用于生物樣品的組織加工的溶液的制作方法
【專利摘要】本申請公開的制劑、系統(tǒng)和方法允許自動制備用于檢查的試樣(例如，生物試樣)。所述公開的制劑、系統(tǒng)和方法提供了使用最少數(shù)量的流體進(jìn)行快速、有效和高度均勻的試樣加工。所述方法至少包括將試樣固定至基底如顯微鏡載玻片的固定階段、用于染色試樣的染色階段和用于漂洗試樣的漂洗階段。所述固定、染色和漂洗階段中的一個或者多個包括一個或者多個攪動階段，用于在試樣中均勻地和一致地分配試劑。所述系統(tǒng)可作為獨(dú)立的設(shè)備或者作為較大系統(tǒng)中的一個構(gòu)件使用，用于制備和檢查試樣。
【專利說明】用于生物樣品的組織加工的溶液
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年6月17日提交的美國臨時申請61/498，159,2011年7月6日提交的美國臨時申請61/505，011和2011年7月21日提交的美國臨時申請61/510，180的權(quán)益；將前面提交的每個申請的全部內(nèi)容并入本申請作為參考。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003]本公開涉及用于制備生物試樣的制劑，并且更具體地，涉及固定、染色和漂洗制劑。
【背景技術(shù)】
[0004]多年來，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)已經(jīng)使用染料和染色劑如在Romanowsky染色中使用的那些來制備生物試樣，以改善在檢查期間試樣的對比。這種檢查通常使用顯微鏡(一種捕捉試樣圖像的自動設(shè)備)，或者在其它情況中，使用肉眼目視檢查。制備用于檢查的試樣的數(shù)種不同的系統(tǒng)和方法是已知的。例如，美國專利6，096，271 ;7，318，913 ;5，419，279 ;和5，948，360，以及公布的美國專利申請2008/0102006和2006/0073074涉及在試樣加工期間用于染色基底的機(jī)器和方法。這些公開提供了染色和制備用于檢查的試樣的許多細(xì)節(jié)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本公開涉及制備用于檢查的試樣的制劑、系統(tǒng)和方法。所述試樣可包括，例如，來自生物樣品的包含紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的血液樣品，例如，施用至基底如顯微鏡載玻片或者蓋玻片的血液樣品。可使用不同實(shí)施方案制備來自生物樣品的試樣，所述生物樣品包括骨髓、尿、陰道組織、上皮組織、腫瘤、精液、唾液和其它體液。本公開的另外的方面包括使用本公開的制劑固定、染色、漂洗和攪動試樣的系統(tǒng)和方法。通常，本申請公開的制劑、系統(tǒng)和方法使用最少的流體量提供快速、有效和高度均勻的試樣制備和加工。所述方法包括一個或者多個固定、染色和漂洗階段，在一個或者多個固定、染色和漂洗階段后，例如，在每個固定、染色和漂洗階段后，包括一個或者多個攪動階段。所述系統(tǒng)可作為獨(dú)立的設(shè)備或者作為較大系統(tǒng)中的構(gòu)件用于制備和檢查試樣。
[0006]在第一方面，本公開的特征在于細(xì)胞學(xué)固定溶液，其包含天青B;表面活性劑；甲
醇；和乙二醇。
[0007]例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.5g/L至約5.0g/L天青B ;約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約5mL/L至約50mL/L乙二醇、丙二醇或者聚丙二醇；約0.lg/L至約10g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0008]作為另一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.8g/L至約1.2g/L天青B ;約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約9mL/L至約llmL/L乙二醇；約0.25g/L至約0.38g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0009]例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約lmL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L乙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0010]作為另一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L丙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0011]作為又一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B;約1.5mL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L聚丙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0012]在第二方面，本公開的特征在于第一細(xì)胞學(xué)染色溶液，其包含曙紅Y ;緩沖劑；表面活性劑；氯化鈉；乙二醇；和水。
[0013]例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L至約5.0g/L曙紅Y ;約5禮至約250mMbis-tris或者磷酸鹽緩沖劑；約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約lg/L至約20g/L氯
化鈉；約5mL/L至約50mL/L乙二醇；約0.2ppm至約50ppm ProClin 300*；乙酸;和水，其
中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0014]作為另一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.6g/L至約0.9g/L曙紅Y ;約45mM至約55mM bis-tris緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約3g/L至約5g/L氯
化鈉；約9mL/L至約llmL/L乙二醇；約IOppm至約20ppm ProCIin 300?；乙酸;和水，其中
所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0015]例如，第一細(xì)胞 學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM bis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約4g/L氯化鈉；約I OmL/L乙二醇；約15ppm ProClin 300' ；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0016]作為另一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y j^50mMbis-tris緩沖劑；約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約68/1 氯化鈉 j^]20mL/L 乙二醇；約 15ppm p「0Clin 300';乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0017]作為又一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM磷酸鹽緩沖劑;約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約4g/L氯化鈉;約50mL/L乙二醇;約15ppmProClin 300?；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0018]在第三方面，本公開的特征在于第二細(xì)胞學(xué)染色溶液，其包含天青B ;亞甲藍(lán)；緩沖劑；表面活性劑、氯化鈉和水。
[0019]例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.25至約2.5g/L天青B ;約0.25g/L至約2.5g/L 亞甲藍(lán)；約 5mM 至約 250mM bis-tris 或者 HEPES 緩沖劑；約 0.5mL/L 至約 2.0mL/L
聚山梨酯20、約lg/L至約20g/L氯化鈉和約0.2ppm至約50ppm ProCIin 300..；乙酸；和
水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0020]作為另一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.4至約0.6g/L天青B ;約0.4g/L至約0.5g/L亞甲藍(lán)；約45mM至約55mM bis-tris緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨
酯20、約1.8g/L至約2.2g/L氯化鈉和約IOppm至約20ppm ProClin 300?；乙酸；和水，其
中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0021]例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mMbis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約15ppm Prodin 300 ；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0022]作為另一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mM HEPES緩沖劑;約0.5mL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約15ppmProClin 300?；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0023]作為又一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mM HEPES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約lg/L氯化鈉和約15ppm ProClin 300?；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0024]在第四方面，本公開的特征在于用于自動試樣制備裝置的漂洗溶液，其包含聚乙二醇；緩沖劑；表面活性劑；甲醇；和水。
[0025]例如，漂洗溶液可包含約0.2g/L至約10g/L聚乙二醇；約ImM至約250mM HEPES、MES,或者bis-tris緩沖劑；約0.lmL/L至約2.40mL/L聚山梨酯20 ;約0.04ppm至約
50ppm ProC hn 300:約9mL/L至約200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6
至約7.0。
[0026]例如，漂洗溶液可包含約lg/L至約10g/L聚乙二醇；約5mM至約250mM HEPES、MES,或者bis-tris緩沖劑；約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約0.2ppm至約
50ppm ProClin 300?；約10mL/L至約200mL/L甲醇；和水,其中所述漂洗溶液的pH為約6.6
至約7.0。
[0027]作為另一實(shí)例，漂洗溶液可包含約4.5g/L至約5.5g/L聚乙二醇；約45mM至約55mM HEPES緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約IOppm至約
20ppm ProClilI 300?；約45mL/L至約55mL/L甲醇;和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6
至約7.0。
[0028]例如，漂洗溶液包含約5g/L聚乙二醇；約50mM HEPES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約15ppm ProC'lin 300 ';約5OmL/L甲醇;和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約
7.0。
[0029]作為另一實(shí)例，漂洗溶液包含約10g/L聚乙二醇；約50mM MES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約15ppm ProCIin 300?；約50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6 至約 7.0。
[0030]作為又一實(shí)例，漂洗溶液包含約10g/L聚乙二醇；約50mM bis-tris緩沖劑；約
0.5mL/L聚山梨酯20 ;約15ppm ProCliil 300?；約50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0031]例如，漂洗溶液可包含約0.2g/L至約2g/L聚乙二醇；約ImM至約50mM HEPES緩沖劑；約 0.16mL/L 至約 0.24mL/L 聚山梨酯 20 ;約 0.04ppm 至約 IOppm ProClin 300?；約
9mL/L至約llmL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0032]作為另一實(shí)例，漂洗溶液可包含約0.9g/L至約1.lg/L聚乙二醇；約9禮至約IlmM
HEPES 緩沖劑;約0.16mL/L 至約 0.24mL/L聚山梨酯 20 j^2ppm至約 IOppm ProClill 300?;約9mL/L至約llmL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0033]在又一實(shí)例中，漂洗溶液包含約lg/L聚乙二醇；約IOmM HEPES緩沖劑；約0.2mL/
L聚山梨酯20 ；^3ppm ProClin 30(f；約10mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約
6.6 至約 7.0。
[0034]在第五方面，本公開的特征在于試樣制備試劑盒，其包含細(xì)胞學(xué)固定溶液；第一細(xì)胞學(xué)染色溶液；第二細(xì)胞學(xué)染色溶液；和漂洗溶液。在一些實(shí)施方案中，所述試樣制備試劑盒包含單獨(dú)包裝的細(xì)胞學(xué)固定溶液；單獨(dú)包裝的第一細(xì)胞學(xué)染色溶液；單獨(dú)包裝的第二細(xì)胞學(xué)染色溶液；和單獨(dú)包裝的漂洗溶液。
[0035]在第六方面，本公開的特征在于在用于檢查的基底上制備試樣的方法，其包括(a)相對于表面定位基底，使得試樣面對表面，使得定位基底以在表面和至少一部分基底之間形成至少約100微米的間隔；(b)實(shí)施固定階段，其包括(i)以足以使試樣和表面接觸的量，將固定溶液分配至基底和表面之間的間隔中；(ii)實(shí)施至少第一攪動階段，其中所述第一攪動階段包括改變基底和表面之間的距離，同時在第一攪動階段的持續(xù)時間內(nèi)使得固定溶液接觸試樣；和(iii)從間隔和試樣除去固定溶液；(c)實(shí)施第一染色階段；(d)實(shí)施第二染色階段；和(e)實(shí)施第一漂洗階段。
[0036]在第七方面,本公開的特征在于用于成像試樣的系統(tǒng),其包含自動試樣分析機(jī)器和細(xì)胞學(xué)固定溶液；第一細(xì)胞學(xué)染色溶液；第二細(xì)胞學(xué)染色溶液；和/或漂洗溶液。在一些實(shí)施方案中，所述用于成像試樣的系統(tǒng)包含自動試樣分析機(jī)器和試樣，所述試樣用以下物質(zhì)制備:細(xì)胞學(xué)固定溶液；第一細(xì)胞學(xué)染色溶液；第二細(xì)胞學(xué)染色溶液；和/或漂洗溶液。
[0037]本申請所述的細(xì)胞學(xué)固定溶液、第一細(xì)胞學(xué)染色溶液、第二細(xì)胞學(xué)染色溶液、漂洗溶液、方法、試劑盒和系統(tǒng)的實(shí)施方案可包含以下特征中的任何一種或者多種。
`[0038]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.5至約5g/L天青B (例如，約lg/L天青B)。例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液在水中的1:1000稀釋液在約640至約650nm的峰值波長具有約0.1至約I的UV吸光度。
[0039]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞學(xué)固定溶液不含或者基本不含一種(或者多種)紅色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種常規(guī)紅色染色劑，例如，曙紅Y和熒光素衍生物)。
[0040]細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含以體積計或者以重量計約0.05%至約0.5%的表面活性劑(例如，以體積計或者以重量計約0.05%至約0.3%的表面活性劑、以體積計或者以重量計約0.05%至約0.1%的表面活性劑)。表面活性劑可選自非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑為非離子的，并可包含例如，聚山梨酯20。例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.5mL/L至約2mL/L (例如，約0.5mL/L至約
1.5mL/L、約lml/L)的聚山梨酯20。
[0041]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞學(xué)固定溶液還可包含緩沖劑，例如bis-tris、磷酸鹽、HEPES、MES和/或Tris緩沖劑。例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液在水中的1:10稀釋液可具有約6至約8 (例如，約6.7至約7.3)的pH并包含約0.5mM至約IOmM HEPES0
[0042]細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含以體積計約0.5至約5%(例如，約1%)的乙二醇。
[0043]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約lmL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L乙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。[0044]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含抗微生物劑(例如，約0.2至約50ppm抗微生物劑)，其可包括例如，苯扎氯銨、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲
基-4-異噻唑啉-3-酮、ProClin? (例如，ProClin 300,)、疊氮化物、硫柳汞類、抗生素和它們的任何組合。例如，抗微生物劑可包含5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。在一些實(shí)施方案中,所述抗微生物劑為ProQin 300%?例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約I5ppm ProClin 300?。
[0045]第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5至約lg/L (例如，約0.75g/L)曙紅Y。例如，所述溶液在水中的1:500稀釋液可在約510至約530nm的峰值波長具有約0.1至約I的UV吸光度。
[0046]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)其它紅色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種其它常規(guī)紅色染色劑，例如，其它熒光素衍生物)。
[0047]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)藍(lán)色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種常規(guī)藍(lán)色染色劑，例如，天青B、亞甲藍(lán)和/或其它噻嗪染料)。
[0048]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)其它紅色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種其它常規(guī)紅色染色劑，例如，其它熒光素衍生物)，并且第一細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)藍(lán)色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種常規(guī)藍(lán)色染色劑，例如，天青B、亞甲藍(lán)和/或其它噻嗪染料)。 [0049]第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含以體積計約0.5至約5%(例如，約1%)乙二醇。
[0050]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可具有約5至約8的pH和約5至約250mM的緩沖劑濃度。
[0051]緩沖劑可包含bis-tris、磷酸鹽、HEPES, MES、Tris和它們的任何組合。例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可具有約5.8至約6.2的pH和約5mM至約250mM的bis-tris緩沖劑濃度。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液還可包含乙酸(例如，約2至約3mL/L乙酸)。
[0052]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含以體積計或者以重量計約0.05至約0.5% (例如，約0.05%至約0.3%，約0.05%至約0.1%)的表面活性劑。表面活性劑可選自非離子的、陽離子的、陰離子的或者兩性離子的表面活性劑。例如，表面活性劑可為非離子的，例如聚山梨酯20。在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5mL/L至約2mL/L(例如，約 0.5mL/L 至約 1.5mL/L、約 lml/L)聚山梨酯 20。
[0053]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約I至約20g/L氯化鈉。
[0054]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM bis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約4g/L氯化鈉；約10mL/L乙二醇；約
15ppm ProClin:乙酸；和水，其中所述溶液的pH為約5.8至約6.2。
[0055]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含抗微生物劑(例如，約0.2至約50ppm抗微生物劑)，其可包括例如，苯扎氯銨、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、ProClin"(例如，ProClin 300?)、疊氮化物、硫柳汞類、抗生素和它們的任何組合。例如，抗微生物劑可包含5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含ProClin 300? (例
如，約 15ppm |)!?(..?⑴ 300')。
[0056]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.25至約lg/L(例如，約0.5g/L)天青B。第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.25至約lg/L(例如，約0.45g/L)亞甲藍(lán)。例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液在水中的1:1000稀釋液可在約640至約660nm的峰值波長具有約0.1至約I的UV吸光度。
[0057]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)其它藍(lán)色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種其它常規(guī)藍(lán)色染色劑，例如，天青B、亞甲藍(lán)和/或其它噻嗪染料)。
[0058]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)紅色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種常規(guī)紅色染色劑，例如，熒光素衍生物)。
[0059]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)其它藍(lán)色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種其它常規(guī)藍(lán)色染色劑，例如，其它噻嗪染料)，并且第二細(xì)胞學(xué)染色溶液不含或者基本不含一種(或者多種)紅色染色劑(例如，本領(lǐng)域已知的一種或者多種常規(guī)紅色染色劑，例如，熒光素衍生物)。
[0060]在一些實(shí)施方案中，第二染色溶液可具有約5至約8的pH和約5mM至約250mM的緩沖劑濃度(例 如，約6.8至約7.2的pH和約25mM至約IOOmM的bis-tris緩沖劑濃度)。緩沖劑可包括bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、HEPES、MES、Tris和它們的任何組合。在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液還可包含乙酸。
[0061]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含以體積計或者以重量計約0.05至約0.5% (例如，約0.05%至約0.3%，約0.05%至約0.1%)的表面活性劑，其可包含非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑為非離子的并可包括聚山梨酯20，并且第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5mL/L至約2mL/L (例如，約0.5mL/L至約1.5mL/L、約lml/L)聚山梨酯20。
[0062]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約I至約20g/L氯化鈉。
[0063]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mM bis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約
15ppm ProClin 300?；乙酸；和水。溶液的pH可為約6.8至約7.2。
[0064]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液可包含抗微生物劑(例如，約0.2至約50ppm抗微生物劑或者約0.04至約IOppm抗微生物劑)，其可包括例如，苯扎氯銨、5-氯-2-甲
基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、pr0ClmK (例如，ProClin 300m')、
疊氮化物、硫柳汞類、抗生素和它們的任何組合。在一些實(shí)施方案中，所述抗微生物劑可包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。例如，漂洗溶液可
包括ProClin 30(f (例如，約 I5PPm ProClin 300? 至約 3PPm ProClin 300* )。[0065]漂洗溶液可包含約I至約10g/L (例如，約5g/L)聚乙二醇。
[0066]漂洗溶液可包含約0.2至約2g/L (例如，約lg/L)聚乙二醇。
[0067]漂洗溶液可具有5至8的pH和約5mM至約250mM的緩沖劑濃度(例如，約5至約8的pH和約50mM的HEPES緩沖劑濃度)。緩沖劑可包括bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、HEPES、MES、Tris和它們的任何組合。
[0068]漂洗溶液可具有5至8的pH和約ImM至約50mM的緩沖劑濃度(例如，約5至約8的pH和約IOmM的HEPES緩沖劑濃度)。緩沖劑可包括bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、HEPES、MES、Tris和它們的任何組合。
[0069]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含以體積計或者以重量計約0.05至約0.5%(例如，約0.05%至約0.3%，約0.05%至約0.1%)表面活性劑。表面活性劑可選自非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。例如，表面活性劑可為非離子的并可包括聚山梨酯20 (例如，約0.5mL/L至約2mL/L，約0.5mL/L至約1.5mL/L的聚山梨酯20)。
[0070]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含以體積計或者以重量計約0.01至約0.1%(例如，約0.01%至約0.06%,約0.01%至約0.02%)表面活性劑。表面活性劑可選自非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。例如，表面活性劑可為非離子的并可包括聚山梨酯20 (例如，約0.lmL/L至約0.4mL/L,約0.lmL/L至約0.3mL/L聚山梨酯20)。
[0071]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含約45至約55mL/L(例如，約50mL/L)甲醇。
[0072]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含約9至約llmL/L(例如，約10mL/L)甲醇。
[0073]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含約5g/L聚乙二醇；約50mMHEPES緩沖劑；
約lmL/L聚山梨酯20 ;約15ppm Pr0Clin 300" ；約50mL/L甲醇；和水。漂洗溶液的pH可為約6.6至約7.0。
