一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法。本發(fā)明以克倫特羅為檢測(cè)目標(biāo)，建立了結(jié)合96孔板酶聯(lián)免疫反應(yīng)與絲網(wǎng)印刷電極快速檢測(cè)的方法，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中的克侖特羅含量。本發(fā)明方法可以快速準(zhǔn)確測(cè)定動(dòng)物源性樣品中克倫特羅的殘留量，靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單易行，滿足對(duì)克侖特羅進(jìn)行快速高通量篩選的要求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)分析及電化學(xué)免疫分析【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于絲網(wǎng)印刷電極在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]克侖特羅(Clenbuterol)俗稱(chēng)瘦肉精，屬于β -興奮劑，近年來(lái)被非法添加到飼料中以促進(jìn)動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)和提高瘦肉率，因其添加劑量是治療劑量的5-10倍，并且在動(dòng)物體內(nèi)殘留量過(guò)高而給消費(fèi)者帶來(lái)危害，所以食品中克侖特羅的檢測(cè)尤為重要。目前克侖特羅檢測(cè)方法主要有色譜法和免疫分析法。色譜法中主要以高效液相色譜法為主，因其具有靈敏、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，可以作為實(shí)驗(yàn)室確證的方法。但儀器成本高，不適合樣品初篩和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。免疫分析法主要包括膠體金試紙法和酶聯(lián)免疫吸附法。膠體金試紙法具有測(cè)定簡(jiǎn)單、快速，成本低等特點(diǎn)，但難于準(zhǔn)確定量，只能作為定性的判斷。酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏度高、可定量檢測(cè)，適合樣品快速篩選分析。但目前酶聯(lián)免疫檢測(cè)中采用的儀器大都是光學(xué)酶標(biāo)儀，其體積較大，一般不適宜攜帶進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。
[0003]電化學(xué)分析方法具有靈敏度高、儀器易于小型化、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，獲得了廣泛的關(guān)注。電化學(xué)分析中計(jì)時(shí)電流方法已在商業(yè)產(chǎn)品中得到成功應(yīng)用。例如，基于計(jì)時(shí)電流法的電化學(xué)酶?jìng)鞲衅饕呀?jīng)成功用于便攜式血糖儀的研制，具有操作方法簡(jiǎn)單、成本低。在此基礎(chǔ)上，近年來(lái)電化學(xué)免疫分析方法也獲得了廣泛關(guān)注。電化學(xué)免疫的方法就是將電化學(xué)分析檢測(cè)與免疫學(xué)特異性分析方法的特點(diǎn)相結(jié)合起來(lái)的生物傳感檢測(cè)方法，以電化學(xué)原理實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫反應(yīng)形成的抗原-抗體復(fù)合物的特異性檢測(cè)。
[0004]絲網(wǎng)印刷電極(Screen printed electrode, SPE)具有制備簡(jiǎn)單、易于批量生產(chǎn)、低成本、便攜和一次性使用等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)電化學(xué)分析方法相比，絲網(wǎng)印刷電極將工作電極、參比電極、輔助電極高度集成，解決了以往三電極體系分散、不易操作以及表面無(wú)法更新等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速，高靈敏度，低成本的可定量檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法，以滿足對(duì)克侖特羅進(jìn)行快速高通量篩選的要求。
[0006]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0007]—種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，該方法采用絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)多孔酶標(biāo)板試劑盒中克倫特羅的含量。其中，所述的絲網(wǎng)印刷電極采用聚丙烯塑膠紙作為基底，依次分別采用銀漿、碳漿、銀/氯化銀漿以及絕緣漿作為絲網(wǎng)印刷材料，第一層印制銀漿作為導(dǎo)電介質(zhì)，第二層印制碳作為工作電極和輔助電極，第三層印制銀/氯化銀漿作為參比電極，從而制得絲網(wǎng)印刷電極。
