 離儀器。
95. 根據(jù)權(quán)利要求94所述的方法,其中該動(dòng)員電壓是在約5kV與約40kV之間。
96. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該樣品在介于約300V/cm與約600V/cm之間的 外加電場(chǎng)下轉(zhuǎn)移到該電離儀器。
97. 根據(jù)權(quán)利要求96所述的方法,其中該外加電場(chǎng)是在約300V/cm與約350V/cm之間。
98. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該樣品通過(guò)水動(dòng)力注射轉(zhuǎn)移到該電離儀器。
99. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法,其中水動(dòng)力注射包括在該分離腔室的入口處使用注 射器施加介于約〇? 5psi與約50psi之間的壓力。
100. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法,其中水動(dòng)力注射包括在該分離腔室的出口處施加 介于約0. 5psi與約50psi之間的真空。
101. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該分離毛細(xì)管具有體積,并且該引入的樣品體 積小于或等于該毛細(xì)管體積。
102. 根據(jù)權(quán)利要求101所述的方法,其中該樣品體積是在該毛細(xì)管體積的約25%與約 100%之間。
103. 根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法,其中該引入的樣品體積是在約1 y L與25 y L之 間。
104. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該樣品包含各在約0. 1 ii g/ml與10mg/ml之間 的一種或多種兩性樣品組分。
105. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該毛細(xì)管包括聚合涂層。
106. 根據(jù)權(quán)利要求105所述的方法,其中該聚合涂層是選自聚丙烯酰胺(LPA)、甲基纖 維素、聚乙烯醇(PVA)以及其組合。
107. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括選自Ampholine?、 Biolyte?、PharmalyteTM、Servalyt?以及其組合的載體兩性電解質(zhì)(CA)。
108. 根據(jù)權(quán)利要求107所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括介于約1%與約10%之間 的 Pharmalyte?。
109. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括窄pH范圍的載體兩性電解 質(zhì)。
110. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括寬pH范圍的載體兩性電解 質(zhì)。
111. 根據(jù)權(quán)利要求108所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括選自PharmalyteTM(l-3)、 Pharmalyte?(5-8)以及 Pharmalyte?(3-10)的 Pharmalyte?。
112. 根據(jù)權(quán)利要求111所述的方法,其中該兩性電解質(zhì)包括介于約2%與約8%之間的 Pharmalyte? (3-10)溶液。
113. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,進(jìn)一步包括在將該樣品引入到該分離毛細(xì)管中之 前降解該樣品中的一種或多種組分的步驟。
114. 根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是用胰蛋白酶降 解的。
115. 根據(jù)權(quán)利要求114所述的方法,其中該胰蛋白酶被固定在固體支撐物上。
116. 根據(jù)權(quán)利要求115所述的方法,其中該固體支撐物是選自聚合物粒子、玻璃、膜、 凝膠珠粒、溶膠-凝膠支撐物、多孔硅基體、多孔整體材料、磁性材料以及其組合。
117. 根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是在介于約35°C 與約40°C之間的溫度下降解的。
118. 根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)用該蛋白 水解酶將該樣品孵育持續(xù)在約5小時(shí)與約20小時(shí)之間來(lái)降解的。
119. 根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品 與該蛋白水解酶一起孵育歷時(shí)在約10小時(shí)與約15小時(shí)之間來(lái)降解的。
120. 根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法,其中該樣品中的一種或多種組分是通過(guò)將該樣品 與蛋白水解酶一起孵育至少約12小時(shí)來(lái)降解的。
121. 根據(jù)權(quán)利要求113所述的方法,其中該樣品在降解之后用水稀釋,與一種載體兩 性電解質(zhì)組合并且被引入到該分離腔室中。
122. 根據(jù)權(quán)利要求121所述的方法,其中該樣品以在約2:1與1:2之間的水與樣品比 率稀釋。
123. 根據(jù)權(quán)利要求82所述的方法,其中一種或多種組分包括蛋白質(zhì)并且該方法包括 在將樣品引入到該分離腔室中之前將該樣品中的蛋白質(zhì)變性。
124. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括熱變性。
125. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品溶液 與非離子表面活性劑一起孵育。
126. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與堿 組合以形成pH在約8與約10之間的堿性溶液。
127. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法,其中將該樣品中的蛋白質(zhì)變性包括將該樣品與酸 一起孵育以形成pH在約2與約3之間的酸性溶液。
128. 根據(jù)權(quán)利要求124所述的方法,其中熱變性包括將該樣品在介于約60°C與約80°C 之間的高溫下孵育至少約5分鐘。
129. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法,其中將該樣品中的這些蛋白質(zhì)變性包括將該樣品 與包括碳酸氫銨的變性溶液一起孵育。
130. 根據(jù)權(quán)利要求129所述的方法,其中該變性溶液進(jìn)一步包括尿素。
131. 根據(jù)權(quán)利要求123所述的方法,其中該方法進(jìn)一步包括將該樣品與還原和烷基化 溶液一起孵育。
132. 根據(jù)權(quán)利要求131所述的方法,其中該還原溶液是選自包括二硫蘇糖醇(DTT)、三 (2-羧乙基)膦(TCEP)、三丁基膦(TBP)以及其組合的溶液。
133. 根據(jù)權(quán)利要求131所述的方法,其中該烷基化溶液包括碘乙酰胺(IAA)、甲烷硫代 磺酸甲酯(MMTS)、¢-巰基乙醇或其組合。
【文檔編號(hào)】B01D59/50GK104411383SQ201380033940
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月3日
【發(fā)明者】J·麥吉夫尼, 朱貴杰, N·多維奇 申請(qǐng)人:米迪繆尼有限公司, 圣母大學(xué)
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