[0074]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含約lg/L聚乙二醇；約IOmMHEPES緩沖劑；約0.2mL/L聚山梨酯20 ;約3ppm ProCIin 300?；約10mL/L甲醇；和水。漂洗溶液的pH可為約6.6至約7.0。
[0075]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞學(xué)固定溶液不含染料專利藍(lán)VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的專利藍(lán)VF的量)。
[0076]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液不含染料專利藍(lán)VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的專利藍(lán)VF的量)。
[0077]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液不含染料專利藍(lán)VF(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的專利藍(lán)VF的量)。
[0078]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液不含染料專利藍(lán)VF(例如，不含或者含量少于在TO 2007/117798中披露的制劑中存在的專利藍(lán)VF的量)。
[0079]在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞學(xué)固定溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的蛋白水解酶的量)。
[0080]在一些實(shí)施方案中，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的蛋白水解酶的量)。
[0081]在一些實(shí)施方案中，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的蛋白水解酶的量)。
[0082]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液不含蛋白水解酶(例如，不含或者含量少于在WO 2007/117798中披露的制劑中存在的蛋白水解酶的量)。
[0083]在一些實(shí)施方案中，實(shí)施第一染色階段包括(i)以足以使試樣和表面接觸的量將第一細(xì)胞學(xué)染色溶液分配至基底和表面之間的間隔中；(ii)實(shí)施至少第二攪動階段，其中所述第二攪動階段包括改變基底和表面之間的距離，同時在第二攪動階段的持續(xù)時間內(nèi)使得第一染色溶液接觸試樣；和(iii)從間隔和試樣除去第一染色溶液。
[0084]在一些實(shí)施方案中，實(shí)施第二染色階段包括(i)以足以使試樣和表面接觸的量將第二細(xì)胞學(xué)染色溶液分配至基底和表面之間的間隔中；(ii)實(shí)施至少第三攪動階段，其中所述第三攪動階段包括改變基底和表面之間的距離，同時在第三攪動階段的持續(xù)時間內(nèi)使得第二染色溶液接觸試樣；和(iii)從間隔和試樣除去第二染色溶液。
[0085]在一些實(shí)施方案中，實(shí)施第一漂洗階段包括(i)以足以使試樣和表面接觸的量將漂洗溶液分配至基底和表面之間的間隔中；(ii)實(shí)施至少第四攪動階段，其中所述第四攪動階段包括改變基底和表面之間的距離，同時在第四攪動階段的持續(xù)時間內(nèi)使得漂洗溶液接觸試樣；和(iii)從間隔和試樣除去漂洗溶液。
[0086]在一些實(shí)施方案中，所述自動試樣分析機(jī)器具有基底臂，其包括基底夾持器；第一致動器，其與基底臂連接并設(shè)置成移動在打開位置和試樣加工位置之間的基底臂；第二致動器，其安排和設(shè)置成攪動由基底臂上的基底夾持器夾持的基底；平臺，其在基底臂處于試樣加工位置時具有位置與基底相對的頂表面；和兩個或者更多個偏置，其設(shè)置在平臺的頂表面上，使得當(dāng)在基底加工位置使得基底接觸所有偏置時，平臺的基底和頂表面基本平行并形成至少約50微米的間隔。
[0087]適當(dāng)時，自動試樣檢查系統(tǒng)的實(shí)施方案可包含本申請所披露特征中的任何一個或者多個，包括本申請所披露的試樣制備裝置的特征中的任何一個或者多個。
[0088]在本申請所述的方法、試劑盒和系統(tǒng)的實(shí)施方案中，(A)、(B)、(C)和⑶中的一個、兩個、三個，或者四個(例如，四個)可適用。
[0089](A)細(xì)胞學(xué)固定溶液包含天青B ;表面活性劑；甲醇；和乙二醇。
[0090]例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.5g/L至約5.0g/L天青B ;約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約5mL/L至約50mL/L乙二醇、丙二醇，或者聚丙二醇；約0.lg/L至約10g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0091]作為另一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.8g/L至約1.2g/L天青B ;約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約9mL/L至約llmL/L乙二醇；約0.25g/L至約0.38g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0092]例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約lmL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L乙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0093]作為另一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L丙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0094]作為又一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約1.5mL/L聚山梨酯20 ;約10mL/L聚丙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0095]實(shí)施方案可包含上面和/或在【具體實(shí)施方式】中和/或在權(quán)利要求中所述的特征中的任何一個或者多個。
[0096](B)第一細(xì)胞學(xué)染色溶液包含曙紅Y ;緩沖劑；表面活性劑；氯化鈉；乙二醇；和水。
[0097]例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L至約5.0g/L曙紅Y ;約5禮至約250mMbis-tris或者磷酸鹽緩沖劑；約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約lg/L至約20g/L氯
化鈉；約5mL/L至約50mL/L乙二醇；約0.2ppm至約50ppm ProC'lin 300?；乙酸；和水，其
中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0098]作為另一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.6g/L至約0.9g/L曙紅Y ;約45mM至約55mM bis-tris緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約3g/L至約5g/L氯
化鈉;約9mL/L至約llmL/L 乙二醇；約IOppm至約20ppm ProClin 300?；乙酸;和水，其中
所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0099]例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM bis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約4g/L氯化鈉；約I OmL/L乙二醇；約15ppm ProCIin 300?；乙酸;和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0100]作為另一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y 4^50mMbis-tris緩沖劑；約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約68/1 氯化鈉 ^20mL/L 乙二醇 ^15ppm ProClin 300?；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0101]作為又一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM磷酸鹽緩沖劑;約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約4g/L氯化鈉;約50mL/L乙二醇;約15ppm ProCIin 300?；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0102]實(shí)施方案可包含上面和/或在【具體實(shí)施方式】中和/或在權(quán)利要求中所述的特征中的任何一個或者多個。
[0103](C)第二細(xì)胞學(xué)染色溶液包含天青B ;亞甲藍(lán)；緩沖劑；表面活性劑、氯化鈉和水。
[0104]例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.25至約2.5g/L天青B ;約0.25g/L至約2.5g/L 亞甲藍(lán)；約 5mM 至約 250mM bis-tris 或者 HEPES 緩沖劑；約 0.5mL/L 至約 2.0mL/L
聚山梨酯20、約lg/L至約20g/L氯化鈉和約0.2ppm至約50ppm Prodin 300 '；乙酸；和
水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0105]作為另一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.4至約0.6g/L天青B ;約0.4g/L至約0.5g/L亞甲藍(lán)；約45mM至約55mM bis-tris緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨
酯20、約1.8g/L至約2.2g/L氯化鈉和約IOppm至約20ppm Pr0CIin 300；乙酸；和水，其
中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0106]例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mMbis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約15ppm ProClin 300 !;乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0107]作為另一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mM HEPES緩沖劑;約0. 5mL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約15ppm ProClin 300*； 乙酸；和水，其中所述溶液的pH為約6. 8至約7. 2。
[0108]作為又一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B;約0.45g/L亞甲藍(lán)； 約50mM HEPES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約lg/L氯化鈉和約15ppm ProClin 300?；
乙酸；和水，其中所述溶液的pH為約6. 8至約7. 2。
[0109]溶液的pH可為約6. 8至約7. 2。
[0110]實(shí)施方案可包含上面和/或在【具體實(shí)施方式】中和/或在權(quán)利要求中所述的特征中 的任何一個或者多個。
[0111](D)用于自動試樣制備裝置的漂洗溶液包含聚乙二醇；緩沖劑；表面活性劑；甲 醇；和水。
[0112]例如，漂洗溶液可包含約0. 2g/L至約10g/L聚乙二醇；約ImM至約250mM HEPES、 MES,或者bis-tris緩沖劑；約0. lmL/L至約2. 40mL/L聚山梨酯20 ;約0. 04ppm至約
50ppm ProClin 300*；約9mL/L至約200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6. 6
至約7. 0。
[0113]作為另一實(shí)例，漂洗溶液可包含約lg/L至約10g/L聚乙二醇；約5mM至約250mM HEPES、MES,或者bis-tris緩沖劑；約0. 5mL/L至約2. 0mL/L聚山梨酯20 ;約0. 2ppm至約
50ppm I^roClin 300?；約10mL/L至約200mL/L甲醇；和水,其中所述漂洗溶液的pH為約6. 6
至約7. 0。
[0114]作為又一實(shí)例，漂洗溶液可包含約4. 5g/L至約5. 5g/L聚乙二醇；約45mM 至約55mM HEPES緩沖劑；約0. 8mL/L至約1. 2mL/L聚山梨酯20 ;約lOppm至約
20ppm ProClin 300?；約45mL/L至約55mL/L甲醇;和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6. 6
至約7. 0。
[0115]例如，漂洗溶液包含約5g/L聚乙二醇；約50mM HEPES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯 20 ;約15ppm ProClin 300 ：約50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6. 6至約 7. 0。
[0116]作為另一實(shí)例，漂洗溶液包含約10g/L聚乙二醇；約50禮MES緩沖劑；約lmL/L聚 山梨酯20 ;約15ppm ProClin 300?；約50mL/L甲醇；和，其中所述漂洗溶液的pH為約6. 6 至約7. 0。
[0117]作為又一實(shí)例，漂洗溶液包含約10g/L聚乙二醇；約50mM bis-tris緩沖劑；約 0. 5mL/L聚山梨酯20 ;約15ppm ProClin 300?；約50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的 pH為約6. 6至約7. 0。
[0118]例如，漂洗溶液可包含約0. 2g/L至約2g/L聚乙二醇；約ImM至約50mM HEPES緩 沖劑；約 0. 16mL/L 至約 0. 24mL/L 聚山梨酯 20 ;約 0. 04ppm 至約 lOppm.^00 .：約
9mL/L至約llmL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6. 6至約7. 0。
[0119]作為另一實(shí)例，漂洗溶液可包含約0. 9g/L至約1. lg/L聚乙二醇；約9禮至約llmMHEPES 緩沖劑;約0.16mL/L 至約 0.24mL/L聚山梨酯 20 jMppm 至約 IOppm ProClin 300?；
約9mL/L至約llmL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0120]在又一實(shí)例中，漂洗溶液包含約lg/L聚乙二醇；約IOmM HEPES緩沖劑；約0.2mL/
L聚山梨酯20 ^3ppm ProClin 300?;約10mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約
6.6 至約 7.0。
[0121]當(dāng)用于本申請時，當(dāng)溶液“不含”一種或者多種物質(zhì)時，這意味著，所述溶液含有少于5% (例如，少于4%，少于3%，少于2%，少于1%，0% (w/w或者w/v或者v/v))的指出的一種或者多種物質(zhì)，如通過HPLC、UV光譜、電泳和/或酶測定檢測測定。
[0122]除非另外定義，本申請使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管在實(shí)踐或者測試本發(fā)明中可使用與本申請所述相似或者相等的方法和材料，但是下面描述適合的方法和材料。本申請?zhí)峒暗乃泄_、專利申請、專利和其它文獻(xiàn)的全部內(nèi)容并入本申請作為參考。在沖突的情況中，將遵循本發(fā)明說明書(包括定義)。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為說明性的并且不意圖限制本發(fā)明。
[0123]根據(jù)以下詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0124]圖1為固定溶液的實(shí)施方案的HPLC色譜圖。
[0125]圖2為固定溶液的實(shí)施方案的UV-Vis吸收光譜。
[0126]圖3為第一染色溶液`的實(shí)施方案的HPLC色譜圖。
[0127]圖4為第一染色溶液的實(shí)施方案的UV-Vis吸收光譜。
[0128]圖5為第二染色溶液的實(shí)施方案的HPLC色譜圖。
[0129]圖6為第二染色溶液的實(shí)施方案的UV-Vis吸收光譜。
[0130]圖7為制備用于檢查的試樣的裝置的實(shí)施方案的透視圖，所述裝置在打開位置具有樣品夾持器20A和20B。
[0131]圖8為圖7的裝置的一部分的另一透視圖(基底臂和樣品夾持器未示出)。
[0132]圖9A為圖7的裝置的又一透視圖，樣品夾持器20A處于打開位置并且樣品夾持器20B處于關(guān)閉(試樣加工)位置。
[0133]圖9B為圖7的裝置的索引機(jī)構(gòu)(indexing mechanism)的透視圖。
[0134]圖10為圖7的裝置的透視圖，其示出在裝置和流體貯存器之間通過多個流體管道的連接。
[0135]圖11為包含自動基底移動器的試樣檢查系統(tǒng)和本申請所述的試樣制備裝置的實(shí)施方案的透視圖。
[0136]圖12A為圖7的裝置的一部分的展開透視圖，其詳細(xì)示出試樣夾持器20B、平臺60B和模塊80B。
[0137]圖12B為圖7的裝置的球接機(jī)構(gòu)的透視圖。
[0138]圖12C為圖12B的球接機(jī)構(gòu)的橫截面圖。
[0139]圖13A為流程圖，其示出將基底臂從打開位置移動至關(guān)閉(試樣加工)位置的一系列步驟。[0140]圖13B為本申請所述的試樣制備裝置的實(shí)施方案的示意圖。
[0141]圖14A為流程圖，其示出將基底臂從打開位置移動至試樣加工位置的一系列可選步驟。
[0142]圖14B為制備用于檢查的試樣的裝置的示意圖，所述裝置包括兩個致動器。
[0143]圖15為流程圖，其示出將固定劑施用至試樣的一系列步驟。
[0144]圖16為流程圖，其示出將染色劑施用至試樣的一系列步驟。
[0145]圖17A為流程圖，其示出從基底除去過量流體的一系列步驟。
[0146]圖17B為流程圖，其示出從基底除去過量流體的一系列可選步驟。
[0147]圖18為流程圖，其示出漂洗試樣的一系列步驟。
[0148]圖19為流程圖，其示出攪動試樣的一系列步驟。
[0149]圖20為流程圖,其示出干燥試樣的一系列步驟。
[0150]圖21為在較大試樣檢查系統(tǒng)中使用的試樣制備裝置的透視圖。
[0151]圖22為流程圖，其示出加工安裝在基底上的試樣的一系列步驟。
[0152]圖23為圖，其示出在圖22的流程圖中作為時間的函數(shù)的消耗的流體的體積。
[0153]圖24A和24B為圖7的裝置的透視圖，其示出通過自動基底移動器將基底置于基底臂上。
[0154]圖25為含有固定溶液、第一染色溶液、第二染色溶液和漂洗溶液的試劑盒的實(shí)施方案。
[0155]在各個圖中相同的參考符號表示相同的元件。
【具體實(shí)施方式】
[0156]本申請披露了用于自動試樣加工的制劑、方法和系統(tǒng)。本申請所述的自動試樣加工方法和系統(tǒng)提供優(yōu)于手動和其它自動加工方法的優(yōu)點(diǎn)，包括增強(qiáng)的加工速度，使用最小試劑體積，同時得到高度均勻染色，其顯著降低與當(dāng)通過手動或者通過其它系統(tǒng)加工試樣時施用染色劑、固定劑和其它試劑有關(guān)的差異性。固定劑、染色劑和漂洗溶液可提供與試樣增強(qiáng)的對比，并可容易地從自動試樣加工系統(tǒng)分配。而且，固定劑、染色劑和漂洗溶液可提供優(yōu)于常規(guī)固定劑、染色劑和漂洗溶液的改善的細(xì)胞識別和細(xì)胞分類。
[0157]常規(guī)的固定、染色和漂洗溶液通常提供差的染色結(jié)果，例如生物樣品的淺色染色或者非特異性染色(例如，細(xì)胞質(zhì)的非特異性染色)；或者需要大體積的加工流體。本申請公開的制劑允許使用低體積加工流體得到生物樣品的高對比度和選擇性染色，例如，當(dāng)使用自動試樣加工系統(tǒng)時。
[0158]而且，常規(guī)自動加工方法通常具有相對高的加工通量，而同時消耗大體積的加工流體，或者具有相對低的加工通量，而消耗降低體積的流體。然而，對于許多應(yīng)用，希望高通量操作和低流體消耗。通過維持高通量，可有效地加工和檢查試樣。通過保持低的流體消耗，加工廢物量連同需要的加工試劑體積得到降低，從而保持低的操作成本。本申請公開的制劑、系統(tǒng)和方法允許使用低體積的加工流體(例如，少于約ImL流體/試樣、少于約1.5mL流體/試樣、少于約2mL流體/試樣)進(jìn)行試樣的快速自動加工(例如,通過單一機(jī)器超過100個試樣/小時)，同時得到高度均勻和可重復(fù)的結(jié)果。
[0159]用于試樣制備系統(tǒng)的制劑[0160]本申請?zhí)峁┕潭ㄈ芤骸⒁环N或者多種染色溶液和漂洗溶液，其可用于自動試樣制備系統(tǒng)。每種溶液可具有特定配方。例如，固定溶液可包含細(xì)胞學(xué)染料、表面活性劑、有機(jī)溶齊U、將非特異性結(jié)合最小化的試劑和緩沖劑。第一染色水溶液可包含細(xì)胞學(xué)染料、緩沖劑、表面活性劑、鹽、將非特異性結(jié)合最小化的試劑和抗微生物劑。第二染色水溶液可包含一種或者多種細(xì)胞學(xué)染料、緩沖劑、表面活性劑、鹽和抗微生物劑。漂洗溶液可包含緩沖劑、表面活性劑、抗微生物劑、有機(jī)溶劑和水溶性聚合物?？蓪⑺鲋苿┙M分針對純度分析和/或通過HPLC純化。制劑也可包含調(diào)節(jié)pH的酸。下面更詳細(xì)地描述每種制劑。
[0161]固定溶液
[0162]可包含在固定溶液中的固定劑包括用于防止生物樣品腐爛的化學(xué)品。這種固定劑可阻止在試樣中發(fā)生的生物化學(xué)反應(yīng)和提高試樣的機(jī)械強(qiáng)度和穩(wěn)定性。在固定溶液中可包含各種固定劑，例如，甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、甲醛、戊二醛、EDTA、表面活性劑、金屬鹽、金屬離子、脲和氨基化合物。在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液包含有機(jī)溶劑或者固定劑，所述固定劑可沉淀、交聯(lián)，或者以其它方式保存用于成像用途的細(xì)胞內(nèi)的組分(例如，蛋白質(zhì))。例如，固定劑可包含有機(jī)溶劑，例如一種或者多種醇(包括甲醇、乙醇和異丙醇)，或者其它有機(jī)溶劑如丙酮和乙醚。在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液包含有機(jī)溶劑如甲醇。有機(jī)溶劑可具有少于約0.1%水(例如，少于約0.05% /K，少于約0.01%水)的ACS等級。有機(jī)溶劑在溶液中的存在量可為:在其它組分已經(jīng)添加至固定溶液后的余量。有機(jī)溶劑可用作試樣的干燥劑并可替代試樣中的水。
[0163]在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液包含細(xì)胞學(xué)染料。染料可提高試樣的染色并可包括例如，天青B、亞甲藍(lán)、曙紅、噻嗪染色劑和熒光素衍生物。染料可為至少約80%純(例如，至少約85%純、至少約90%純、至少約95%純，或者至少約99%純)。天青B的代表性HPLC色譜圖例如在圖1中示出。在固定溶液中染料的濃度可為約0.5g/L(例如，約0.75g/L、約lg/L、約 2g/L、約 3g/L,或者約 4g/L)至約 5g/L(例如,約 4g/L、約 3g/L、約 2g/L、約 lg/L,或者約0.75g/L)。例如，固定溶液可包含約lg/L天青B。在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液可包含約0.8g/L天青B。
[0164]固定溶液可包含表面活性劑。不希望被任何理論束縛，據(jù)信，表面活性劑降低溶劑的表面張力，并提供溶液在圖13B中所示的間隔92處的樣品基底上的良好鋪展性。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑為非離子的，并可將從溶液沉淀的可能性最小化，所述沉淀可來自于與制劑中的組分如離子電荷染料的離子相互作用。具有極少沉淀或者沒有沉淀的溶液可更容易從分配噴嘴排出，并可減少分配噴嘴阻塞的可能性或者液體流隨時間推移變小的可能性。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑可降低固定溶液中的組分與試樣的非特異性結(jié)合的可能性，其可將成像偽影(imaging artifacts)最小化。
[0165]固定溶液可包含約0.05% (例如，約0.075%、約0.1%、約0.2%、約0.3%，或者約0.4%)至約0.5% (例如，至約0.4%、至約0.3%、至約0.2%、至約0.1%，或者至約0.075%)的液體表面活性劑(以體積計)或者固體表面活性劑(以重量計)。在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液可包含約0.5至約2mL/L表面活性劑(例如，非離子的表面活性劑)。例如，固定溶液可包含約lmL/L聚山梨酯20 (例如，吐溫20)。
[0166]表面活性劑可為非離子的、陽離子的、陰離子的或者兩性離子的。也可使用表面活性劑混合物。表面活性劑的示例性類別包括醇醚硫酸鹽(alcohol ether sulfates)、醇硫酸鹽(alcohol sulfates)、燒醇酸胺(alkanolamides)、烷基橫酸鹽(alkyl sulfonates)、胺氧化物(amine oxides)、兩性表面活性劑、陰離子表面活性劑、甜菜堿衍生物、陽離子表面活性劑、二磺酸鹽、十二烷基苯、磺酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酚、乙氧基化脂肪酸、甘油酯助水溶物、月桂基硫酸鹽(lauryl sulfates)、單甘油酯和二甘油酯、非離子的表面活性劑、磷酸酯、季銨表面活性劑(quaternary surfactants)和脫水山梨糖醇衍生物。
[0167]示例性非離子的表面活性劑包括，例如，BigCHAP (N, N- 二 [3_ (D-葡糖酰氨基)丙基]膽酰胺)、二(聚乙二醇二 [咪唑甲酰羰基])(Bis (polyethylene glycolbis [imidazoyl carbonyl]))、Bri j⑩30 (聚氧乙烯4月桂基醚)Bri j⑩35 (聚氧乙烯23月桂基醚)、Brij ? 52 (聚氧乙烯2鯨蠟基醚)、Brij ? 56 (聚氧乙烯10鯨蠟基醚)、Brij ? 58 (聚氧乙烯20鯨蠟基醚)、Brij Φ 72 (聚氧乙烯2硬脂基醚)、Bri j ? 76 (聚氧乙烯10硬脂基醚)、Brij⑩78 (聚氧乙烯20硬脂基醚)、Brij ? 92 (聚氧乙烯2油基醚)、Bri j ? 97 (聚氧乙烯10油基醚)、Bri j ? 98 (聚氧乙烯20油基醚)、Bri j ? 700 (聚氧乙烯100硬脂基醚)、Cremophor ? EL (蓖麻油/氧化乙烯聚醚)、十乙二醇單十二烷基醚、辛?；?N-甲基葡糖酰胺(MECA-8)、癸?；?N-甲基葡糖酰胺(MECA-10)、正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、異十三烷基-聚(乙二醇醚)n、N-癸?；?N-甲基葡糖胺、正癸基a -D吡喃葡糖苷、癸基β -D-吡喃麥芽糖苷、正-十二烷酰基-N-甲基葡糖酰胺、正十二烷基a-D-麥芽糖苷、正十二烷基β-D-麥芽糖苷、七乙二醇單癸基醚、七乙二醇單十四烷基醚、正十六烷基β-D-麥芽糖苷、六乙二醇單十二烷基醚、六乙二醇單十六烷基醚、六乙二醇單十八烷基醚、六乙二醇單十四烷基醚、Ig印alCA-630(辛基苯基-聚乙二醇)、Ig印al_CA-210 (聚氧乙烯(2)異辛基苯基醚)、Ig印al % CA-520 (聚氧乙烯(5)異辛基苯基醚)、Ig印al? C0-630(聚氧乙烯(9)壬基苯基醚)、Igepal ；!<.C0_720(聚氧乙烯(12)壬基苯基醚)、Igepal ? C0-890 (聚氧乙烯(40)壬基苯基醚)、Igepal⑩C0-990 (聚氧乙烯(100)壬基苯基醚)、Ig^alqf) DM-970(聚氧乙烯(150) 二壬基苯基醚)、甲基-6-0-(N-庚基氨基甲酰基)-a -D-吡喃葡糖苷、九乙二醇單十二烷基醚、N-壬?；?N-甲基葡糖胺、八乙二醇單癸基醚、八乙二醇 單十二烷基醚、八乙二醇單十六烷基醚、八乙二醇單十八烷基醚、八乙二醇單十四烷基醚、辛基-β -D-吡喃葡糖苷、五乙二醇單癸基醚、五乙二醇單十二烷基醚、五乙二醇單十六烷基醚、五乙二醇單己基醚、五乙二醇單十八烷基醚、五乙二醇單辛基醚、聚乙二醇二縮水甘油基醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯10十三烷基醚、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20異十六烷基醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、皂苷、Span⑩20(脫水山梨糖醇單月桂酸酯)、Span_40(脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、Span?60 (脫水山梨糖醇單硬脂酸酯)、Span? 65 (脫水山梨糖醇三硬脂酸酯)、Span _ 80 (脫
水山梨糖醇單油酸酯)、Span ? 85 (脫水山梨糖醇三油酸酯)、任何形式的Tergitol (包括類型 15-S-5、15-S-7、15-S-9、15-S-12、15-S-30、NP-4、NP-7、NP-9、NP-10、NP-40、NPX (Imbentin-N/63)、TMN-3 (聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-6 (聚乙二醇三甲基壬基醚)、TMN-10 (聚乙二醇三甲基壬基醚)、MIN FOAM Ix和MIN F0AM2x)、十四烷基-β-D-麥芽糖苷、四乙二醇單癸基醚、四乙二醇單十二烷基醚、四乙二醇單十四烷基醚、三乙二醇單癸基醚、三乙二醇單十二烷基醚、三乙二醇單十六烷基醚、三乙二醇單辛基醚、三乙二醇單十四烷基醚、Triton 靡 CF-21、Triton.CF-32、Triton ? DF-12、Triton ? DF-16、Triton ?