[0008]所述絲網(wǎng)印刷電極印制銀漿、碳漿、銀/氯化銀漿的條件為:在60_150°C條件下固化10-60min ;印制絕緣衆(zhòng)的條件為:60_150°C條件下烘干l_3h ;每層印制的厚度為10?15 μ m。
[0009]所述的銀/氯化銀漿的體積比為2:8?8:2。
[0010]所述采用絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)多孔酶標(biāo)板試劑盒中克倫特羅的含量方法包括如下步驟:
[0011](I)多孔酶標(biāo)板反應(yīng):所述的多孔酶標(biāo)板可以根據(jù)實(shí)際檢測(cè)的需要，選擇96孔或24孔酶標(biāo)板等，部分反應(yīng)孔內(nèi)加入50?200 μ L克侖特羅抗體和不同濃度的游離克侖特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在剩余反應(yīng)孔內(nèi)加入50?200 μ L克侖特羅抗體和樣品溶液，所有反應(yīng)孔20?37°C水浴反應(yīng)I?3h，然后使用洗板機(jī)洗滌3-5次，在吸水紙上拍干；在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)加入50?200 μ L HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，20?37°C水浴反應(yīng)I?3h，然后使用洗板機(jī)洗滌3-5次，在吸水紙上拍干；在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)分別加入H2O2和四甲基聯(lián)苯胺各50?100 μ L/孔，20-37°C避光顯色反應(yīng)10?30min后，加入2mol/L H2SO4, 50?100 μ L/孔，混勻，終止反應(yīng);
[0012](2)絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè):將制備的絲網(wǎng)印刷電極插入已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，采用計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)終止反應(yīng)后產(chǎn)生的電流值，其中，電壓可以選擇-1V至+1.0V,時(shí)間100s，根據(jù)不同電流值，利用外標(biāo)曲線法定量檢測(cè)樣品中克侖特羅的含量。
[0013]其中，所述樣品溶液是通過(guò)如下步驟制備的:
[0014]對(duì)于液體樣品，如動(dòng)物尿液,血清等,取50 μ L?ImL于IOmL EP管中，用0.0lmol/L pH7.4PBS緩沖液稀釋1-10倍，用于分析；
[0015]對(duì)于固體樣品，如動(dòng)物組織，取粉碎樣品l_5g，加入3_8mL體積比1:4的0.0lmol/L PBS-甲醇混合液，混合5-10min，置30_50°C水浴下放置30min，室溫3000_5000r/min離心5-10min，取50 μ L上清液，加入450 μ L PBS緩沖液混勻，取50 μ L用于分析。
[0016]所述的動(dòng)物性樣品包括尿液、組織、血清。
[0017]本發(fā)明首先通過(guò)將克侖特羅標(biāo)準(zhǔn)品或樣品和包被在酶標(biāo)板上的抗原與克侖特羅抗體發(fā)生間接免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體復(fù)合物，隨后向孔中加入HRP酶標(biāo)二抗，二抗與抗原-抗體復(fù)合物反應(yīng)，最后加入酶底物H2O2和TMB發(fā)生酶催化反應(yīng)。通過(guò)插入96孔酶標(biāo)板中的電極對(duì)酶催化產(chǎn)生TMB (οχ)還原電流值進(jìn)行計(jì)時(shí)電流檢測(cè)，根據(jù)不同的還原電流值，利用外標(biāo)曲線法定量檢測(cè)樣品中克侖特羅的含量。
[0018]有益效果:本發(fā)明建立了一種能應(yīng)用于酶聯(lián)免疫分析的電化學(xué)便攜式快速檢測(cè)方法，制備的絲網(wǎng)印刷電極具有制備簡(jiǎn)單、易于批量生產(chǎn)、低成本、便攜和一次性使用等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)電化學(xué)分析方法相比，絲網(wǎng)印刷電極將工作電極、參比電極、輔助電極高度集成，解決了以往三電極體系分散、不易操作以及表面無(wú)法更新等問(wèn)題。