GR-5M、Triton ? N-1Ol (聚氧乙烯支鏈壬基苯基醚)、Triton ? QS-15、Triton Φ QS-44、
Triton⑩RW-75 (聚乙二醇260單(十六烷基/十八烷基)醚和1-十八醇)、Triton⑩
X-100 (聚乙二醇四-辛基苯基醚)、Triton 乳' X-102、Triton ? X-15、Triton 爆 X-151、
Triton? X-200、Triton ? X-207、Triton? X-114、Triton ? X-165、Triton 詹 X-305、
Triton? X-405 (聚氧乙烯(40)異辛基苯基醚)、還原的Triton.X-405 (聚氧乙烯(40)異辛基環(huán)己基醚)、Triton? X-45 (聚乙二醇4-叔-辛基苯基醚)、Triton? X-705-70、任何
形式的TWEEN⑩(包括TWEENf) 20 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，或者聚山梨酯20)、
TWEEN? 21 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯)、TWEEN? 40(聚氧乙烯(20)脫水山梨
糖醇單棕櫚酸酯)>TWEEN ? 60 (聚乙二醇脫水山梨糖醇單硬脂酸酯)、TWEEN ? 61 (聚乙二
醇脫水山梨糖醇單硬脂酸酯)> TWEEN ? 65 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂酸酯),TWEEN ?
80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)、TWEEN_ 81 (聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯)和
TWEEN? 85(聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇三油酸酯))、Tyl0xap0l (4_(1，1，3，3-四甲基丁
基)苯酚與甲醛和環(huán)氧乙烷的聚合物)和正十一烷基β-D-吡喃葡糖苷。
[0168]示例性陰離子表面活性劑包括鵝去氧膽酸、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、洋地黃皂甙、洋地黃毒甙配基、N, N- 二甲基十二烷基胺N-氧化物、多庫酯鈉、鵝脫氧膽酰甘氨酸鈉、甘膽酸、甘氨脫氧膽酸、葡糖石膽酸3-硫酸酯二鈉鹽、葡糖石膽酸乙酯、N-月桂酰基肌氨酸、十二烷基硫酸鋰、Lugol (碘碘化鉀)、NiapiOof (硫酸2-乙基己基酯鈉鹽)、Niaproof4(硫酸7-乙基-2-甲基-4-1^一烷基酯鈉鹽)、任選取代的烷基磺酸鹽(包括1-丁烷磺酸鹽、戊烷磺酸鹽、己烷磺酸鹽、1-辛烷磺酸鹽、1-癸烷磺酸鹽、1-十二烷磺酸鹽、1-庚烷磺酸鹽、1-庚烷磺酸鹽、1-壬烷磺酸鹽、1-丙烷磺酸鹽和2-溴乙烷磺酸鹽，尤其是鈉鹽)、膽酸鈉、去氧膽酸鈉、任選取代的十二烷基硫酸鈉、辛基硫酸鈉、?；悄懰徕c、?；撬狴Z去氧膽酸鈉、牛磺酸豬去氧膽酸鈉、牛磺石膽酸3-硫酸酯二鈉鹽、牛磺熊脫氧膽酸鈉鹽、Trizma(I)-十二烷基硫酸鹽、熊去氧膽酸。陰離子表面活性劑可以以酸或者鹽形式，或者酸和鹽形式提供。
[0169]示例性陽離子表面活性劑包括烷基三甲基溴化銨、苯扎氯銨、芐基二甲基十六烷基氯化銨、芐基二甲基十四烷基氯化銨、芐基十二烷基二甲基溴化銨、芐基三甲基四氯碘酸銨、二甲基二(十八烷基)溴化銨、十二烷基乙基二甲基溴化銨、十二烷基三甲基溴化銨、乙基十六烷基二甲基溴化銨、Girard試劑T、十六烷基三甲基溴化銨、N，N' ,N'-聚氧乙烯
(IO)-N-牛油-1，3- 二氨基丙烷、通佐溴銨和二甲基(十四烷基)溴化銨。
[0170]示例性兩性離子的表面活性劑包括CHAPS(3-{(3_膽酰氨基丙基)_ 二甲基銨基} _1_丙烷-橫酸鹽)、CHAPSO (3- {(3-膽酸氨基丙基)二甲基_銨基} ~2~羥基-1-丙烷-磺酸鹽)、3_(癸基二甲基銨基)丙烷磺酸鹽、3-(十二烷基二甲基銨基)丙烷磺酸鹽、3-(N，N-二甲基肉豆蘧基銨基)丙烷磺酸鹽、3-(N，N-二甲基十八烷基銨基)丙烷磺酸鹽、3- (N, N- 二甲基辛基銨基)丙烷磺酸鹽和3- (N, N- 二甲基棕櫚基銨基)丙烷磺酸鹽。
[0171]表面活性劑包括本領(lǐng)域已知的或者可發(fā)現(xiàn)的那些。表面活性劑可合成或者可從很多賣主中的任何賣主(例如，Sigma Aldrich Corp., St.Louis, M0., USA, www.sigmaaldrich.com)商購。通過針對不使用表面活性劑處理加工的樣品和針對用已知減少染色偽影的表面活性劑或者其它陽性對照處理加工的樣品來評估用試驗(yàn)表面活性劑處理的樣品，可測試給出的表面活性劑的減少偽影的能力。通過在將溶液靜置至少兩周后針對不含表面活性劑的溶液來目視檢查含有表面活性劑的溶液，可測試給出的表面活性劑的減少制劑組分沉淀的能力。
[0172]固定溶液可包含將染料與細(xì)胞組分如乙二醇、丙二醇和/或聚乙二醇的非特異性結(jié)合最小化的試劑。在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液可包含約0.5%(例如，約0.75%、約1%、約2%、約3%，或者約4%)至約5% (例如，約4%、約3%、約2%、約1%，或者約0.75%)液體非特異性結(jié)合最小化試劑(以體積計)，或者固體非特異性結(jié)合最小化試劑(以重量計)。例如，固定溶液可包含約5mL/L (例如，約10mL/L、約15mL/L、約20mL/L、約25mL/L、約30mL/L、約 35mL/L、約 40mL/L，或者約 45mL/L)至約 50mL/L (例如，約 45mL/L、約 40mL/L、約 35mL/L、約30mL/L、約25mL/L、約20mL/L、約15mL/L，或者約10mL/L)乙二醇。在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液包含約10mL/L (例如，約15mL/L、約20mL/L，或者約25mL/L)乙二醇。
[0173]固定溶液可包含緩沖劑。緩沖劑的實(shí)例包括HEPES緩沖劑(例如，HEPES鈉鹽和/或HEPES游離酸)、MES、vis-tris和其它有機(jī)緩沖劑。固定溶液可包含約0.5mM(例如，約ImM、約3mM、約5mM、約7mM,或者約9mM)至約10mM(例如，約9mM、約7mM、約5mM、約3mM,或者約ImM)緩沖劑。例如，固定溶液可包含約1.5mM(例如，約2mM或者約ImM)HEPES鈉鹽。固定溶液可包含約0.lg/L至約10g/L HEPES (例如，約0.5g/L至約10g/L,約0.25g/L至約0.38，約 0.32g/L)。
[0174]當(dāng)以約1:10固定溶液與水的比率在水中稀釋時，固定溶液的pH可為約6至約8 (例如，pH為約6.3至約1.7，pH為約6.5至約1.5，pH為約6.7至約1.3，pH為約6.8至約7.2，pH為約6.9至約7.1，或者pH為約7.0)。在一些實(shí)施方案中，以1:1000固定溶液與水的稀釋度，所述固定劑可在約640至約650nm(例如，約646至約648nm)的峰值波長具有約0.1至1(例如，約0.1至0.8、約0.1至0.7、約0.1至0.5、約0.1至0.4、約0.1至0.3、約0.15至0.3、約0.15至0.2、約0.185至0.205、約0.19，或者約0.2)的吸光度。
[0175]作為實(shí)例，為制備固定溶液，首先可將有機(jī)溶劑如甲醇添加至混合容器，達(dá)到最終希望體積的少于100%(例如，約90%)。可將計算量的非特異性結(jié)合最小化試劑(例如，乙二醇)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20)、細(xì)胞學(xué)染料(例如，天青B)和緩沖劑(例如，HEPES鈉鹽)添加至甲醇?？商砑恿硗獾募状家允谷芤哼_(dá)到最終希望體積?？蓪⒒旌衔镉么帕嚢璋?攪拌子和/或葉輪混合最少約30分鐘。在混合后，可制備固定溶液在蒸餾水中的1:10稀釋液和可使用pH計(例如，Mettler pH計)讀取pH。在一些實(shí)施方案中，如果pH不在希望的范圍內(nèi)，那么可將其它緩沖劑添加至未稀釋的固定溶液，直到固定溶液在蒸餾水中的1:10稀釋液達(dá)到希望的pH。
[0176]可使用UV-分光光度計(例如，Hitachi UV-分光光度計)測量固定溶液吸光度。首先可在分光光度計上運(yùn)行基線。例如，可將固定溶液的IOmL樣品經(jīng)0.45μπι注射器式濾器濾過，可將溶液用蒸餾水以1:1000稀釋并在分光光度計上在約500至約700nm之間運(yùn)行?？捎涗浽诩s640至約650nm的吸光度。包含天青B的固定溶液的代表性UV-Vis吸收光譜例如在圖2中示出。如果需要，可將另外的細(xì)胞學(xué)染料添加至固定溶液以使吸光度達(dá)到希望的范圍。如果將另外的細(xì)胞學(xué)染料添加至固定溶液，那么將溶液混合最少約30分鐘，并重復(fù)測量過程(例如，過濾IOmL等分試樣，在蒸餾水中以1:1000的比率稀釋等分試樣，并進(jìn)行吸光度測量)。溶液的PH也可通過上述方法重新測量并調(diào)節(jié)(如果需要的話)。
[0177]最后，可將固定溶液經(jīng)0.45 μ m濾器濾過以在裝瓶之前除去任何微粒。在一些實(shí)施方案中，可使用較細(xì)或者較粗的濾器。例如，可使用0.1至Ιμπι濾器(例如,0.2μηι濾器、0.4μπι濾器，或者0.8μπι濾器)以除去固定溶液中的任何微生物和/或微粒。在一些實(shí)施方案中，可將所述固定劑忙存在500mL瓶中并裝填至396g土 Ig,如通過天平測量。如果希望的話，可測量最終產(chǎn)物的pH。在一些實(shí)施方案中，可得到固定溶液的HPLC色譜圖，例如，用于評估溶液純度。
[0178]在一些實(shí)施方案中，所述固定溶液包含HEPES緩沖劑(例如，HEPES鈉鹽和/或HEPES游離酸)，因?yàn)樗诩状贾锌扇?，與天青B相容和/或可調(diào)節(jié)pH至約7.8。天青B可優(yōu)先染色某些細(xì)胞組分(例如，細(xì)胞核、嗜堿性粒細(xì)胞、細(xì)胞質(zhì)、顆粒等)以提供增強(qiáng)的對照。聚山梨酯20可增強(qiáng)固定溶液在基底(例如，顯微鏡載玻片)上的鋪展能力和/或可打底隨后用于遞送水溶液的噴嘴。乙二醇可減少染料與細(xì)胞組分(例如，染色質(zhì)，以提供相比于核較淺著色的核仁)的非特異性結(jié)合，以在染色試樣中提供較好的對照。
[0179]例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.5g/L至約5.0g/L天青B ;約0.5mL/L至約
2.0mL/L聚山梨酯20 ;約5mL/L至約50mL/L乙二醇、丙二醇，或者聚丙二醇；約0.lg/L至約10g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0180]作為另一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約0.8g/L至約1.2g/L天青B ;約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約9mL/L至約llmL/L乙二醇；約0.25g/L至約0.38g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0181]例如，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約lmL/L聚山梨酯20 ;約I OmL/L乙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0182]作為另一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約
IOmL/L丙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0183]作為又一實(shí)例，細(xì)胞學(xué)固定溶液可包含約lg/L天青B ;約1.5mL/L聚山梨酯20 ;約10mL/L聚丙二醇；約0.32g/L HEPES鈉鹽；和甲醇。
[0184]第一和第二染色溶液
[0185]通常，第一染色溶液可為水溶液。溶劑可包含蒸餾水或者去離子水。第一染色溶液包含細(xì)胞學(xué)染料。第一染色溶液可提供紅色染色劑。染料可提高試樣的染色并可包含，例如，曙紅Y和熒光素衍生物。在一些實(shí)施方案中，曙紅Y可染色試樣中的細(xì)胞質(zhì)和核，所述試樣例如從血液樣品制備。在一些實(shí)施方案中，嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞優(yōu)選用曙紅Y染色。染料可為至少約80%純(例如，至少約85%純、至少約90%純、至少約95%純，或者約100%純)。曙紅Y的代表性HPLC色譜圖例如在圖3中示出。在第一染色溶液中染料的濃度可為約0.5g/L (例如，約0.75g/L、約lg/L、約2g/L、約3g/L,或者約4g/L)至約5g/L(例如，約4g/L、約3g/L、約2g/L、約lg/L，或者約0.75g/L)。例如，第一染色溶液可包含約0.75g/L (例如，約lg/L、約2g/L、約3g/L、約4g/L，或者約5g/L)曙紅Y。[0186]通常，第二染色溶液可為水溶液。溶劑可包含蒸餾水或者去離子水。第二染色溶液可包含兩種或者更多種細(xì)胞學(xué)染料。第二染色溶液可提供藍(lán)色染色劑。染料可提高試樣染色并可包含例如，天青B、亞甲藍(lán)和/或其它噻嗪染料中的至少兩種。在一些實(shí)施方案中，天青B可優(yōu)選染色細(xì)胞核，而亞甲藍(lán)可主要染色試樣中的細(xì)胞質(zhì)和少量地染色試樣中的細(xì)胞核，所述試樣例如從血液樣品制備。染料可各自獨(dú)立地為至少約80%純(例如，至少約85%純，至少約90%純，至少約95%純，或者約100%純)。在第二染色溶液中每種染料可獨(dú)立地具有以下濃度:約0.25g/L (例如，約0.3g/L、約0.4g/L、約0.45g/L、約0.5g/L、約0.75g/L、約 lg/L、約 1.5g/L，或者約 2g/L)至約 2.5g/L (例如，約 2g/L、約 1.5g/L、約 lg/L、約0.75g/L，或者約0.5g/L、約0.45g/L、約0.4g/L，或者約0.3g/L)。例如，第二染色溶液可包含約0.5g/L天青B和約0.45g/L亞甲藍(lán)水合物。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在對應(yīng)于每種染料的最大吸光度(例如，在約630nm和約660nm)的波長監(jiān)測吸光度時，第二染色溶液可包含約1:4至約4:1(例如，約3:1、約2:1、約1:1、約1:2，或者約1:3)比率的兩種染料，如通過每種染料的最大HPLC峰下的面積評估。包含約1:1比率的天青B和亞甲藍(lán)的第二染色溶液的代表性HPLC色譜圖例如在圖5中示出。
[0187]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含表面活性劑。不希望被任何理論束縛，據(jù)信，表面活性劑降低溶劑的表面張力，并可提供溶液在樣品基底上的良好鋪展性。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑為非離子的，并可將從溶液沉淀的可能性最小化，所述沉淀例如可來自于與制劑中的組分如離子電荷染料的離子相互作用。具有極少沉淀或者沒有沉淀的溶液可更容易從分配噴嘴排出，并可減低分配噴嘴阻塞或者液體流變小的可能性。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑可降低非特異性結(jié)合的可能性或者將偽影最小化，所述偽影可由非特異性結(jié)合導(dǎo)致。具有極少沉淀或者沒有沉淀的溶液也可將可存在于樣品中的偽影最小化。
[0188]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約0.05%(例如，約0.075%、約0.1%、約0.2%、約0.3%,或者約0.4%)至約0.5%(例如，約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%，或者約0.075%)液體表面活性劑(以體積計)或者固體表面活性劑(以重量計)。在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約0.5至約2mL/L表面活性劑(例如，非離子的表面活性劑)。例如，第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約lml/L聚山梨酯20(例如，吐溫20)。
[0189]表面活性劑可為非離子的、陽離子的、陰離子的或者兩性離子的。也可使用表面活性劑混合物。表面活性劑的示例性類別包括醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、烷醇酰胺、烷基磺酸鹽、胺氧化物、兩性表面活性劑、陰離子表面活性劑、甜菜堿衍生物、陽離子表面活性劑、二磺酸鹽、十二烷基苯、橫酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酌.、乙氧基化脂肪酸、甘油酷助水溶物、月桂基硫酸鹽、單甘油酯和二甘油酯、非離子的表面活性劑、磷酸酯、季銨表面活性劑和脫水山梨糖醇衍生物。示例性表面活性劑前面在標(biāo)題為“固定溶液”的段落下提供。
[0190]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含將染料與細(xì)胞組分的非特異性結(jié)合最小化的試劑，例如乙二醇、丙二醇、聚乙二醇。在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約0.5%(例如，約0.75%、約1%、約2%、約3%，或者約4%)至約5%(例如，約4%、約3%、約2%、約1%，或者約0.75%)液體非特異性結(jié)合最小化試劑(以體積計)，或者固體非特異性結(jié)合最小化試劑(以重量計)。例如，第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約5mL/L (例如，約 10mL/L、約 15mL/L、約 20mL/L、約 25mL/L、約 30mL/L、約 35mL/L、約 40mL/L，或者約 45mL/L)至約 50mL/L (例如，約 45mL/L、約 40mL/L、約 35mL/L、約 30mL/L、約 25mL/L、約20mL/L、約15mL/L，或者約10mL/L)乙二醇。在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約10mL/L (例如，約15mL/L、約20mL/L，或者約25mL/L)乙二醇。
[0191]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含緩沖劑。緩沖劑的實(shí)例包括bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、HEPES, MES、Tris和pH為約5至約8的有機(jī)緩沖劑。第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約5mM(例如，約25mM、約50mM、約IOOmM、約150mM，或者約200mM)至約250mM(例如，約200mM、約150mM、約100mM、約50mM，或者約25mM)緩沖劑。例如，第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約50mM bis-tris。在一些實(shí)施方案中，在第二染色劑溶液中的緩沖劑與在第一染色劑溶液中的緩沖劑相同，以提高在染色劑溶液之間的相容性。