[0019]本發(fā)明以克倫特羅為檢測(cè)目標(biāo)，建立了結(jié)合96孔板酶聯(lián)免疫反應(yīng)與絲網(wǎng)印刷電極快速檢測(cè)的方法，用本發(fā)明對(duì)豬肉和豬尿中克侖特羅進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致，本發(fā)明的檢測(cè)限分別為0.18 μ g/L和0.05 μ g/L，比ELISA試劑盒低一個(gè)數(shù)量級(jí)，同時(shí)遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的最大允許殘留量(MRL) I μ g/L。克侖特羅抗體的特異性較好，和酒石酸托特羅定、鹽酸環(huán)侖特羅、鹽酸氯丙那林、鹽酸妥洛特羅、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富馬酸福莫特羅、班布特羅、萊克多巴胺等9種β_興奮劑無(wú)交叉反應(yīng)。并且孔間CV值低于10%，方法精密度高。對(duì)牛豬肉和豬尿中的克侖特羅加樣回收率在80%-120%之間，方法的準(zhǔn)確度高，適于實(shí)際樣品的檢測(cè)。為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)動(dòng)物性食品中的克侖特羅的方法開(kāi)發(fā)提供了研究基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1絲網(wǎng)印刷電極印制過(guò)程，其中(5)中的1、2、3為導(dǎo)線接口。
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)驗(yàn)檢測(cè)裝置示意圖，其中包括:
[0022]1-印刷電極；2_工作電極；3_對(duì)電極；4_參比電極；5_96孔酶標(biāo)板；6_電化學(xué)工作站；7-電腦記錄與處理。
[0023]圖3為本發(fā)明檢測(cè)方法示意圖。
[0024]圖4為克侖特羅檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，克侖特羅濃度為:0.025yg/L、0.05yg/L、0.15μ g/L、0.25μ g/L、0.50 μ g/L、1.0 μ g/L、2.0 μ g/L，曲線在 0.025 ?2.0 μ g/L 范圍內(nèi)線性良好(R2=0.9985)，并且孔間CV值低于10%，方法精密度高，且豬肉和豬尿中的克侖特羅加樣回收率在80%-120%之間，方法的準(zhǔn)確度高。
[0025]圖5為克侖特羅與其各種類(lèi)似物質(zhì)的交叉反應(yīng)率，其中:
[0026]A:克侖特羅B:鹽酸環(huán)侖特羅C:沙丁胺醇D:鹽酸妥洛特羅E:硫酸特布他林F:酒石酸托特羅定G:富馬酸福莫特羅H:班布特羅J:鹽酸氯丙那林K:萊克多巴胺
【具體實(shí)施方式】
[0027]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明，使本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，但實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0028]以下實(shí)施例所需試劑及其來(lái)源如下:
[0029]克侖特羅抗原標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)；克侖特羅包被抗原和抗體、克侖特羅ELISA檢測(cè)試劑盒(南京祥中生物科技有限公司);HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG (北京博奧森生物公司)；3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(生工生物)；過(guò)氧化氫尿素(CO(NH2).H2O2)(天津希恩思生物公司)；硫酸、甲醇、濃鹽酸、氯化鈉(分析純)(南京化學(xué)試劑公司)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水(電阻率> 18.3ΜΩ.cm);豬肉(購(gòu)自南京某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng))；豬尿(取自南京某養(yǎng)豬廠)；絲網(wǎng)印刷電極(工作電極和輔助電極為碳漿印制，參比電極為銀/氯化銀漿印制，南京祥中生物科技有限公司)。實(shí)施例1:一種基于絲網(wǎng)印刷電極的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)克侖特羅的方法。
[0030](I)檢測(cè)樣品處理:
[0031]PBS緩沖液的配制:用137mmol/L氯化鈉、2.7mmol/L氯化鉀、10mmol/L磷酸二氫鈉、2mmol/L磷酸二氫鉀配制ρΗ7.4的PBS緩沖液。