[0192]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含鹽，例如氯化鈉、氯化鉀、乙酸鈉、氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈉、硫酸鎂和硫酸銨。第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約lg/L(例如，約 2g/L、約 5g/L、約 10g/L,或者約 15g/L)至約 20g/L(例如，約 15g/L、約 10g/L、約 5g/L,或者約2g/L)的鹽濃度。例如，第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含約4g/L (約3g/L或者約2g/L)鹽，例如氯化鈉。例如，第二染色溶液可包含約2g/L (例如，約3g/L，或者約4g/L)鹽，例如氯化鈉。鹽可減少細(xì)胞學(xué)染料與試樣的非特異性結(jié)合。不希望被任何理論束縛，據(jù)信，通過例如與試樣中的帶電物質(zhì)結(jié)合，鹽的陰離子和陽離子可屏蔽在染料和試樣之間的非特異性電荷-電荷相互作用。
[0193]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地包含抗微生物劑?？刮⑸飫┛梢种莆⑸锏纳L和提高染色溶液的貯存期限?？刮⑸飫┛砂ū皆蠕@、5-氯-2-甲基-4-異噻唑
啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、ProCMne (例如，ProClin 3()085;)、疊氮化物、硫
柳汞類和/或抗生素。在一些實(shí)施方案中，所述抗微生物劑包括5-氯-2-甲基-4-異噻
唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。例如，抗微生物劑可為ProClin'.300，其可含
有在惰性溶劑(例如，改性乙二醇和羧酸烷基酯)中的約2.3%5-氯-2-甲基-4-異噻唑琳-3-麗和約0.7%2_甲基-4-異嚷唑琳_3_麗，可得自Sigma-Aldrich。第一和第二染色劑溶液可各自獨(dú)立地包含濃度為約0.2ppm(例如，約lppm、約5ppm、約lOppm、約20ppm、約30ppm，或者約 40ppm)至約 50ppm(例如約 40ppm、約 30ppm、約 20ppm、約 lOppm、約 5ppm，或者約lppm)的抗微生物劑。在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地含
有約 15ppm(約 lOppm、約 5ppm,或者約 2ppm) ProCIin 300'
[0194]在一些實(shí)施方案中，所述第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地進(jìn)一步含有調(diào)節(jié)pH的酸。酸可為常用于調(diào)節(jié)溶液PH的任何酸。例如，可使用乙酸、硝酸、鹽酸、磷酸、甲酸、硫酸，或者檸檬酸。
[0195]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地具有約5至約8 (例如，約5.5至約8，約5.5至約7.5，約5.5至約7，約5.5至約6，約5.8至約6.2，約5.9至約6.1，約6，或者約7的pH)的pH。在一些實(shí)施方案中，以1:500第一染色溶液與水的水中稀釋度，第一染色溶液可在約510至約530nm (例如，約510至約520nm，或者約515至約517nm)的最大峰值波長具有約0.1至約I (例如，約0.1至約0.8，約0.1至約0.7，約0.1至約0.5，約0.1至約0.4，約0.1至約0.3，約0.15至約0.3，約0.15至約0.2，約0.185至約0.205、約0.19，或者約0.2)的吸光度。在一些實(shí)施方案中，以1:1000第二染色溶液與水的稀釋度，第二染色溶液可在約630至約660nm(例如，約640至約660nm、約640至約655nm、約645至約655nm、約650至約655nm，或者約650.5至約652.5nm)的峰值波長具有約0.1至約I (例如，約0.1至約0.8，約0.1至約0.7，約0.1至約0.5，約0.1至約0.4，約0.1至約0.3，約0.15至約0.3，約0.15至約0.2，約0.185至約0.205、約0.19，或者約0.2)的吸光度。
[0196]在一些實(shí)施方案中，為制備第一或者第二染色溶液，首先將蒸餾水或者去離子水添加至混合容器，達(dá)到最終希望體積的少于100%(例如，約90%)?？蓪⒂嬎懔康姆翘禺愋越Y(jié)合最小化試劑(例如，乙二醇)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20)、一種或者多種細(xì)胞學(xué)染料(例如，曙紅Y，或者天青B和亞甲藍(lán))、鹽(例如，NaCl)、抗微生物劑(例如，
ProClin 300_'_)、酸(例如，乙酸)和/或緩沖劑(例如，bis tris)添加至水。此外,可添
加水，以使溶液達(dá)到最終希望體積?？蓪⒒旌衔镉么帕嚢璋?攪拌子和/或葉輪混合最少約30分鐘。在混合后，使用pH計(例如，Mettler pH計)在第一或者第二染色溶液的等分試樣上讀取pH。在一些實(shí)施方案中，如果pH不在希望范圍(例如，5至8)內(nèi)，那么可將其它酸添加至第一或者第二染色溶液，直到得到希望的pH。
[0197]可使用UV-分光光度計(例如，Hitachi UV-分光光度計)測量第一染色溶液吸光度。首先可在分光光度計上運(yùn)行基線。例如，可將第一染色溶液的IOmL樣品經(jīng)0.45 μ m注射器式濾器濾過，用蒸餾水以1:500稀釋，然后在分光光度計上在500-700nm之間掃描。可記錄在510至530nm的吸光度。包含曙紅Y的第一染色溶液的代表性UV-Vis吸收光譜例如在圖4中示出。如果需要，可將另外的細(xì)胞學(xué)染料添加至第一染色溶液以使吸光度達(dá)到希望的范圍。如果將另外的細(xì)胞學(xué)染料(例如，曙紅)添加至第一染色溶液，那么可將溶液混合最少約30分鐘，并可重復(fù)測量過程(例如，過濾IOmL等分試樣，在蒸餾水中以1:500的比率稀釋等分試樣，并進(jìn)行吸光度測量)。溶液的pH可通過上面方法重新測量并調(diào)節(jié)至pH 5-8(如果需要的話)。
[0198]可使用UV-分光光度計(例如，Hitachi UV-分光光度計)測量第二染色溶液吸光度。首先可在分光光度計上運(yùn)行基線?？蓪⒌诙旧芤旱腎OmL樣品經(jīng)0.45 μ m注射器式濾器濾過，用蒸餾水以1:1000稀釋，然后在分光光度計上在500-70011111之間掃描。可記錄630-660nm的吸光度。包含1:1亞甲藍(lán)與天青B的第二染色溶液的代表性UV-Vis吸收光譜例如在圖6中示出。如果需要，可將另外的細(xì)胞學(xué)染料添加至第二染色溶液，以使吸光度達(dá)到希望的范圍。也可將一部分濾過的樣品使用高效液相色譜法(HPLC)色譜處理，并可記錄對應(yīng)于樣品中的每種染料的最高吸收峰的面積。在不同染料組分之間的峰面積可為大約相等。
[0199]如果第二染色溶液中的染料的HPLC峰面積不是大約相等，那么可將另外的細(xì)胞學(xué)染料(例如，天青B和/或亞甲藍(lán))添加至第二染色溶液，直到溶液可包含約相等量(如通過峰面積評估)的每種染料。在添加一種或者多種染料后，可將第二染色溶液最少混合約30分鐘，并可重復(fù)測量過程(例如，過濾IOmL等分試樣，在蒸餾水中以1:500的比率稀釋等分試樣，并進(jìn)行吸光度和HPLC測量)。溶液的pH可通過上述方法重新測量并調(diào)節(jié)至希望的范圍(如果需要的話)。
[0200]最后，可將第一和第二染色溶液各自獨(dú)立地經(jīng)0.45 μ m濾器濾過，以在裝瓶之前除去任何微粒。在一些實(shí)施方案中，可使用較細(xì)或者較粗的濾器。例如，可使用0.1至I μ m濾器(例如，0.2 μ m濾器、0.4 μ m濾器，或者0.8 μ m濾器)除去第一或者第二染色溶液中的任何微生物和/或微粒。在一些實(shí)施方案中，可將所述第一或者第二染色溶液各自獨(dú)立地貯存在250mL瓶中并裝填至250g±lg，如通過天平測量?？蓽y量最終產(chǎn)物的pH，如果希望的話。在一些實(shí)施方案中，可得到第一染色溶液的HPLC色譜圖，例如，用于評估溶液純度。在一些實(shí)施方案中，可得到第二染色溶液的HPLC色譜圖，例如，用于評估溶液純度和/或得到溶液中的染料比率。
[0201]在一些實(shí)施方案中，第一染色溶液可染色試樣的某些細(xì)胞，所述試樣由例如血液樣品(例如，嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞)制備。第一染色溶液可含有bis-tris緩沖劑，并且所得染色溶液可提供較紅顏色和視覺上更愉悅的染色試樣。bis-tris緩沖劑可與曙紅Y相容。在一些實(shí)施方案中，天青B包含在超過一種制劑中，例如包含在固定溶液和第二染色溶液中。當(dāng)試樣超過一次暴露于天青B時，據(jù)信，相比于單次暴露于天青B，可發(fā)生較好的試樣染色。
[0202]第一和第二染色溶液可各自獨(dú)立地含有NaCl和乙二醇，其結(jié)合起來可提供對非特異性結(jié)合的協(xié)同屏蔽效果，即，與含有相等濃度的NaCl或者乙二醇的制劑相比，其中含有NaCl和乙二醇的制劑可具有較少的非特異性結(jié)合。例如，包含NaCl和乙二醇的制劑可提供與剩余核相比較淺顏色的核仁，而不含NaCl和乙二醇的制劑可提供均一的深色核(darknucleus) 0在一些實(shí)施方案中，相比于不含NaCl的染色溶液，包含NaCl的染色溶液可具有降低的背景染色。
[0203]例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L至約5.0g/L曙紅Y ;約5禮至約250mMbis-tris或者磷酸鹽緩沖劑；約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約lg/L至約20g/L氯
化鈉；約5mL/L至約50mL/L乙二醇；約0.2ppm至約50ppmProClin 300?；乙酸;和水，其中
所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
`[0204]作為另一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.6g/L至約0.9g/L曙紅Y ;約45mM至約55mM bis-tris緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約3g/L至約5g/L氯
化鈉；約9mL/L至約llmL/L乙二醇；約IOppm至約20ppm ProClin 300?；乙酸;和水，其中
所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0205]例如，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM bis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約4g/L氯化鈉；約I OmL/L乙二醇；約15ppm ProCiin 300^；乙酸;和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0206]作為另一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mMbis_tris緩沖劑;約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約6§/1氯化鈉j^20mL/L乙二醇;約15ppm ProClin 300?；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0207]作為又一實(shí)例，第一細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.75g/L曙紅Y ;約50mM磷酸鹽緩沖劑；約 2.0mL/L聚山梨酯 20 ^4g/L氯化鈉 ^50mL/L 乙二醇；約 15ppm ProC’iin 300":乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約5.8至約6.2。
[0208]例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.25至約2.5g/L天青B ;約0.25g/L至約0.5g/L 亞甲藍(lán)；約 5mM 至約 250mM bis-tris 或者 HEPES 緩沖劑；約 0.5mL/L 至約 2.0mL/L聚山梨酯20、約lg/L至約20g/L氯化鈉和約0.2ppm至約50ppmProClill 300*；乙酸；和水，其中所述溶液的pH為約6.8至約7.2。
[0209]作為另一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.4至約0.6g/L天青B ;約0.4g/L至約0.5g/L亞甲藍(lán)；約45mM至約55mM bis-tris緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨
酯20、約1.8g/L至約2.2g/L氯化鈉和約IOppm至約20ppmProClin 300?；乙酸；和水，其
中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0210]例如，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B ;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mMbis-tris緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約15ppm ProClin 300+*;乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0211]作為另一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mM HEPES緩沖劑；約0.5mL/L聚山梨酯20、約2g/L氯化鈉和約15ppm ProClin 300*；乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0212]作為又一實(shí)例，第二細(xì)胞學(xué)染色溶液可包含約0.5g/L天青B;約0.45g/L亞甲藍(lán)；約50mM HEPES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20、約lg/L氯化鈉和約15ppm PioCIin 300 ；；
乙酸；和水，其中所述溶液的PH為約6.8至約7.2。
[0213]漂洗溶液
[0214]通常，漂洗溶液可為水溶液。溶劑可包含蒸餾水或者去離子水。漂洗溶液可包含非特異性結(jié)合最小化試劑，例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸、聚乙烯醇、聚糖和/或其它親水性水溶性聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述非特異性結(jié)合最小化試劑可包含乙二醇或者丙二醇。不希望被任何理論束縛，據(jù)信，非特異性結(jié)合最小化試劑可制備在樣品制備期間用于干燥過程的試樣。非特異性結(jié)合最小化試劑可在整個試樣上提供漆并可向試樣提供增強(qiáng)的外觀。在漂洗溶液中非特異性結(jié)合最小化試劑的濃度可為約lg/L(例如，約2g/L、約 3g/L、約 4g/L、約 5g/L、約 6g/L、約 7g/L、約 8g/L,或者約 9g/L)至約 10g/L (例如，約9g/L、約8g/L、約7g/L、約6g/L、約5g/L、約4g/L、約3g/L，或者約2g/L)。例如，漂洗溶液可包含約5g/L聚乙二醇(例如，聚乙二醇1450)。
[0215]漂洗溶液可包含表面活性劑。不希望被任何理論束縛，據(jù)信，表面活性劑降低溶劑的表面張力，并可提供溶液在樣品基底上的良好鋪展能力。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑為非離子的，并可將溶液組分沉淀的可能性最小化，所述沉淀可例如由與制劑中的組分如離子電荷染料的離子相互作用導(dǎo)致。具有極少沉淀物或者沒有沉淀物的溶液可更容易從分配噴嘴排出，并可降低分配噴嘴阻塞的可能性或者液體流變小的可能性。在一些實(shí)施方案中，所述表面活性劑可降低非特異性結(jié)合的可能性，或者將偽影最小化，所述偽影可作為非特異性結(jié)合的結(jié)果發(fā)生。具有極少沉淀物或者沒有沉淀物的溶液可將可存在于試樣中的偽影最小化。
[0216]漂洗溶液可包含約0.05% (例如，約0.075%、約0.1%、約0.2%、約0.3%，或者約0.4%)至約0.5%(例如，約0.4%、約0.3%、約0.2%、約0.1%，或者約0.075%)液體表面活性劑(以體積計)或者固體表面活性劑(以重量計)。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液可包含約0.5至約2mL/L表面活性劑(例如，非離子的表面活性劑)。例如，漂洗溶液可包含約lml/L聚山梨酯20 (例如，吐溫20)。
[0217]表面活性劑可為非離子的、陽離子的、陰離子的或者兩性離子的。也可使用表面活性劑混合物。表面活性劑的示例性類別包括醇醚硫酸鹽、醇硫酸鹽、烷醇酰胺、烷基磺酸鹽、胺氧化物、兩性表面活性劑、陰離子表面活性劑、甜菜堿衍生物、陽離子表面活性劑、二磺酸鹽、十二烷基苯、橫酸、乙氧基化醇、乙氧基化烷基酌.、乙氧基化脂肪酸、甘油酷助水溶物、月桂基硫酸鹽、單甘油酯和二甘油酯、非離子的表面活性劑、磷酸酯、季銨表面活性劑和脫水山梨糖醇衍生物。示例性表面活性劑如前面在標(biāo)題為“固定溶液”的部分下提供。
[0218]漂洗溶液可包含緩沖劑。緩沖劑的實(shí)例包括HEPES緩沖劑(例如，HEPES鈉鹽和/或HEPES游離酸)、bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、MES、Tris和pH為5至8的有機(jī)緩沖劑。漂洗溶液可包含約5mM(例如，約25mM、約50mM、約IOOmM、約150mM，或者約200mM)至約250mM(例如，約200mM、約150mM、約100mM、約50mM，或者約25mM)緩沖劑。例如，漂洗溶液可包含約50mM HEPES0
[0219]漂洗溶液可包含抗微生物劑。抗微生物劑可抑制微生物生長和提高漂洗溶液的貯存期限?？刮⑸飫┛砂ū皆蠕@、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異
噻唑啉-3-酮、ProCIin^ProCiin 300?),疊氮化物、硫柳汞類和/或抗生素。在一些實(shí)
施方案中，所述抗微生物劑包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑
啉-3-酮。例如，抗微生物劑可為ProClin 300'其可含有在惰性溶劑(例如，改性乙二醇
和羧酸烷基酯)中的約2.3%5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和約0.7%2-甲基_4_異噻唑啉-3-酮,可得自Sigma-Aldrich?？刮⑸飫┑拇嬖跐舛瓤蔀榧s0.2ppm(例如，約lppm、約 5ppm、約 lOppm、約 20ppm、約 30ppm,或者約 40ppm)至約 50ppm(例如約 40ppm、約30ppm、約20ppm、約lOppm、約5ppm,或者約lppm)。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液含有
約 15ppm(約 lOppm、約 5ppm,或者約 2ppm) ProClin 300?。
[0220]在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液還包含酸以調(diào)節(jié)pH。酸可為常用于調(diào)節(jié)溶液pH的任何酸。例如，可使用乙酸、硝酸、鹽酸、磷酸、甲酸、硫酸，或者檸檬酸。
[0221]漂洗溶液可包含醇，例如甲醇、乙醇，或者丙醇。醇可除去過量染料，可促進(jìn)漂洗溶液在試樣和/或基底上的較快干燥。在一些實(shí)施方案中，DMSO或者其它有機(jī)溶劑(染料在其中可溶)可在漂洗溶液中使用并可提供從遞送噴嘴的完全流體排出。例如，漂洗溶液可包含約 10mL/L(例如，約 25mL/L、約 50mL/L、約 75mL/L、約 100mL/L、約 125mL/L、約 150mL/L，或者約 175mL/L)至約 200mL/L (例如，約 175mL/L、約 150mL/L、約 125mL/L、約 100mL/L、約75mL/L、約50mL/L，或者約25mL/L)醇。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含約50mL/L甲醇。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液可具有至多約200mL/L有機(jī)溶劑，使得漂洗溶液不能從染色生物樣品洗滌過量的希望的染料。
[0222]漂洗溶液的pH可為約5至約8 (例如,約5.5至約8,約5.5至約7.5,約5.5至約7，約5.5至約6，約5.8至約6.2，約5.9至約6.1，約7.0,或者約6.0的pH)。例如，漂洗溶液的pH可為約7.0。
[0223]為制備漂洗溶液，可將蒸餾水或者去離子水添加至混合容器，達(dá)到最終希望體積的少于100%(例如，約90%)?？蓪⒂嬎懔康拇?例如，甲醇)、非特異性結(jié)合最小化試劑(例如，PEG)、緩沖劑(例如，HEPES鈉鹽和HEPES游離酸)、表面活性劑(例如，聚山梨酯20)、酸(如果使用的話)和抗微生物劑(例如，ProCIin 300.)添加至水。可添加另外的水以
使溶液達(dá)到最終希望體積?？蓪⒒旌衔镉么帕嚢璋?攪拌子和/或葉輪混合至少約30分鐘。在混合后，pH可在漂洗溶液的等分試樣上使用pH計(例如，Mettler pH計)讀取。在一些實(shí)施方案中，如果PH不在希望范圍(例如，約5至約8)內(nèi)，那么可將其它酸添加至第二染色溶液，直到得到希望的pH。
[0224]最后，可將漂洗溶液經(jīng)0.45 μ m濾器濾過，以在裝瓶之前除去任何微粒。在一些實(shí)施方案中，可使用較細(xì)或者較粗濾器。例如，可使用0.1至I μ m濾器(例如，0.2 μ m濾器、0.4 μ m濾器，或者0.8 μ m濾器)除去漂洗溶液中的任何微生物和/或微粒。在一些實(shí)施方案中，可將所述漂洗溶液貯存在500mL瓶中并裝填至500g±lg，如通過天平測量?？蓽y量最終產(chǎn)物的pH，如果希望的話。
[0225]在一些實(shí)施方案中，與用不含聚乙二醇的漂洗溶液處理的試樣相比，在染色應(yīng)用結(jié)束時施用的包含聚乙二醇的漂洗溶液可改善試樣的外觀。在一些實(shí)施方案中，通過提供在紅色和藍(lán)色之間較好的顏色平衡，pH為約6.8的包含HEPES緩沖劑的漂洗溶液可改善細(xì)胞如紅細(xì)胞的外觀。
[0226]在一些實(shí)施方案中，漂洗溶液的組分的存在濃度可低于上述濃度(例如，低于5倍)。
[0227]漂洗溶液的聚乙二醇組分的濃度可為約0.2g/L(例如，約0.4g/L、約0.6g/L、約0.8g/L、約 lg/L、約 1.2g/L、約 1.4g/L、約 1.6g/L，或者約 1.8g/L)至約 2g/L。例如，漂洗溶液可包含約lg/L聚乙二醇(例如，聚乙二醇1450)。
[0228]漂洗溶液可包含約0.01%(例如，約0.015%、約0.02%、約0.04%、約0.06%,或者約0.8%)至約0.1%液體表面活性劑(以體積計)或者固體表面活性劑(以重量計)。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液可包含約0.0501%至0.306%表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液可包含約0.1至約0.4mL/L表面活性劑(例如，非離子的表面活性劑)。例如，漂洗溶液可包含約0.2ml/L聚山梨酯20 (例如，吐溫20)。
[0229]漂洗溶液可包含約ImM (例如，約5mM、約10mM、約20mM、約30mM，或者約40mM)至約50mM緩沖劑。例如，漂洗溶液可包含約lOmMHEPES。
[0230]抗微生物劑的存在濃度可為約0.04ppm(例如，約0.2ppm、約lppm、約2ppm、約5ppm、約6ppm,或者約8ppm)至約lOppm。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液含有約3ppm(約
2ppm、約 lppm,或者約 0.4ppm) ProClin 300?。
[0231]漂洗溶液可包含約2mL/L (例如，約5mL/L、約10mL/L、約15mL/L、約20mL/L、約25mL/L、約30mL/L，或者約35mL/L)至約40mL/L醇。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液包含約10mL/L甲醇。在一些實(shí)施方案中，所述漂洗溶液可具有至多約40mL/L有機(jī)溶劑，使得漂洗溶液不能從染色生物樣品洗滌過量的希望的染料。
[0232]例如，漂洗溶液可包含約0.2g/L至約10g/L聚乙二醇；約ImM至約250mM HEPES、MES,或者bis-tris緩沖劑；約0.lmL/L至約2.40mL/L聚山梨酯20 ;約0.04ppm至約
50ppm ProClin 300*；約9mL/L至約200mL/L甲醇；和水,其中所述漂洗溶液的pH為約6.6
至約7.0。
[0233]例如，漂洗溶液可包含約lg/L至約10g/L聚乙二醇；約5mM至約250mM HEPES、MES,或者bis-tris緩沖劑；約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ;約0.2ppm至約50ppm ProClin 3 UO ；約I OmL/L至約200mL/L甲醇;和水,其中所述漂洗溶液的pH為約
6.6 至約 7.0。
[0234]作為另一實(shí)例，漂洗溶液可包含約4.5g/L至約5.5g/L聚乙二醇；約45mM至約55mM HEPES緩沖劑；約0.8mL/L至約1.2mL/L聚山梨酯20 ;約IOppm至約
20ppm ProClin 3OOfli;約45mL/L至約55mL/L甲醇；和水,其中所述漂洗溶液的pH為約6.6
至約7.0。
[0235]例如，漂洗溶液包含約5g/L聚乙二醇；約50mM HEPES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約15ppm ProClie 300'*；約50mL/L甲醇；和水,其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約
7.0。
[0236]作為另一實(shí)例，漂洗溶液包含約10g/L聚乙二醇；約50mM MES緩沖劑；約lmL/L聚山梨酯20 ;約15ppm ProClin 300?；約50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6 至約 7.0。
[0237]作為又一實(shí)例，漂洗溶液包含約10g/L聚乙二醇；約50mM bis-tris緩沖劑；約0.5mL/L聚山梨酯20 ;約15ppmProCim 300?；約50mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0238]例如，漂洗溶液 可包含約0.2g/L至約2g/L聚乙二醇；約ImM至約50mM HEPES緩沖劑；約 0.16mL/L 至約 0.24mL/L 聚山梨酯 20 ;約 0.04ppm 至約 IOppm ProClin 300*；約
9mL/L至約llmL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0239]作為另一實(shí)例，漂洗溶液可包含約0.9g/L至約1.lg/L聚乙二醇；約9禮至約IlmM
HEPES 緩沖劑;約0.16mL/L 至約 0.24mL/L 聚山梨酯 20 ^2ppm 至約 IOppm ProClin 300?;
約9mL/L至約llmL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約6.6至約7.0。
[0240]在又一實(shí)例中，漂洗溶液包含約lg/L聚乙二醇；約IOmM HEPES緩沖劑；約0.2mL/
L聚山梨酯20 ;約3ppmProCiin 300?；約10mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為約
6.6 至約 7.0。
[0241]試劑盒
[0242]在一些實(shí)施方案中，試劑盒可包含一瓶或者多瓶固定溶液、第一染色溶液、第二染色溶液和/或漂洗溶液中的每種。試劑盒可包含使用說明書和標(biāo)簽。標(biāo)簽可包括例如批次信息和有效期。圖25顯示包含固定溶液、第一和第二染色溶液和漂洗溶液的試劑盒的實(shí)例。
[0243]在一些實(shí)施方案中，所述加工步驟包括施用固定溶液，施用固定溶液，施用第一染色溶液，施用第二染色溶液，施用漂洗溶液，并施用漂洗溶液。
[0244]試樣制備系統(tǒng)和方法
[0245]上面的固定、染色和漂洗制劑可在裝置或者機(jī)器中用于制備試樣(例如，如2011年11月9日提交的美國申請13/293,050中所述，將其全部內(nèi)容并入本申請作為參考)，以增強(qiáng)試樣中的某些特征的可視外觀。圖7示出裝置或者機(jī)器I的實(shí)施方案，所述裝置或者機(jī)器I用于在基底2如顯微鏡載玻片、蓋玻片或者其它透明表面上制備用于檢查或者成像的試樣。可將機(jī)器I結(jié)合至整體系統(tǒng)中，所述整體系統(tǒng)用于制備和分析包含體液或者含有細(xì)胞的其它生物樣品的試樣，例如在圖21中示出并且下述的系統(tǒng)2000。通常，機(jī)器I可包括以下系統(tǒng)，或者形成以下系統(tǒng)的一部分，所述系統(tǒng)的特征在于得到試樣的第一站、將試樣施用至基底的第二站、分別用于固定和染色試樣的第三和第四站、干燥試樣的第五站、成像試樣的第六站和分析得自試樣的圖像和數(shù)據(jù)的第七站。機(jī)器I的某些實(shí)施方案與系統(tǒng)2000相容；機(jī)器I的一些實(shí)施方案可用于其它試樣制備系統(tǒng)和/或用作獨(dú)立設(shè)備。
[0246]通常,機(jī)器I可包括一個或者多個(例如，2、3、4、5，或者超過5)如圖7_9中所示的用于試樣加工的平臺60A和60B。如圖8中所示，平臺60A可包括用于支撐平臺頂面的側(cè)面。圖7和9中所示的屏蔽物100可位于平臺60A和60B之間以防止流體在平臺60之間的潑濺。在一些實(shí)施方案中，屏蔽物100可由透明材料形成，其阻礙平臺60A和60B中的一個的流體污染另一平臺。在某些實(shí)施方案中，屏蔽物100可由半透明的或者不透明的材料形成。在圖7和9中，將屏蔽物100表示為由透明材料形成，以允許在同一圖中顯示位于屏蔽物100后面的其它構(gòu)件。也可將屏蔽物100顯示為由不透明材料形成，在這種情況中，一些構(gòu)件如平臺60A和模塊80A的部分會被掩蔽。
[0247]圖9B顯示索引機(jī)構(gòu)50A，其可用于調(diào)動機(jī)器I以提供從每個基底夾持器20A、20B至試樣加工位置的基底2。索引機(jī)構(gòu)50A可呈許多形式，例如機(jī)電設(shè)備(例如，由電動機(jī)提供動力的齒條和小齒輪組)、線性致動器(例如，氣動致動器、液壓致動器，或者電磁致動器)。盡管在所示實(shí)施方案中，索引機(jī)構(gòu)50A在兩個位置之間線性地調(diào)動機(jī)器1，但是其它調(diào)動路線也是可能的，這是基于在機(jī)器I上包括的平臺數(shù)目和它們的構(gòu)造和布局，例如圓形或者半圓形(例如，可在弓形路線中移動的分度臺)。如圖中所示，索引機(jī)構(gòu)50A可包括與機(jī)器I的基座50C連接的齒條50B和與固定至基座50C的電動機(jī)50E連接的小齒輪50D。機(jī)器I可使用一個或者多個滑動設(shè)備50F連接至基座50C，使得當(dāng)由索引機(jī)構(gòu)50A調(diào)動時，機(jī)器I可平滑地移動。在使用中，索引機(jī)構(gòu)50A可移動機(jī)器1，使得可向用于樣品加工的基底移動器120提供機(jī)器I的多個基底夾持器20A和/或20B，以從基底移動器120(在圖11中示出)接收基底2，使得布置在基底2上的樣品可通過機(jī)器I制備，以及使得一旦制備，那么基底夾持器20A和/或20B可提供具有制備的樣品的基底2。
[0248]對于具有兩個平臺60A和60B的機(jī)器，如在所示實(shí)施方案中，通常將基底2以可選方式提供至基底移動器120和從基底移動器120提供。在一些實(shí)施方案中，將第一基底2從基底移動器120至第一基底夾持器20A提供，以在第一平臺60A處加工，同時機(jī)器I處于第一位置。當(dāng)?shù)谝换?在第一平臺60A處加工時，索引機(jī)構(gòu)50A可將機(jī)器I調(diào)動至第二位置，使得第二基底夾持器20B可從基底移動器120接收第二基底，以在第二平臺60B處加工。當(dāng)?shù)诙自诘诙脚_60B處加工時，索引機(jī)構(gòu)50A可將機(jī)器I調(diào)動返回至第一位置，使得基底移動器120可從第一基底夾持器20A移除第一基底2。一旦基底2從第一夾持平臺20A移除，可將下一基底提供至第一夾持平臺20A。這種將基底提供至交替夾持平臺的方法可對于超過兩個(例如，3、4、5，或者超過5)平臺實(shí)施，由此提高針對進(jìn)一步評估制備的試樣的生產(chǎn)量。
[0249]平臺60A和60B通常由一種或者多種材料形成，這些材料對于在試樣加工中使用的流體而言是相對化學(xué)惰性的并提供適合的表面張力。可用于形成平臺60A和60B的示例性材料包括工程熱塑性塑料，例如聚甲醛(例如，DuPont制造的[klmZ )、高分子量氟
碳化合物如聚四氟乙烯(PTFE)(例如，DuPont制造的TefloiVK )和金屬如鋁、鋼和鈦，條件
是:將它們提供、制造和/或處理以提供適合的表面張力，其用于幫助均勻分布和限制加工流體至基底2和平臺之間的空間，并同樣允許加工流體的適當(dāng)排出。通過選擇適合的材料，平臺也可有利地將在分布的流體中氣泡或者空間的形成減少或者最小化，并同時維持足夠的表面張力，使得在平臺和基底2之間的間隔的流體泄露減少或者消除。
[0250]通常，平臺60A和60B的表面面積可出于基底處理和流體遞送的目的按需要選擇。諸如平臺60A和60B的表面面積的因素也可影響選擇的基底2的表面面積。例如，在一些實(shí)施方案中，平臺60A的表面面積(例如,面對基底2的平臺60A的表面面積)稍小于面對平臺60A的基底2的表面面積。通過在平臺60A和基底2的相對表面的面積之間維持這種關(guān)系，可減少或者消除從表面之間的區(qū)域的流體泄露。通常，例如，面向基底2的基底60A的表面面積比基底2的表面面積小2%或者更多(例如，3%或者更多，5%或者更多，7%或者更多，10%或者更多，15%或者更多，20%或者更多，25%或者更多，30%或者更多)。
[0251]平臺60A和60B可分別與模塊80A和80B連接。模塊80A包括支撐頂面85A的側(cè)面81A-84A，如圖8中所示。模塊80A和80B可由與用于平臺的材料相同或者相似的材料制
成，包括金屬、陶瓷和/或塑料。因此,諸如Delrin?的材料可用于形成模塊80A和80B，具
體地，在實(shí)施試樣的Romanowsky染色的實(shí)施方案中?？稍趯?shí)施方案中使用的其它材料包括
金屬和Tefbn ;牌聚四氟乙烯涂覆的鋁、鋼，或者鈦。
[0252]在一些實(shí)施方案中，平臺60A和/或60B可升起，如圖7-9中所示。可選擇地，在某些實(shí)施方案中，平臺60A和/或60B可分別與模塊80A和80B的上表面齊平。在任一情況中，機(jī)器I的某些特征以及流體的表面張力和平臺或者模塊的表面能防止過量流體流過平臺60A/60B和/或模塊80A/80B的邊緣。
[0253]如圖7和8中所示，平臺60A可包括偏置70A-70D以在平臺60A和基底2的表面之間提供間隔，并防止基底2接觸平臺60A。平臺60B可包括對應(yīng)的一組偏置71A-71D。偏置可包括支架(standoffs)、銷子(pins)、支柱(pegs)、桿、珠、壁，或者在平臺60A和/或60B和基底2的表面之間提供間隔的其它機(jī)構(gòu)。偏置70A-70D和71A-71D確保當(dāng)基底2接觸偏置時平臺60A和60B和基底2的表面保持基本平行。維持這兩個表面平行的益處是，由此限定在這兩個表面之間包圍的體積并可精確控制。如果兩個表面不基本平行，以及在它們之間的角度改變，那么在它們之間的體積也改變并且不固定和不精確控制。另外，如果這兩個表面不基本平行，那么流體不可均勻地施用至試樣。
[0254]本申請使用的短語“基本平行”意味著，兩個表面完全平行或者接近平行，使得當(dāng)基底2接觸偏置時，基底2的表面平坦度的瑕疵減少或者消除。例如，盡管在基底的制造中非常小心，但是某些基底可能具有瑕疵如扭曲和/或非共面角。在本申請公開的系統(tǒng)和方法中，通過在需要時改善基底2的表面平坦度，偏置的使用幫助校正這些瑕疵，從而在方法中使基底2與平臺60A和60B基本平行。短語“基本平行”涵蓋以下情況:其中兩個表面不完全平坦，但是偏置全部具有相同尺寸或者高度，使得具有偏置的基底的表面的接觸點(diǎn)至少在相同平面內(nèi)。[0255]圖12A顯示基底2、基底夾持器20B、模塊80A、80B、平臺60A、60B、偏置70A-70D和71A-71D和在基底2和平臺60B之間的間隔92。間隔92允許流體在含有端口 40B-45B的平臺60B和基底2的表面之間行進(jìn)。最佳試樣固定、染色和漂洗所需要的間隔距離將取決于以下因素而改變:從端口 40B-45B(和/或端口 40A-45A)分配的流體的流速、端口直徑、在加工期間施用的流體的粘度和從基底、間隔和平臺移除流體可利用的吸力的量。
[0256]在一些實(shí)施方案中，例如，在平臺60B和基底2的表面之間提供約100-200微米的間隔92的偏置使得在實(shí)施方案中包含血細(xì)胞的試樣的固定、染色和漂洗能夠從直徑為500至1，500微米的端口 40B-45B以約50至約300微升/秒的流速分配流體。通常，對于某些實(shí)施方案，間隔92的尺寸或者高度可為約50微米至1，000微米(例如，約50至500微米，約75至250微米，約100至200微米)，條件是:這種實(shí)施方案能夠在試樣加工期間分配和移除流體時克服間隔中的流體的表面張力。另外，在某些實(shí)施方案中，位于平臺60A和/或60B上的端口的直徑可為約125微米至5，000微米。