[0032]對(duì)豬尿樣品，取50μ L?ImL于IOmL EP管中，用PBS緩沖液稀釋1_10倍，用于分析；
[0033]對(duì)豬肉樣品，取粉碎樣品lg，加入3mL體積比4:1的PBS-甲醇混合液，混合5min，置30°C水浴下放置30min，室溫3000r/min離心5min，取50 μ L上清液，加入450 μ L PBS緩沖液混勻，取50 μ L用于分析；
[0034](2)絲網(wǎng)印刷電極制備[0035]絲網(wǎng)印刷電極A:采用聚丙烯塑膠紙印刷絲網(wǎng)電極，每支電極尺寸規(guī)格:
0.4mm X 7mm X 30mm?；赘鶕?jù)自行設(shè)計(jì)的電極結(jié)構(gòu)圖(如圖1),第一層(圖1 (I))印制銀衆(zhòng)作為導(dǎo)電介質(zhì)，第二層(圖1⑵)印制碳作為工作電極和輔助電極，第三層(圖1⑶)印制銀/氯化銀漿，銀/氯化銀漿的體積比為2:8，作為參比電極。最后印制絕緣漿作為絕緣層(圖1(4))，通過(guò)各層漿料的疊加，制得絲網(wǎng)印刷電極(圖1(4))，每層印制的厚度為ΙΟμπι。
[0036]絲網(wǎng)印刷電極B:方法同絲網(wǎng)印刷電極A的制備，不同的是，銀/氯化銀漿的體積比為4:6,每層印制的厚度為12 μ m。
[0037]絲網(wǎng)印刷電極C:方法同絲網(wǎng)印刷電極A的制備，不同的是，銀/氯化銀漿的體積比為5:5，每層印制的厚度為15μπι。
[0038]絲網(wǎng)印刷電極D:方法同絲網(wǎng)印刷電極A的制備，不同的是，銀/氯化銀漿的體積比為6:4,每層印制的厚度為13 μ m。
[0039]絲網(wǎng)印刷電極E:方法同絲網(wǎng)印刷電極A的制備，不同的是，銀/氯化銀漿的體積比為8:2,每層印制的厚度為12μηι。
[0040](3)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)
[0041]在部分反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μ L克侖特羅抗體和不同濃度的游離克侖特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在剩余反應(yīng)孔內(nèi)加入100μ L克侖特羅抗體和樣品溶液(豬肉和豬尿樣品溶液),所有反應(yīng)孔37°C水浴反應(yīng)lh，然后使用洗板機(jī)洗滌3次，在吸水紙上排干。
[0042]在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)加入100 μ L HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C水浴反應(yīng)lh，然后使用洗板機(jī)洗滌3次，在吸水紙上排干。
[0043]在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)分別加入A液(H2O2,過(guò)氧化氫)和B液(TMB，四甲基聯(lián)苯胺)各50 μ L/孔，37°C避光顯色反應(yīng)15min后，加入2mol/L H2SO4, 50 μ L/孔，混勻，終止反應(yīng)；
[0044]將(2)中制備的絲網(wǎng)印刷電極C插入已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，采用計(jì)時(shí)電流法(電壓:-0.1V ;時(shí)間:100s)檢測(cè)終止反應(yīng)后產(chǎn)生TMB (ox)(四甲基聯(lián)苯胺的氧化物:4，4' -二(3，5_ 二甲基-4-氨基)-2，2'，6’6,-四甲基苯)的還原電流值。根據(jù)不同的還原電流值，利用外標(biāo)曲線法定量檢測(cè)樣品中克倫特羅的含量。
[0045]本實(shí)施例方法中，對(duì)方法檢測(cè)線、精密度等進(jìn)行了考察。數(shù)據(jù)見(jiàn)圖4。通過(guò)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品，從圖4中可以看出，本發(fā)明的檢測(cè)限分別為0.025 μ g/L,比ELISA試劑盒(檢測(cè)限為
0.05 μ g/L)檢測(cè)限低，同時(shí)遠(yuǎn)低于國(guó)家規(guī)定的最大允許殘留量(MRL) I μ g/L,并且孔間CV值低于10%，方法精密度高。對(duì)牛豬肉和豬尿中的克侖特羅加樣回收率在80%-120%之間，方法的準(zhǔn)確度高，適于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0046]實(shí)施例2: —種基于絲網(wǎng)印刷電極的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)克侖特羅的方法。
[0047]在本實(shí)施例中，檢測(cè)樣品的處理及絲網(wǎng)印刷電極制備的方法同實(shí)施例1，不同的是，本實(shí)施例中間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)的步驟如下:
[0048](I)在部分反應(yīng)孔內(nèi)加入200 μ L克侖特羅抗體和不同濃度的游離克侖特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在剩余反應(yīng)孔內(nèi)加入200 μ L克侖特羅抗體和樣品溶液(豬肉和豬尿樣品溶液)，所有反應(yīng)孔37°C水浴反應(yīng)lh，然后使用洗板機(jī)洗滌5次，在吸水紙上排干。
[0049](2)在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)加入200 μ L HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C水浴反應(yīng)lh，然后使用洗板機(jī)洗滌5次，在吸水紙上排干。
[0050](3)在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)分別加入A液(H2O2,過(guò)氧化氫)和B液(TMB，四甲基聯(lián)苯胺)各100 μ L/孔，37°C避光顯色反應(yīng)IOmin后，加入2mol/L H2SO4, 50 μ L/孔，混勻，終止反應(yīng)；
[0051](4)將實(shí)施例1中制備的絲網(wǎng)印刷電極B插入已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，采用計(jì)時(shí)電流法(電壓:- ο.1V ;時(shí)間:100s)檢測(cè)終止反應(yīng)后產(chǎn)生TMB (OX)的還原電流值。根據(jù)不同的還原電流值，利用外標(biāo)曲線法定量檢測(cè)樣品中克倫特羅的含量。
[0052]實(shí)施例3: —種基于絲網(wǎng)印刷電極的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)克侖特羅的方法。
[0053]在本實(shí)施例中，檢測(cè)樣品的處理及絲網(wǎng)印刷電極制備的方法同實(shí)施例1，不同的是，本實(shí)施例中間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)的步驟如下:
[0054](I)在部分反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μ L克侖特羅抗體和不同濃度的游離克侖特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在剩余反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μ L克侖特羅抗體和樣品溶液(豬肉和豬尿樣品溶液)，所有反應(yīng)孔37°C水浴反應(yīng)3h，然后使用洗板機(jī)洗滌5次，在吸水紙上排干。
[0055](2)在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)加入50 μ L HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C水浴反應(yīng)3h，然后使用洗板機(jī)洗滌5次，在吸水紙上排干。
[0056](3)在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)分別加入A液(H2O2,過(guò)氧化氫)和B液(TMB，四甲基聯(lián)苯胺)各50 μ L/孔，37°C避光顯色反應(yīng)IOmin后，加入2mol/L H2SO4, 50 μ L/孔，混勻，終止反應(yīng)；
[0057](4)將實(shí)施例1中制備的絲網(wǎng)印刷電極D插入已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，采用計(jì)時(shí)電流法(電壓:- ο.1V ;時(shí)間:100s)檢測(cè)終止反應(yīng)后產(chǎn)生TMB (OX)的還原電流值。根據(jù)不同的還原電流值，利用外標(biāo)曲線法定量檢測(cè)樣品中克倫特羅的含量。
[0058]上述實(shí)施例結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬尿和豬肉樣品加樣回收率在80%_120%之間，方法準(zhǔn)確度高，適于實(shí)際樣品的檢測(cè)。
[0059]實(shí)施例4:克侖特羅抗體特異性檢測(cè)。