[0257]圖12B和6C顯示球接機(jī)構(gòu)25，其可用于使基底夾持器20A與平臺60A平行。球接機(jī)構(gòu)25可包括牢固固定至基底夾持器20A的球元件25A、偏轉(zhuǎn)元件25B (例如，彈簧)、牢固連接至基底臂IOA的下插座25C、上插座25D、固定至下插座25C(例如，使用緊固件)的帽25E和固定螺絲25F。在一些實(shí)施方案中，在制造和/或裝配機(jī)器I和基底夾持器20A和/或20B期間，可調(diào)節(jié)球接機(jī)構(gòu)25以補(bǔ)償由于公差疊加或者制造問題可能存在的任何錯位。在一些實(shí)施方案中，為調(diào)節(jié)球接機(jī)構(gòu)25，松開所述固定螺絲25F并將基底臂IOA移動至關(guān)閉位置。由于固定螺絲25F松開，基底夾持器20A在夾持基底2時能夠基本平行于平臺60A，同時基底2沿著接觸偏置70定位?？蛇x擇地，在一些實(shí)施方案中，在平臺60上的偏置的數(shù)目可減少或者完全消除；可在裝配或者校正機(jī)器I期間連同球接機(jī)構(gòu)25臨時使用厚度相當(dāng)于希望的間隔距離的襯墊，以設(shè)置間隔92為用于試樣加工的希望的距離。盡管球接機(jī)構(gòu)25松開，但是偏轉(zhuǎn)元件25B施加力以保持基底夾持器20A半固定至基底臂10A，使得它能夠獨(dú)立移動，但是它不過于松開和不自由移動，從而不干擾機(jī)器I的其它構(gòu)件，或者不導(dǎo)致機(jī)器I的其它構(gòu)件損壞。一旦基底2在關(guān)閉位置被壓緊以使得基底2基本平行于平臺60A，那么固定螺絲25F可擰緊以固定球接機(jī)構(gòu)25。如圖中所示，當(dāng)擰緊時，固定螺絲25F在上插座2?上施加向下的力并由此經(jīng)上插座25D向球元件25A的頂部施加摩擦力。由于下插座25C固定至帽25E，由固定螺絲25F產(chǎn)生的力也抬起下插座25C，使得下插座25C向球元件25A的底側(cè)施加摩擦力，以約束球元件25A在上和下插座25C，25D內(nèi)。一旦約束至球元件25A，那么基底夾持器20A變得固定至基底臂IOA0
[0258]通常，一旦基底夾持器20A用固定螺絲25F定位并約束，那么在正常使用期間不需要再次調(diào)節(jié)球接機(jī)構(gòu)25。然而，如果基底夾持器20A變得錯位并因此球接機(jī)構(gòu)25需要調(diào)節(jié)(例如，由于損壞、機(jī)器修理、性能差，或者其它原因)，那么可將固定螺絲25F松開，可將基底夾持器20A移動至關(guān)閉位置以定位，使得由基底夾持器20A夾持的基底基本平行于平臺60A，然后可將固定螺絲25F緊固以固定球接機(jī)構(gòu)25。
[0259]通常，可配置致動器30A和/或30B以調(diào)節(jié)基底臂IOA和/或IOB的位置，從而改變在平臺60A和/或60B和基底2的表面之間的間隔的范圍。改變這種間隔在允許調(diào)節(jié)分配至每一端口的流體、流速、流體粘度和來自平臺60A和/或60B的排出力(evacuationforces)的實(shí)施方案中提供更大的靈活性。例如，當(dāng)從平臺60A施用的流體從端口直徑為500微米至1，500微米的端口 40A-45A以115微升/秒的流速分配時，100微米間隔92可提供足夠的試樣固定、染色和漂洗?？蛇x擇地，使用在平臺60A和基底2的表面之間的約200微米的間隔92距離，可使用從端口 40A-45A分配的流體的較高流速如140微升/秒以用于試樣加工。
[0260]如上所公開，機(jī)器I可含有一系列端口和管道，用于分配和移除在試樣加工期間施加的流體。以下討論描述與平臺60A相關(guān)的各個端口、管道和其它構(gòu)件，但是類似的想法適用于平臺60B和它的相關(guān)構(gòu)件。圖8顯示圖7中所示裝置的全貌圖，并詳細(xì)顯示平臺60A上的端口 40A-45A和與模塊80A連接的管道50A-55A。管道52A-55A將包含一種或者多種固定劑、染色劑和漂洗溶液的某些流體分布穿過平臺，進(jìn)入間隔中，并到達(dá)基底上。如圖8中所示，平臺60A的頂面包括6個端口 40A-45A，其與管道50A-55A連接。將流體通過一個或者多個泵驅(qū)動經(jīng)過管道和端口到達(dá)基底2上。一個或者多個流體貯存器210A-213A(例如第一染色劑貯存器211A、第二染色劑貯存器212A、固定劑貯存器2IOA和漂洗溶液貯存器213A)，例如，如圖10中所示，可將流體引導(dǎo)至平臺60A和基底2上。圖7_9中所示的端口40A-45A的直徑為約500微米至1，500微米，不過在某些實(shí)施方案中直徑也可較小或者較大。在一些實(shí)施方案中，真空端口 40A和41A的直徑超過流體端口 42A-45A的直徑的兩倍。
[0261]端口 40A-45A中的每個通常專注于特定流體或者真空源。可選擇地，超過一個端口可用于每一流體或者真空源，或者來自各種流體和真空源的多個管道可與位于平臺60A上的單一端口連接。例如，在一些實(shí)施方案中，在平臺60A上僅一個端口可用于廢物去除，但是當(dāng)使用更粘的流體時，單一端口可能無法提供足夠的吸力以從平臺排出殘留流體。因此，在某些實(shí)施方案中理想的是在平臺上的不同位置提供兩個抽吸端口(例如，在平臺的每個末端有一個抽吸端口)，用于去除過量染色劑、固定劑和漂洗流體，如在圖8中用端口40A-41A所示。進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)流體-對-端口構(gòu)造的變化性，在某些實(shí)施方案中，平臺60A上的單一端口可專注于特定染色劑，而在其它實(shí)施方案中，在試樣加工期間使用多個端口以施用染色劑。實(shí)際上，涉及端口數(shù)目、端口位置和分配至每一端口和流體管道的流體的各種組合可在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中使用。
[0262]端口 40A-45A通?？砂葱枰挥谄脚_60A上，以提供向基底2的流體遞送和從基底2的流體去除。通常，流體端口中的每個位于平臺60A上，使得當(dāng)加工試樣時，端口的開口不直接與基底2上的試樣3相鄰或者位于基底2上的試樣3下面。對于試樣和染色劑的某些組合，例如，如果染色劑從直接與試樣3的一部分相鄰或者位于試樣3的一部分下面的端口分配，那么與試樣的其它部分的細(xì)胞相比，較大量的染色劑可施用至該部分(端口附近)的細(xì)胞。結(jié)果，接收較大量染色劑的細(xì)胞在試樣圖像中可顯得較深，并且這種試樣細(xì)胞的不均勻染色可將錯誤引入基于圖像的診斷測量和分析結(jié)果中。因此，將染色劑遞送至試樣3的流體端口可與基底(例如，載玻片)的含試樣區(qū)域隔開一定距離，以改善染色結(jié)果。
[0263]另外，位置彼此相對的端口對，例如，多個端口對的使用也可改善染色均勻性。例如，在一些實(shí)施方案中，使用兩個端口將染色劑遞送至試樣3。兩個端口可位于平臺60A上，與試樣3的邊緣隔開一定距離(例如，偏置)，并在平行于平臺60A的短邊的方向上彼此相對。當(dāng)染色劑從兩個隔開的端口分配時，相對均勻數(shù)量的染色劑沉積于試樣3的不同區(qū)域中的細(xì)胞上，并在試樣圖像中觀察到改善的染色均勻性。
[0264]類似地，盡管端口 40A-45A通?？砂葱枰ㄎ灰允褂靡粋€或者多個真空源從基底2的表面除去過量流體，但是在一些實(shí)施方案中，用于流體去除的端口與平臺60A上的直接在基底2上的試樣3中的細(xì)胞下面的位置隔開一定距離。以此方式定位廢物除去端口可減少當(dāng)促使這種端口從基底2排出流體時，試樣3的細(xì)胞無意地也卷入流體除去端口中的機(jī)會。在某些實(shí)施方案中，由于平臺60A的長邊和短邊的長度差，廢物除去端口與試樣區(qū)域的邊緣隔開并沿著平行于平臺60A的長邊的方向彼此相對設(shè)置。
[0265]機(jī)器I可包括或者連接至圖10中所示的控制系統(tǒng)5，其提供機(jī)器I的另一透視圖。控制系統(tǒng)5可包括一個或者多個計算機(jī)，每個計算機(jī)含有中央處理器，所述中央處理器能夠執(zhí)行存儲在計算機(jī)可讀介質(zhì)如硬盤、光盤或者內(nèi)存上的軟件指令。另外，控制系統(tǒng)5可包括用于執(zhí)行軟件指令的電子電路?？刂葡到y(tǒng)5可包括用戶界面，其用于接收用戶命令以控制機(jī)器I的操作。儲存在計算機(jī)上或者向計算機(jī)提供的軟件可包括程序，其控制在試樣加工期間的機(jī)器I的構(gòu)件的操作，例如流體泵和真空。例如，軟件可包括使用說明書，其指導(dǎo)機(jī)器I將各種固定劑、染色劑和漂洗劑施用至試樣和在試樣加工期間實(shí)施數(shù)個攪動步驟。
[0266]另外，軟件可包括默認(rèn)設(shè)置，以及用戶界面可含有定制特征，用于向用戶提供改變這些默認(rèn)設(shè)置的能力。例如，用戶界面可含有定制特征，用于允許用戶定制固定、染色和漂洗階段的速度、頻率或者次序，以及攪動參數(shù)(下面進(jìn)一步描述)?？刂葡到y(tǒng)5也可經(jīng)網(wǎng)絡(luò)協(xié)議(例如Appletalk?、IPX，或者TCP/IP)通訊。例如，網(wǎng)絡(luò)協(xié)議可使用電纜(例如雙扭線電纜)和/或無線連接如WiFi。控制系統(tǒng)可使用網(wǎng)絡(luò)協(xié)議連接至實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)可含有服務(wù)器和/或數(shù)據(jù)庫，用于儲存涉及在機(jī)器I上加工的試樣的信息。例如，數(shù)據(jù)庫可含有表格，其提供關(guān)于試樣的人或者來源的信息(例如，名稱、出生日期(D0B)、地址、采集試樣的時間、性別等)、涉及試樣加工的信息(加工日期##/##/####、試樣編號#等)、試樣的得到的任何圖像的拷貝和通過分析圖像得到的任何結(jié)果的拷貝。
[0267]圖7還顯示，機(jī)器I可包括支撐物IlOA和IlOB以將設(shè)備固定至系統(tǒng)或者實(shí)驗(yàn)室工作站中的特定位置。機(jī)器I還包括一個或者多個基底臂IOA和10B，其各自在它們的基座處與致動器30A和30B連接?；妆跧OA和IOB的相對末端包括基底夾持器20A和20B，用于在試樣加工期間接收和支持基底。每個基底夾持器20A和20B接收和支持基底2，同時機(jī)器I完成所有試樣加工步驟(下述)?；卓蔀榛蛘甙@微鏡載玻片、蓋玻片，或者適于在試樣加工期間支持試樣并在試樣加工后顯微鏡檢查的其它透明材料。圖7的實(shí)施方案示出玻璃顯微鏡載玻片，基底2，其包括試樣3。通過使用抽吸端口，基底夾持器20A，20B可在試樣加工期間將基底2固定至基底臂10A，IOB0抽吸管道23通過抽吸端口 21A和21B，以及22A和22B(注意，端口 21A和22A在圖7中位于載玻片2后面，并以虛線示出)向基底夾持器20A和20B提供吸力。
[0268]在圖7-9中示出的機(jī)器I實(shí)施方案為雙基底機(jī)器，能夠在基底臂IOA和IOB中的每個上支持和加工基底。為了加工，其它實(shí)施方案提供單一基底或者順序地或者同時地提供三個或者較多個基底。此外，盡管在圖7-12中示出的實(shí)施方案使用吸力使基底2附著于基底臂IOA和10B，但是可選擇的實(shí)施方案在試樣加工期間使用各種類型的夾具、指狀物，或者磁體(如果基底為磁化的)使基底2附著于基底臂10A。
[0269]在圖11和24A-B中示出的實(shí)施方案中，機(jī)器I從自動基底移動器120或者手動地從個人接收攜帶試樣3的基底2。作為實(shí)例，基底移動器120可為在站(例如，站121至站122至站123至站124和至站125)之間運(yùn)輸基底的設(shè)備。圖11顯示系統(tǒng)，其具有第一標(biāo)簽閱讀站121、施用站122、包括機(jī)器I的染色站123、相機(jī)或者成像站124和第二標(biāo)簽閱讀站125。第一標(biāo)簽閱讀站121設(shè)置成閱讀基底2的信息如條形碼和/或“指紋”信息，其用于識別在第一標(biāo)簽閱讀站121上的特定基底2和試樣3。第二標(biāo)簽閱讀站125以相同的方式起作用，以及它閱讀的信息用于識別在站124處成像的試樣3與被加工的基底相同。
[0270]基底移動器120可包括用于保持基底2的夾持器127和使得移動器120能夠測定是否基底2安裝在移動器120中的登記電路或者軟件。在一個實(shí)施方案中，基底移動器120可包括液壓缸，其用于將基底2從第一站121移動至第二站122。在試樣加工后，基底移動器120可從染色站123移除經(jīng)加工的基底并將基底2運(yùn)輸至其它站進(jìn)行基底檢查，例如顯微鏡或者站124?？蛇x擇地，在試樣加工后個人可從機(jī)器I手動移除基底。
[0271]基底臂IOA和IOB可繞軸旋轉(zhuǎn)，以使得基底能夠從用于加載的打開位置移動至試樣加工位置和在試樣加工后返回至打開位置用于卸載。圖13A顯示流程圖500，其包括用于將基底臂從打開位置移動至加工位置的一系列步驟。下面參照圖13B(其顯示機(jī)器I的示意圖)進(jìn)一步描述流程圖500。
[0272]注意，將圖7中的機(jī)器I設(shè)置成接收和檢查兩個基底。在下面的討論和圖中，可僅提及機(jī)器I中的一組構(gòu)件(例如，基底夾持器20A、致動器30A、基底臂IOA等)。然而，應(yīng)理解的是，關(guān)于一組構(gòu)件公開的相同步驟、特征和屬性也可適用于機(jī)器I中的其它組的構(gòu)件(例如，基底夾持器20B、致動器30B、基底臂IOB等)。因此，盡管為了清楚和簡潔本申請的討論僅集中于一組構(gòu)件，但是應(yīng)理解的是，用于試樣檢查的機(jī)器如機(jī)器I可包括兩組或者甚至超過兩組構(gòu)件，每組具有本申請討論的一些或者所有特征。
[0273]返回圖13A和13B，在流程圖500的第一步驟502中，基底移動器120使基底2接觸基底夾持器20A。在步驟504中，基底2以“試樣向上(specimen up)”或者“打開”位置位于基底夾持器上。然后，在步驟506中，致動器30A旋轉(zhuǎn)基底臂IOA約180° (參見圖13B)，以在平臺60A正上方將基底2定位在“試樣向下”或者“試樣加工”或者“關(guān)閉”位置(步驟508)，使得基底2在步驟510中處于加工位置。
[0274]然后，在步驟512中，通過引導(dǎo)從貯存器210A、211A、212A和213A泵送的適合的流體(包含染色劑、漂洗流體和固定劑)通過端口 42A、43A、44A和45A接觸試樣3，機(jī)器I染色位于基底2上的試樣3。過量流體通過真空泵送經(jīng)過端口 40A和41A從試樣3移除，并收集在廢物收集器230和231中。
[0275]在步驟514中，在染色試樣3后，致動器30A旋轉(zhuǎn)基底臂10約180° (逆轉(zhuǎn)步驟506的旋轉(zhuǎn))，以使基底返回至“試樣向上”位置。最后，在步驟516中，基底移動器120從基底夾持器20A移除加工了的基底。也可使用其它打開或者“試樣向上”位置，條件是操作者或者自動基底移動器可從機(jī)器I加載和卸載基底。例如，可將試樣向上位置從試樣加工位置旋轉(zhuǎn)100°或者更大(例如，120°或者更大，130°或者更大，140°或者更大)。在一些實(shí)施方案中，可將試樣向上位置從試樣加工位置旋轉(zhuǎn)少于100° (例如，少于90° ,少于80°，少于70° )，條件是操作者或者基底移動器可從機(jī)器I加載和卸載基底。
[0276]致動器30A和/或30B可包括電動機(jī)、氣動裝置、磁力系統(tǒng)，或者其它部件(例如，蝸輪)，以移動臂IOA和/或10B。當(dāng)基底臂IOA和IOB如圖7中所示處于打開位置時，夾持器20A和20B可各自接收基底2。一旦加載至基底夾持器20A或者20B上，那么致動器30A和/或30B旋轉(zhuǎn)臂IOA和/或10B，并由此將基底2從打開(“試樣向上”)位置旋轉(zhuǎn)至加工位置(“試樣向下”，如在圖9中對于臂IOB所示)以用于施用固定、染色和漂洗(包括攪動步驟)，并在加工后返回至打開位置用于卸載。
[0277]參照圖9A，致動器30B已經(jīng)將基底臂IOB從圖1中所示的打開位置旋轉(zhuǎn)至“關(guān)閉”或者加工位置。圖9A顯示，基底臂IOB上的基底2已經(jīng)從圖7中所示的加載位置翻轉(zhuǎn)和旋轉(zhuǎn)約180°，達(dá)到朝下位置，其中基底2上的試樣3基本平行于平臺60B表面。如上面關(guān)于圖13A所討論，在基底2以所示的試樣加工位置鄰近平臺60B時，機(jī)器I通過數(shù)個加工階段將各種固定劑、染色劑和漂洗劑施用至基底2上的試樣3，其將在下面更詳細(xì)地描述。為從加工位置移除基底2，致動器30B旋轉(zhuǎn)基底臂IOB返回至圖7(兩個臂)和圖9A(其中僅臂IOA處于打開位置)中所示的打開位置。
[0278]在某些實(shí)施方案中，控制系統(tǒng)5可使用一個或者多個傳感器105A和105B檢測臂的位置，以檢測指示臂IOlA和IOlB (如圖7和9中所示)。傳感器105A和105B可為使用例如紅外光或者各種其它技術(shù)(激光、運(yùn)動檢測器等)的接近傳感器(例如，光電傳感器)，以檢測臂的存在或者不存在。例如，接近傳感器105A或者105B可具有檢測領(lǐng)域，并且通過檢測指示臂IOlA和/或101B，傳感器可測定是否基底臂(例如，臂IOA和/或10B)或者基底夾持器(例如，夾持器20A和/或20B)在檢測領(lǐng)域內(nèi)?？刂葡到y(tǒng)5可從傳感器接收信息，以測定基底臂10的位置。例如，當(dāng)基底臂IOB(在圖9中未示出)旋轉(zhuǎn)至加工位置時，在指示臂IOlB的近端上的接近傳感器105B感覺到目標(biāo)基底夾持器20B，并通知控制系統(tǒng)5基底臂IOB旋轉(zhuǎn)至試樣加工位置。在此位置，在指示臂IOlB的遠(yuǎn)端上的接近傳感器105B將不向控制系統(tǒng)5發(fā)送信號，因?yàn)閭鞲衅鳈z測不到任何目標(biāo)(例如，基底臂或者基底夾持器)。
[0279]當(dāng)基底臂IOB旋轉(zhuǎn)至打開位置(如圖7中所示)時，在指示臂IOlB的遠(yuǎn)端上的接近傳感器105B感覺到目標(biāo)基底夾持器20B，并通知控制系統(tǒng)5基底臂IOB旋轉(zhuǎn)至打開位置。換句話說，當(dāng)基底臂IOB從傳感器105B旋轉(zhuǎn)離開時，傳感器向控制系統(tǒng)5發(fā)送“不存在”信號。當(dāng)臂IOB旋轉(zhuǎn)至打開位置時，臂IOB更接近傳感器105B，并且傳感器可向控制系統(tǒng)5發(fā)送“存在”信號。在可選構(gòu)造中，傳感器可安裝在基底IOB上并可檢測指示臂IOlB的存在。在一些實(shí)施方案中，控制系統(tǒng)5可用于校正致動器30A和30B相對于已知打開位置和試樣加工位置的位置和/或主動監(jiān)測基底臂IOA和IOB的移動和位置，基于控制信號和/或從致動器30A和30B接收的反饋。
[0280]在圖7中的基底臂IOA和IOB的結(jié)構(gòu)和旋轉(zhuǎn)軸可在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中改變。圖14A顯示流程圖600，其包括用于將基底臂從打開位置移動至加工位置的一系列可選步驟。下面參照圖14B(其顯示機(jī)器I的示意圖)進(jìn)一步描述流程圖600。
[0281]在流程圖600的步驟602中，基底移動器120將基底2以“試樣向上”取向置于基底夾持器20A上。然后，在步驟604中，第一致動器30A在垂直于圖14B的平面的平面內(nèi)旋轉(zhuǎn)基底2約180°，使得基底2仍然在平臺60A上方以“試樣向上”位置取向。在步驟606中，第二致動器35A接收以“試樣向上”位置取向的基底2。然后，在步驟608中，第二致動器35A(例如，位于基底臂IOA和基底夾持器20A之間)將基底2旋轉(zhuǎn)至“試樣向下”取向。第二致動器35A也可向著平臺60A向下移動基底2，使得基底2接觸偏置70A和70B。
[0282]接著，在基底2處于步驟610中的加工位置的情況下，通過如上面關(guān)于流程圖500的步驟512所討論施用染色劑、固定劑和漂洗溶液，機(jī)器I染色基底2上的試樣3。在染色完成后，第二致動器35A將基底2從“試樣向下”取向旋轉(zhuǎn)至“試樣向上”取向(步驟614)，然后第一致動器30A旋轉(zhuǎn)基底2約180° (例如，在垂直于圖14B的平面的平面內(nèi)，逆轉(zhuǎn)在步驟606中施用的旋轉(zhuǎn))，使得基底仍然以“試樣向上”位置取向。最后，在步驟618中，基底移動器120從基底夾持器20A移除加工了的基底。
[0283]固定階段
[0284]參見圖10，可將流體管道52A-55A和52B-55B定位，以在試樣加工期間將固定劑遞送至平臺60A和60B、間隔92、基底2和試樣3。一個或者多個流體管道52-55A可連接至平臺60A內(nèi)的端口和相應(yīng)的固定劑貯存器210A。流體管道也可包括與泵200A和/或閥的連接，其能夠?qū)⒐潭▌馁A存器引導(dǎo)經(jīng)過管道和位于平臺上的端口，并到達(dá)基底和試樣上。作為實(shí)例，泵200A可將固定溶液引導(dǎo)經(jīng)過管道54A，離開模塊80A，經(jīng)過端口 44A，到達(dá)平臺60A上，進(jìn)入在平臺60A和基底2之間的間隔92，并到達(dá)含有試樣3的基底2上。在將特定數(shù)量的固定溶液施用至基底2后，真空或者其它抽吸源220A和/或22IA可從平臺60A、間隔92和基底2排出殘留固定溶液，經(jīng)端口 40A和/或41A中的一個或者多個，通過廢物管道50A和5IA進(jìn)入廢物容器230A和/或23IA中。
[0285]圖15顯示流程圖700，其包括將固定溶液施用至試樣的一系列步驟。在步驟702中，泵(例如，泵200A)將固定溶液(例如，甲醇)從貯存器(例如，貯存器210A)引導(dǎo)進(jìn)入固定溶液管道(例如，管道54A)中。在步驟704中，將固定溶液引導(dǎo)進(jìn)入與模塊80A連接的端口 44A中。然后，在步驟706中，將固定溶液引導(dǎo)離開平臺60A中的端口 44A。在步驟708中，將固定溶液通過端口 44A導(dǎo)出并進(jìn)入在基底2和平臺60A之間的間隔92中。最后，在步驟710中，將基底2上的試樣3通過固定溶液固定。
[0286]在一些實(shí)施方案中，泵200A以約50 μ L或者更多(例如，75 μ L或者更多，100 μ L或者更多，150 μ L或者更多，200 μ L或者更多，或者250 μ L或者更多)和/或約300 μ L或者更少(例如，250 μ L或者更少,200 μ L或者更少，150 μ L或者更少，100 μ L或者更少，或者75 μ L或者更少)微升/秒的流速引導(dǎo)固定溶液通過管道54Α和端口 44Α，到達(dá)平臺60Α上并進(jìn)入間隔92中，歷時約2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可為約115yL/s(例如，約70 μ L/s、約100 μ L/s，或者約150 μ L/s)，歷時約2秒(例如，3秒，或者4秒)。然后，真空或者其它抽吸源220A和/或221A使用端口 40A和/或41A和廢物管道50A和/或51A (下面進(jìn)一步描述)移除存在于間隔92中和/或平臺60A和基底2上的殘留固定溶液。接下來，泵200A可再次以約50 μ L或者更多(例如，75 μ L或者更多，100 μ L或者更多，150 μ L或者更多，200 μ L或者更多，或者250 μ L或者更多)和/或約300 μ L或者更少(例如，250 μ L或者更少，200 μ L或者更少，150 μ L或者更少，100 μ L或者更少，或者75 μ L或者更少)微升/秒的流速引導(dǎo)固定溶液通過管道54Α和端口 44Α，并到達(dá)平臺60Α上，歷時約2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可為約115 μ L/s (例如，約70 μ L/s、約IOOyL/s，或者約150 μ L/s)，歷時約2秒(例如，3秒，或者4秒)?？蓪⑦@種固定和排出的過程使用相同或者不同固定劑再次重復(fù)，取決于需要固定的試樣類型。此外，機(jī)器I能夠針對每一固定階段改變頻率和流速。也可使用足以克服位于間隔92中的流體中的任何表面張力的其它流速。通過調(diào)節(jié)固定階段的頻率和/或流速，使用數(shù)種不同的固定劑，機(jī)器I可實(shí)現(xiàn)針對不同試樣的最佳固定。用于不同類型試樣的機(jī)器指令可在控制單元5中嵌入固定或者預(yù)先程序化并由系統(tǒng)操作員按需要選擇。
[0287]通常，在固定階段中可將很多種固定劑施用至試樣。例如，可使用85%甲醇作為固定劑。對于一些染色劑，可使用基于乙醇或者甲醛的固定劑。本申請公開的固定溶液的實(shí)施方案可用于制備用于檢查的試樣。
[0288]染色階段
[0289]機(jī)器I也包括管道和端口，其設(shè)置成在一個或者多個染色階段中將一種或者多種染料或者染色劑施用至固定至基底的試樣。當(dāng)在顯微鏡或者其它成像設(shè)備下觀察或者成像時，染色試樣提高試樣的對比度。
[0290]圖16為流程圖800，其包括用于將染色劑施用至試樣的一系列步驟。在步驟802中，泵(例如，泵201A)將染色溶液從貯存器(例如，貯存器211A)引導(dǎo)進(jìn)入染色劑管道(例如，管道52A)中。在步驟804中，將染色溶液引導(dǎo)進(jìn)入與模塊80A連接的端口(例如，端口42A)中。接著，在步驟806中，染色溶液流出平臺60A中的端口 42A。在步驟808中，染色溶液流進(jìn)在基底2和平臺60A之間的間隔92中。最后，在步驟810中，將染色劑施用至基底2上的試樣3。
[0291]在一些實(shí)施方案中，可使用多個管道和端口將染色劑施用至試樣3。例如，第二泵(例如，泵202A)可將染色溶液(例如，與從貯存器211A分配的染色劑相同的染色劑或者不同的染色劑)從貯存器212A引導(dǎo)通過管道53A和端口 43A并到達(dá)平臺60A上。在某些實(shí)施方案中，可將兩個或者更多個流體管道連接至共用的染色劑貯存器或者泵和/或閥，用于引導(dǎo)染色劑通過端口并到達(dá)平臺上。返回參照圖8，管道52A可將紅色染色劑如曙紅Y遞送至平臺、基底3和試樣2。管道53A可遞送藍(lán)色染色劑，例如噻嗪染料(例如，天青B、亞甲藍(lán))。在圖7-12中，選擇在平臺60A上的端口的數(shù)目、位置和尺寸，以將固定至基底的試樣的染色劑的施用最佳化。如果選擇其它染色劑，那么端口的不同數(shù)目、位置和尺寸可為優(yōu)選的，取決于染色劑粘度。
[0292]端口 40A-45A(和40B-45B)中的每個可包括用于接收流體的輸入通道和用于輸出流體的輸出通道。在一些實(shí)施方案中，漂洗端口 45A、固定端口 44A和染色端口 42A-43A的輸出通道在平臺60A的上表面上，以及真空端口 40A和41A的輸入通道可在平臺60A的上表面的相對端上。漂洗端口 45A、固定端口 44A和染色端口 42A-43A的輸入通道可位于模塊80A的相同側(cè)面上，以及真空端口 40A和41A的輸出通道可位于模塊80A的相對側(cè)面上。
[0293]舉例并參照圖8和16，控制系統(tǒng)5指示步驟802中的泵(例如，泵201A)將第一染色溶液(例如，包含曙紅Y的染色劑)從染色劑貯存器導(dǎo)入流體管道52A中。在步驟804中，第一染色溶液從流體管道進(jìn)入端口 42A。然后，在步驟806中，第一染色溶液離開端口42A，以及在步驟808中，第一染色溶液以約50 μ L或者更多(例如，75 μ L或者更多，100 μ L或者更多，150 μ L或者更多，200 μ L或者更多，或者250 μ L或者更多)和/或約300 μ L或者更少(例如，250 μ L或者更少,200 μ L或者更少，150 μ L或者更少，100 μ L或者更少,或者75 μ L或者更少)微升/秒的流速沉積在平臺60Α和基底2之間的間隔92中，歷時約2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可為約115 μ L/s (例如，約70 μ L/s、約100yL/s，或者約150 μ L/s)，歷時約2秒(例如，3秒，或者4秒)。在步驟810中，將基底2上的試樣3用第一染色溶液染色。在染色后,真空或者其它抽吸源(例如,泵220和/或221)可使用端口 40A-41A和廢物管道50A-51A排出存在于間隔92中，平臺60A上和基底3上的殘留第一染色溶液。
[0294]可將機(jī)器I程序化以在第一染色階段后的延遲(例如，3秒-10秒的延遲，例如5秒延遲)后重復(fù)這些染色和排出階段?？赏ㄟ^控制系統(tǒng)5指示第二泵202A以將第二染色溶液(包含噻嗪染料的溶液)從染色劑貯存器以約50 μ L或者更多(例如，75 μ L或者更多，100 μ L或者更多，150 μ L或者更多，200 μ L或者更多，或者250 μ L或者更多)和/或約300 μ L或者更少(例如，250 μ L或者更少，200 μ L或者更少，150 μ L或者更少，100 μ L或者更少，或者75 μ L或者更少)微升/秒的流速引導(dǎo)通過流體管道53Α，離開端口 43Α，歷時約
2(例如，3、4，或者5)秒到達(dá)平臺60Α上。例如，流速可為約115 μ L/s (例如，約70 μ L/s、約100 μ L/s,或者約150 μ L/s)，歷時約2秒(例如，3秒，或者4秒)。然后真空或者其它抽吸源(例如，泵220A和/或221)可使用端口 40A-41A和廢物管道50A-51A排出存在于間隔92中和/或平臺60A上和/或基底2上的殘留第二染色溶液。與固定階段一樣，機(jī)器I能夠針對每一染色階段改變頻率和流速。流速可為例如50-300微升/秒，或者可小于或者大于該范圍的外側(cè)界限(例如，10-500微升/秒)，條件是流速足以克服存在于位于間隔92中的流體中的任何表面張力。
[0295]可施用至試樣的示例性染色劑包括但不限于Wright-Giemsa染色劑、Giemsa染色劑和Romanowsky染色劑,包括本申請公開的第一和第二染色溶液的實(shí)施方案。也可將其它試劑如免疫細(xì)胞化學(xué)試劑或者其它特異性細(xì)胞組分標(biāo)記物施用至試樣。
[0296]廢物流體去除
[0297]如上所述，真空或者其它抽吸源220和/或221可在固定和染色階段期間或者在固定和染色階段之間從基底2、間隔92和平臺60A排出殘留流體。參見圖7，一個或者多個廢物管道可與模塊80A的側(cè)面82A和84A連接。廢物或者真空管道50A和5IA用于將流體和小顆粒物質(zhì)從平臺60A、間隔92和基底2抽出，使其進(jìn)入廢物容器或者與機(jī)器I分離的其它場所。參見圖8，廢物管道51A和51B可在廢物管道的遠(yuǎn)端與分離的真空源220和221以及廢物容器230和231連接。可選擇地，兩個或者更多個廢物管道可連接至單一真空源和相同廢物容器，如圖10中所示。廢物管道50A和50B可分別通過夾管閥(pinch valves)90A和90B延伸。
[0298]真空源或者用于施加抽吸的其它源(例如，真空泵220和/或221)可與廢物管道50A、50B、51A和51B中的一個或者多個連接，以將流體從平臺60A和/或60B、間隔92和基底2抽入廢物容器230和231中。當(dāng)在基底2和平臺之間的間隔為100至200微米時，為除去流體，在廢物管道中施加的真空力可等于負(fù)I至負(fù)5磅/平方英寸(“psi”)，以提供足夠的吸力。通常，本申請使用的“負(fù)”壓力是指小于機(jī)器I中的環(huán)境壓力或者機(jī)器I周圍的環(huán)境壓力的壓力。例如，在一些實(shí)施方案中，機(jī)器I周圍的環(huán)境的環(huán)境空氣壓力為約I個大氣壓?！柏?fù)”壓是指少于這種環(huán)境空氣壓力的壓力(例如，施加至流體的-1psi壓力是比施加在流體上的環(huán)境空氣壓力小Ipsi的壓力)?？墒褂?.1psi至14psi，或者更大的其它真空，條件是這種真空足以克服存在于間隔中的流體中的任何表面張力。另外，在即將施加真空從間隔排出流體之前，致動器30A可將基底2的近邊緣從試樣加工位置提升15-35微米的距離。這種增加的在基底2和平臺60之間的間隔可在真空期間改善間隔92中的任何殘留流體的排出。
[0299]在一些實(shí)施方案中，將控制系統(tǒng)5設(shè)置成在試樣加工期間改變針對流體去除所施加的頻率和真空。圖17A包括流程圖900，其特征在于用于從基底除去過量流體的一系列步驟。在固定階段后，例如，控制系統(tǒng)5可在步驟902中打開夾管閥90A和/或90C并在廢物管道(例如，廢物管道50A和51A)中施加5psi的真空，歷時5秒。在此期間，將固定溶液通過端口 40A和41A從間隔、基底和平臺除去(步驟904)。流體在步驟906中通過廢物管道行進(jìn)，并在步驟908中沉積在一個或者多個廢物容器(例如，容器230和/或231)中。一旦排出期結(jié)束，控制系統(tǒng)5可在步驟910中指示夾管閥90A，90C中的一個或者多個關(guān)閉廢物管道50A和/或51A，由此防止真空220-221導(dǎo)致的進(jìn)一步排出?？刂葡到y(tǒng)5可在每個固定階段后指導(dǎo)機(jī)器I重復(fù)這種流體去除步驟。
[0300]圖17B包括流程圖1000，其特征在于用于從基底除去過量流體的一系列可選步驟。在流程圖1000中的方法不使用夾管閥密封廢物管道。相反，在染色階段后，將抽吸源220和/或221在步驟1002中初始化并在步驟1004中進(jìn)入活動狀態(tài)。在步驟1006中抽吸源在廢物管道50A和/或51A中施加3psi的壓力，歷時4秒，以通過端口 40A和41A從間隔92、基底2和平臺60A除去染色劑。排出的流體在步驟1008中通過廢物管道50A和/或51A行進(jìn)，并在步驟1010中沉積在一個或者多個廢物容器230，231中。機(jī)器I可在每個染色階段后重復(fù)這種流體去除步驟。通過改變在流體去除步驟中施加的頻率和壓力，機(jī)器I可實(shí)現(xiàn)試樣的最佳固定和染色。
[0301]夾管閥90A、90B、90C和90D關(guān)閉廢物管道50A、50B、51A和51B，如圖7中所示。夾管閥90A-90D可通過包括在閥中或者閥外的致動器機(jī)械地、電力地、液壓地，或者氣動地開動。夾管閥90A-90D用于阻止流體流過廢物管道50A、50B、51A和51B。例如，當(dāng)從機(jī)器I改變或者清空充滿的廢物容器230時，關(guān)閉夾管閥(90A-90D)可能是理想的，以防止存在于廢物管道中的殘留流體的泄露。不同閥類型或者其它機(jī)構(gòu)如夾具或者塞子可用于機(jī)器I的實(shí)施方案，以關(guān)閉廢物管道50A、50B、51A和51B。
[0302]漂洗階段
[0303]漂洗溶液可在試樣加工期間用機(jī)器I在一個或者多個漂洗階段中施用。例如，在固定階段之間、在染色階段之間和/或在固定和染色階段之間清洗基底2、間隔92和平臺60A和/或60B可能是理想的。
[0304]圖18包括流程圖1100，其特征在于用于漂洗試樣的一系列步驟。在步驟1102中，泵(例如，泵203A)將漂洗溶液(例如，包含蒸餾水)從貯存器(例如，貯存器213A)引導(dǎo)至漂洗管道(例如，漂洗管道55A)中。在步驟1104中，漂洗溶液進(jìn)入與模塊80A連接的端口 45A。在步驟1106中，漂洗溶液通過端口 45A的輸出通道流至平臺60A上，以及在步驟1108中，漂洗溶液進(jìn)入基底2和平臺60A之間的間隔92。在步驟1110中，實(shí)施試樣3的漂洗。最后，在步驟1112中，真空源220，221向廢物管道50A和51A中的一個或者多個施加吸力，以從間隔92和基底2除去漂洗溶液；將漂洗溶液運(yùn)輸至廢物容器230和/或231。在一些實(shí)施方案中，前述步驟在第二漂洗階段中重復(fù)。
[0305]在一些實(shí)施方案中，控制系統(tǒng)5可指導(dǎo)泵203A以約50 μ L或者更多(例如，75 μ L或者更多，100 μ L或者更多，150 μ L或者更多，200 μ L或者更多，或者250 μ L或者更多)和/或約300 μ L或者更少(例如，250 μ L或者更少，200 μ L或者更少，150 μ L或者更少，100 μ L或者更少，或者75 μ L或者更少)微升/秒的流速施用漂洗溶液，歷時約2 (例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可為約115yL/s(例如，約70yL/s、約100yL/s，或者約150yL/s)，歷時約2秒(例如，3秒，或者4秒)。與固定階段一樣，控制系統(tǒng)5可改變每個漂洗階段的持續(xù)時間和流速和漂洗階段的數(shù)目。另外，控制系統(tǒng)5可在試樣加工期間調(diào)節(jié)一個或者多個漂洗階段的布置。例如，控制系統(tǒng)5可指導(dǎo)，在結(jié)束所有固定階段后漂洗階段進(jìn)行一次，以及，在結(jié)束所有染色階段后第二漂洗階段進(jìn)行一次?？蛇x擇地，漂洗階段可散置在兩種或者更多種固定階段之間或者在兩種或者更多種染色階段之間。
[0306]在一些實(shí)施方案中，染色操作可包括(I)固定階段、(2)第二固定階段、(3)使用第一染色溶液的第一染色階段、(4)使用第二染色溶液的第二染色階段、(5)漂洗階段和
(6)第二漂洗階段。在一些實(shí)施方案中，多種(例如，第一和第二)染色階段和/或溶液可以以任何次序使用和/或以任何次序重復(fù)。例如，第一和第二染色階段和/或溶液可互換。每個階段可包含約50 μ L或者更多(例如，75 μ L或者更多，100 μ L或者更多，150 μ L或者更多，200 μ L或者更多，或者250 μ L或者更多)和/或約300 μ L或者更少(例如，250 μ L或者更少，200 μ L或者更少，150 μ L或者更少，100 μ L或者更少,或者75 μ L或者更少)微升/秒的沉積流速，歷時約2(例如，3、4，或者5)秒。例如，流速可為約lMyL/s(例如，約70 μ L/s、約100 μ L/s,或者約150 μ L/s)，歷時約2秒(例如，3秒，或者4秒)。
[0307]攪動階段
[0308]在某些實(shí)施方案中試樣加工可包括一個或者多個攪動階段，以在固定、染色和/或漂洗階段中在整個間隔92、基底2和平臺60A和/或60B中分散固定溶液、染色溶液和/或漂洗溶液。圖19包括流程圖1200，其特征在于用于攪動試樣的一系列步驟。圖9中所示的致動器30A和/或30B可提供精細(xì)移動調(diào)節(jié)，用于改變基底2相對于平臺60A和/或60B的位置。
[0309]控制系統(tǒng)5可包括用于指示致動器30A和/或30B開始攪動階段的軟件和/或硬件。致動器30A和/或30B可設(shè)置成通過來自控制系統(tǒng)的攪動開始命令來上下移動基底臂20A和/或20B。攪動階段可重復(fù)預(yù)定數(shù)目的循環(huán)。本申請使用的術(shù)語“循環(huán)”是指從起始位置向上運(yùn)動，接著與向上的方向相反地向下運(yùn)動。在一些實(shí)施方案中，一個或者多個攪動循環(huán)在每個循環(huán)結(jié)束時，或者至少在一些循環(huán)結(jié)束時使基底2返回至起始位置。在某些實(shí)施方案中，基底2在一些或者所有攪動循環(huán)結(jié)束時不返回至起始位置，但是每個循環(huán)仍然包括向上運(yùn)動和接下來的向下運(yùn)動。致動器30A和/或30B通常在一個或者多個攪動循環(huán)中連續(xù)移動基底2，直到停止命令從控制系統(tǒng)5發(fā)送至致動器。攪動階段可臨時增加在基底2和平臺60A和/或60B的表面之間的間隔尺寸(間隔距離)，然后使基底返回至試樣加工位置。另外，攪動階段可包括在相對于平臺60A和/或60B的表面和試樣加工位置的角位置之間移動基底2的一系列運(yùn)動。當(dāng)基底在攪動階段中從試樣加工位置移動時，在分配至平臺和基底2之間的間隔中的流體中的表面張力導(dǎo)致流體分子在基底上的重新分配，并可有利地改善在整個試樣中的流體分布。
[0310]在攪動階段中，也可使用其它方法以相對于平臺移動基底2。例如，在一些實(shí)施方案中，偏置70A-D和/或71A-D中的一個或者多個的位置(例如，在平臺60A和/或60B的表面上方的偏置延伸量)可快速調(diào)節(jié)以攪動試樣3。在某些實(shí)施方案中，可調(diào)節(jié)平臺60A和/或60B的位置以導(dǎo)致試樣3攪動。例如，平臺60A和/或60B可交替地上下移動(例如，對應(yīng)于上述基底2的移動方向)，以導(dǎo)致試樣3攪動。