[0060]將酒石酸托特羅定、鹽酸環(huán)侖特羅、鹽酸氯丙那林、鹽酸妥洛特羅、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富馬酸福莫特羅、班布特羅、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 μ g/L，分別與克侖特羅抗體競(jìng)爭(zhēng)包被的克侖特羅抗原，同時(shí)與克侖特羅空白樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，得到各物質(zhì)的交叉反應(yīng)率?？藖鎏亓_與其各種類(lèi)似物質(zhì)的交叉反應(yīng)率的結(jié)果如圖5所示?？藖鎏亓_抗體的特異性較好，和酒石酸托特羅定、鹽酸環(huán)侖特羅、鹽酸氯丙那林、鹽酸妥洛特羅、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富馬酸福莫特羅、班布特羅、萊克多巴胺等9種β-興奮劑無(wú)交叉反應(yīng)，并且孔間CV值低于10%，方法精密度高。
【權(quán)利要求】
1.一種現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，該方法采用絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè)多孔酶標(biāo)板試劑盒中克倫特羅的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，所述的絲網(wǎng)印刷電極采用聚丙烯塑膠紙作為基底，依次分別采用銀漿、碳漿、銀/氯化銀漿以及絕緣漿作為絲網(wǎng)印刷材料，制得絲網(wǎng)印刷電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，所述絲網(wǎng)印刷電極印制銀漿、碳漿、銀/氯化銀漿的條件為:在60-150°C條件下固化10-60min ;印制絕緣衆(zhòng)的條件為:60-150°C條件下烘干l_3h ;每層印制的厚度為10?15 μ m。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，所述的銀/氯化銀漿的體積比為2:8?8:2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)多孔酶標(biāo)板反應(yīng):部分反應(yīng)孔內(nèi)加入50?200μ L克侖特羅抗體和不同濃度的游離克侖特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在剩余反應(yīng)孔內(nèi)加入50?200 μ L克侖特羅抗體和樣品溶液，所有反應(yīng)孔20?37°C水浴反應(yīng)I?3h，然后使用洗板機(jī)洗滌3-5次，在吸水紙上拍干；在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)加入50?200 μ L HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，20?37°C水浴反應(yīng)I?3h，然后使用洗板機(jī)洗滌3-5次，在吸水紙上拍干；在每個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)分別加入H2O2和四甲基聯(lián)苯胺各50?100 μ L/ 孔，20-37°C避光顯色反應(yīng) 10 ?30min 后，加入 2mol/L H2SO4, 50 ?100 μ L/ 孔，混勻，終止反應(yīng)； (2)絲網(wǎng)印刷電極檢測(cè):將制備的絲網(wǎng)印刷電極插入已終止反應(yīng)的酶標(biāo)板微孔中，采用計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)終止反應(yīng)后產(chǎn)生的電流值，其中，電壓可以選擇-1V至+1.0V，時(shí)間100s，根據(jù)不同電流值，利用外標(biāo)曲線法定量檢測(cè)樣品中克侖特羅的含量。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，所述樣品溶液是通過(guò)如下步驟制備的: 對(duì)于液體樣品，取50 μ L?ImL于IOmL EP管中，用0.01mol/L pH7.4PBS緩沖液稀釋1-10倍，用于分析； 對(duì)于固體樣品，取粉碎樣品l_5g，加入3-8mL體積比1:4的0.01mol/L PBS-甲醇混合液，混合5-10min，置30-50°C水浴下放置30min，室溫3000_5000r/min離心5_10min，取50 μ L上清液，加入450 μ L PBS緩沖液混勻，取50 μ L用于分析。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)動(dòng)物源性樣品中克侖特羅含量的方法，其特征在于，所述的動(dòng)物性樣品包括尿液、組織、血清。
【文檔編號(hào)】G01N27/26GK103529199SQ201310530612
【公開(kāi)日】2014年1月22日 申請(qǐng)日期:2013年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月31日
【發(fā)明者】梁樺, 李周敏, 張立柱 申請(qǐng)人:南京祥中生物科技有限公司