[0311]在一些實(shí)施方案中，當(dāng)基底臂由可彎曲材料制成時，試樣3的攪動可通過以下方法進(jìn)行:改變致動器30A和/或30B朝向偏置70A-D和/或71A-D驅(qū)動基底2的程度，如下面討論。通過檢測在基底臂中作為時間函數(shù)的應(yīng)變變化，應(yīng)變計可用于測量和調(diào)節(jié)施加至基底2的攪動的頻率。
[0312]參見圖19，在第一步驟1202中，開始攪動階段。在步驟1204中，控制系統(tǒng)5指示致動器30A開始攪動循環(huán)。響應(yīng)于該指示，致動器30A在步驟1206中向上旋轉(zhuǎn)基底2，從而增加在基底2和平臺60A之間的距離。然后，在步驟1208中，致動器30A朝向平臺60A向下旋轉(zhuǎn)基底2，從而減少在基底和平臺60A之間的距離。在決定步驟1210中，如果攪動階段繼續(xù)，那么控制返回至步驟1204并且再次在其它攪動循環(huán)中通過致動器30A旋轉(zhuǎn)基底
2。如果攪動階段結(jié)束，那么控制從步驟1210傳遞至步驟1212，其中隨著攪動結(jié)束，基底2返回至它的初始位置。
[0313]攪動階段可包括通過致動器30A和/或30B施加的一個或者多個攪動循環(huán)。此夕卜，攪動階段可在固定溶液、染色溶液和/或漂洗階段中的每個期間發(fā)生一次或者多次，并且在固定、染色和/或漂洗階段中的每個之間頻率可改變。例如，并參見圖9，致動器30A和/或30B可將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離，隨后使基底2返回至試樣加工位置，歷經(jīng)三次，在每個固定、染色和漂洗階段后一次。致動器30A和/或30B可在2秒內(nèi)完成每個攪動循環(huán)(例如，I秒用于將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離，以及I秒用于使基底返回至試樣加工位置)。機(jī)器I能夠?qū)嵤┲甘?，以針對每個攪動循環(huán)和/或階段改變攪動頻率和距離。例如，攪動階段可包括致動器30A和/或30B將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高5微米的距離，然后使基底返回至試樣加工位置，10至20次/秒。
[0314]也可使用攪動距離和頻率的可選組合。例如，在一些實(shí)施方案中，所述攪動距離為25微米或者更多(例如，50微米或者更多，100微米或者更多，150微米或者更多，200微米或者更多，250微米或者更多，300微米或者更多，500微米或者更多，700微米或者更多，Imm或者更多。例如，在某些實(shí)施方案中，攪動距離為35微米至350微米。
[0315]在一些實(shí)施方案中，所述攪動循環(huán)頻率為I循環(huán)/秒或者更多(例如，2循環(huán)/秒或者更多，3循環(huán)/秒或者更多，4循環(huán)/秒或者更多，5循環(huán)/秒或者更多，7循環(huán)/秒或者更多，10循環(huán)/秒或者更多)。
[0316]也可使用另外的攪動技術(shù)。例如，在一些實(shí)施方案中，基底夾持器20A和/或20B可包括致動器，所述致動器圍繞垂直于圖7和9中所示的致動器30A和/或30B的旋轉(zhuǎn)軸的軸旋轉(zhuǎn)基底。
[0317]可選擇地，平臺60A和/或60B可配有偏置調(diào)節(jié)器，用于在固定、染色和漂洗階段中提高或者降低一個或者多個偏置70A-D和/或71A-D。為執(zhí)行偏置調(diào)節(jié)器，平臺60A和/或60B可包括偏置，其與平臺中的內(nèi)板連接。板的高度可使用內(nèi)部致動器改變，由此改變偏置的高度?？蛇x擇地，通過指示致動器移動平臺60A和/或60B，或者模塊80A和/或80B，偏置70A-D和71A-D相對于基底2的位置可變化，由此在攪動階段中改變間隔距離。通過在試樣制備過程中使用與常規(guī)染色和制備技術(shù)相比顯著較小的流體體積，控制系統(tǒng)5可調(diào)節(jié)流體循環(huán)頻率、流速、偏置高度、間隔距離，以及攪動參數(shù)和頻率，以更有效地加工試樣。
[0318]在一些實(shí)施方案中，基底臂可由可彎曲的材料制成，使得如果基底在試樣加工位置僅倚靠從平臺伸出的兩個偏置，那么致動器或者其它推進(jìn)力元件可朝向平臺表面進(jìn)一步旋轉(zhuǎn)載玻片，直到載玻片倚靠所有四個偏置。改變基底在這兩個位置之間的位置可在試樣加工期間實(shí)現(xiàn)足夠攪動?；妆劭砂☉?yīng)變計以監(jiān)測基底臂中的應(yīng)變，并可用于通知控制系統(tǒng)5基底相對于平臺偏置的位置。另外，控制系統(tǒng)可包括對應(yīng)于基底的厚度瑕疵的信息，當(dāng)將基底置于試樣加工位置中時或者在攪動階段中控制系統(tǒng)可考慮該信息。
[0319]干燥階段
[0320]在某些實(shí)施方案中，控制系統(tǒng)5可使用連接至機(jī)器I的干燥器4干燥試樣。圖20包括流程圖1300，其特征在于干燥試樣的一系列步驟。在起始步驟1302(其中核實(shí)染色和其它階段(例如，一個或者多個漂洗階段)的完成)后，在步驟1304中，干燥器4引導(dǎo)空氣流過試樣。干燥過程在步驟1306中繼續(xù)，直到從控制單元接收停止干燥的信號。當(dāng)接收信號時，干燥器停止經(jīng)過試樣的空氣流并在步驟1308停止干燥階段。
[0321]通常，可控制機(jī)器I以改變施加的空氣流的空氣溫度、流速、持續(xù)時間和在試樣加工期間用于干燥試樣3的一個或者多個階段。例如，在結(jié)束染色階段后，干燥器4可引導(dǎo)空氣流在約120 T以10升/分鐘的速度經(jīng)過試樣，歷時7秒。也可使用其它空氣溫度(例如，從環(huán)境溫度至最高300 0F )、空氣流速(例如，I升/分鐘至100升/分鐘)和空氣流動期限(例如，從數(shù)秒至數(shù)分鐘)。
[0322]試樣檢杳系統(tǒng)
[0323]本申請公開的自動試樣制備機(jī)器和裝置(包括機(jī)器I)通?？膳c較大試樣檢查系統(tǒng)一起使用和/或結(jié)合至較大試樣檢查系統(tǒng)中，例如在美國申請12/430，885和13/293，050中描述的較大試樣檢查系統(tǒng)，將其全部內(nèi)容并入本申請作為參考。例如，圖21顯示示意圖，其說明試樣檢查系統(tǒng)2000的一個可能的實(shí)施方案。系統(tǒng)2000包括平臺2100、光接收設(shè)備2200、計算機(jī)2300、施用器2400、氣體循環(huán)設(shè)備2500、光源2600、分配器2800、放電設(shè)備2900、載玻片貼標(biāo)簽機(jī)3000和載玻片標(biāo)簽閱讀器3100。行進(jìn)器2110可設(shè)置成接收一個或者多個載玻片或者其它基底2700。行進(jìn)器2110可附著至平臺的表面，例如頂表面2101。行進(jìn)器2110可采取帶的形式，以及系統(tǒng)可使用機(jī)械臂、重力、磁力、液壓技術(shù)、齒輪，或者其它移動技術(shù)，以沿著平臺的表面2101移動基底安裝的試樣。
[0324]平臺2100也可包括進(jìn)料器2102和收集器2106，其分別用于從堆疊或者架子進(jìn)料基底2700(例如，載玻片)和將基底2700(例如，載玻片)收集至堆疊或者架子。進(jìn)料器2102可配有進(jìn)料器推進(jìn)機(jī)構(gòu)2103 (例如經(jīng)橡膠處理的輪)，用于將試樣推至行進(jìn)器2110上。可選擇地，可使用機(jī)械臂抓住基底2700并將基底直接置于行進(jìn)器上?？墒褂脤⒒淄瞥鲞M(jìn)料器2102的備選機(jī)構(gòu)，例如磁體或者液壓裝置。進(jìn)料器可包括傳感器，用于測定存在多少載玻片。傳感器可測量例如基底2700的重量，以測定存在多少基底。收集器2106也可包括傳感器，用于測定存在多少基底。在繼續(xù)進(jìn)行的基礎(chǔ)上，傳感器可設(shè)置成當(dāng)分析了預(yù)定數(shù)目的試樣時通知計算機(jī)2300和/或可通知計算機(jī)安裝在基底上的試樣的接收。
[0325]光接收設(shè)備2200可為顯微鏡(例如明視野顯微鏡)、攝像機(jī)、照相機(jī)，或者其它接收光的光學(xué)設(shè)備。包括標(biāo)準(zhǔn)明視野顯微鏡的實(shí)施方案也可包括自動階段(例如，基底移動器2201)和自動對焦。在一些實(shí)施方案中，顯微鏡可與機(jī)動化階段和對焦馬達(dá)附件連接。顯微鏡可具有機(jī)動化管嘴，以允許在計算機(jī)2300的控制下選擇不同放大倍率鏡頭?？墒褂脼V光輪，以使得計算機(jī)2300能夠自動選擇光路中的窄帶濾色片。LED照明可替代濾器，以及與濾光輪旋轉(zhuǎn)所需要的時間相比，LED的使用可減少圖像采集時間。例如，可使用1600x1200像素 FireWire ?丨(IEEE1394 High Performance Serial Bus)相機(jī)獲得窄帶圖像。
[0326]在一些實(shí)施方案中，光接收設(shè)備2200接收從基底2700反射的光并儲存一個或者多個由反射光形成的圖像?？商鎿Q地或者另外地，在一些實(shí)施方案中，從基底上的試樣的熒光發(fā)射可通過光接收設(shè)備2200檢測。
[0327]在某些實(shí)施方案中，光接收設(shè)備2200設(shè)置成得到基底上的試樣的傳輸圖像。例如，光發(fā)射源2600可位于平臺下面并且可引導(dǎo)光，使得它通過平臺2100和基底2700進(jìn)入光接收設(shè)備2200。
[0328]光接收設(shè)備2200和圖21中示出的任何其它構(gòu)件可通過連接(2011-2014)與計算機(jī)2300連接,其可向構(gòu)件提供能量，提供從計算機(jī)2300至構(gòu)件的指令和/或允許構(gòu)件向計算機(jī)2300發(fā)送信息。連接2011-2014可為有線連接或者無線連接。
[0329]光接收設(shè)備2200能夠進(jìn)行X、Y和Z軸移動(在其它實(shí)施方案中，機(jī)動化階段或者基底移動器2201可提供X、Y和Z移動)。光接收設(shè)備2200可包括盤(pan)、斜面(tilt)和/或推動力致動器(locomotive actuators),以使得計算機(jī)2300能夠?qū)⒐饨邮赵O(shè)備2200定位在適當(dāng)位置。光接收設(shè)備2200可包括聚焦入射光的透鏡2210。
[0330]可選擇光接收設(shè)備2200，以捕獲黑和白和/或彩色圖像。在一些實(shí)施方案中，可使用兩種或者更多種光接收設(shè)備，以分割與捕獲圖像相關(guān)的加工時間。例如，低倍率成像站可在高倍率成像站前面。類似地，在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)2000、平臺2100、計算機(jī)2300和/或光接收設(shè)備2200可引導(dǎo)基底移動器2201移動基底2700，以確保在基底上或者在基底的特定部分上全部或者大部分細(xì)胞的一個或者多個圖像的捕獲和儲存。
[0331]計算機(jī)2300可為手提式電腦、服務(wù)器、工作站，或者任何其它類型的計算設(shè)備。計算機(jī)可包括處理器、顯示器2320、接口 2310和內(nèi)部存儲器和/或磁盤驅(qū)動器。計算機(jī)2300也可包括軟件，其儲存在存儲器中或者在計算機(jī)可讀的有形介質(zhì)如光驅(qū)上。軟件可包括指令，用于導(dǎo)致計算機(jī)操作光接收設(shè)備2200、施用器2400、氣體循環(huán)設(shè)備2500、平臺2100、行進(jìn)器2110、光源2600、分配器2450和/或2800、試樣制備機(jī)器1，或者在這些構(gòu)件之一中或者與這些構(gòu)件之一連接的任何構(gòu)件。類似地，計算機(jī)設(shè)置成從任何這些構(gòu)件接收信息。
[0332]例如，軟件可控制基底從進(jìn)料器2102的分散速率，以及進(jìn)料器2102可通知計算機(jī)存在的基底的數(shù)目。另外，計算機(jī)2300也可負(fù)責(zé)實(shí)施由光接收設(shè)備2200捕獲的圖像的分析。通過分析過程，可設(shè)置和控制計算機(jī)，以計算在特定體積的血液中特定類型的細(xì)胞的數(shù)目，例如對于血液,紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板數(shù)以及全血細(xì)胞計數(shù)的其它測量的和導(dǎo)出的組分，例如:可計算血紅蛋白含量、紅細(xì)胞形態(tài)，或者白細(xì)胞計數(shù)差異。圖像分析軟件可分析每個單獨(dú)的視野并將總的紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)加和。為計算每微升患者血液樣品的總數(shù)，在載玻片上計數(shù)的數(shù)目可乘以稀釋比率和次級樣品的體積。來自載玻片的紅血細(xì)胞和白血細(xì)胞的計數(shù)、形態(tài)學(xué)測量和圖像的結(jié)果可在顯示器2320上示出。
[0333]在一些實(shí)施方案中，計算機(jī)2300設(shè)置成顯示數(shù)值數(shù)據(jù)、細(xì)胞群直方圖、散點(diǎn)圖和使用在監(jiān)視器上顯示的血細(xì)胞圖像的細(xì)胞形態(tài)的直接評估。顯示細(xì)胞形態(tài)的能力提供系統(tǒng)2000的使用者快速確定細(xì)胞形態(tài)的異常存在或者不存在的能力，其可保證制備另外的載玻片用于由有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員或者其它專業(yè)人員人工審核。軟件也可向計算機(jī)提供指令以顯示從光接收設(shè)備接收的圖像2331或者可導(dǎo)致顯示器2330顯示圖像分析的結(jié)果2332 (例如，也許在表或者圖中)。類似地，可控制計算機(jī)2300以列舉在特定血液體積中的特定類型的細(xì)胞的數(shù)目或者列舉在特定體積的血液中的受損細(xì)胞、癌細(xì)胞，或者溶解的細(xì)胞的數(shù)目。軟件使得計算機(jī)能夠?qū)嵤┓治鲞^程。計算機(jī)在分析期間可使用一個或者多個倍率。[0334]盡管顯示為一個構(gòu)件，但是計算機(jī)2300可包括多個計算機(jī)；第一計算機(jī)可用于控制系統(tǒng)2000的構(gòu)件，以及第二計算機(jī)可用于加工來自光接收設(shè)備2200的圖像。多個計算機(jī)可連接在一起以允許計算機(jī)共享信息。計算機(jī)2300也可連接至網(wǎng)絡(luò)或者實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)，以允許計算機(jī)向其它計算機(jī)發(fā)送和接收信息。
[0335]在某些實(shí)施方案中，施用器2400可包括注射器、手動或者電動驅(qū)動的移液器，或者通過管道連接至吸管端的電機(jī)控制的泵。施用器2400以受控的方式將試樣施加至基底2700。使用施用器2400的示例性特征、屬性和方法例如在美國專利申請US 2009/0269799中公開。試樣可包括一種或者多種血液組分、細(xì)胞、組織，或者其它生物組分。
[0336]一旦試樣施用至基底2700，那么使用機(jī)器I加工施用的試樣。如本申請所述,機(jī)器I用于將一種或者多種染色溶液、固定溶液和/或其它溶液施用至基底上的試樣。
[0337]在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)2000可設(shè)置成通過從施用器2400的尖端放下細(xì)胞的非接觸行，在基底2700上沉積的細(xì)胞之間實(shí)現(xiàn)最小重疊。增加經(jīng)稀釋的流體的粘度或者稀釋劑的類型或者量可影響來自施用器的試樣流的最終沉降位置的寬度。通過選擇行間距離以允許血液樣品的典型變化，所有細(xì)胞可在所有樣品中計數(shù)。
[0338]氣體移動設(shè)備2500(其可為圖21中所示的獨(dú)立設(shè)備，或者可如上所述結(jié)合至機(jī)器I中)可包括扇子和/或可包括其它氣體移動設(shè)備如壓縮機(jī)或者風(fēng)箱。氣體移動設(shè)備2500可直接連接至計算機(jī)2300或者可通過其它構(gòu)件如平臺2100或者施用器2400連接。氣體移動設(shè)備推動氣體(在一些情況中，大氣)經(jīng)過基底，以控制基底上的物質(zhì)的干燥速度。由于快速干燥，太快地移動太多空氣(即，太高的扇子速度)經(jīng)過基底可導(dǎo)致試樣中的細(xì)胞破裂，以及太慢地移動太少空氣(即，太低的扇子速度)經(jīng)過基底可導(dǎo)致細(xì)胞太慢地干燥和看起來皺縮。
[0339]基于氣體移動設(shè)備與基底的距離、分析的流體的類型、流的寬度、氣體(例如，空氣)的溫度和流的平均厚度，計算機(jī)2300可選擇和控制在一段時間內(nèi)移動經(jīng)過基底的空氣量(即，立方英尺或者立方厘米的空氣/秒)?？啥ㄎ粴怏w移動設(shè)備2500，使得設(shè)備引導(dǎo)空氣，使得氣體以30° -60° (例如，45° )的角度沖擊基底，歷時約15至20秒。在一些實(shí)施方案中，計算機(jī)2300可將濕度和溫度設(shè)定控制在系統(tǒng)附近，以允許在不使用氣體移動設(shè)備2500的情況下發(fā)生干燥過程。
[0340]光發(fā)射設(shè)備2600及其各種構(gòu)件在美國專利申請US 2009/0269799中通過實(shí)施例描述。光的各種波長可通過光發(fā)射設(shè)備2600產(chǎn)生和通過光接收設(shè)備2200檢測。例如，波長如415nm用于得到血紅蛋白專用影像,用于評估RBC形態(tài)和血紅蛋白含量。在600nm發(fā)射的光可用于提供血小板和細(xì)胞核的高對比度圖像?？蛇x擇其它波長，以最好地區(qū)別嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(全部藍(lán)色色調(diào))、嗜酸性粒細(xì)胞(紅色)和嗜中性粒細(xì)胞(中性色)的顏色。
[0341]實(shí)施例
[0342]本公開通過以下實(shí)施例進(jìn)一步描述，其不意圖限制權(quán)利要求引用的本發(fā)明的范圍。
[0343]實(shí)施例1
[0344]圖22為流程圖1400，其顯示用于加工安裝在基底上的試樣的一系列示例性步驟。流程圖1400中的步驟可用于制備用于檢查的試樣。盡管這種方法的描述有時是指具有具體范圍的具體步驟或者公開了在具體序列中發(fā)生的步驟，但是這種描述意圖僅說明一種實(shí)例方法。參考圖22，機(jī)器I連接至控制系統(tǒng)5，控制系統(tǒng)5用于在加工步驟中指揮各種機(jī)器構(gòu)件的操作。在試樣開始步驟中，將來自血液等分試樣的包含紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板的試樣3施用至由玻璃顯微鏡載玻片組成的基底2。這可使用不同的站如在共同待決的美國專利申請2008/0102006中描述的一個或者多個站實(shí)施。在定位步驟1402中，將含有試樣3的基底2加載至基底臂IOA的基底夾持器20A上，如圖7中所示?？刂葡到y(tǒng)5指導(dǎo)抽吸源222 (步驟1404)從基底夾持器20A排出空氣。在試樣加工期間通過抽吸端口 21和22 (步驟1406)施加的吸力使基底2附著于基底夾持器20A?？刂葡到y(tǒng)5指導(dǎo)(步驟1408)致動器30A將基底3從圖7中所示的打開位置旋轉(zhuǎn)至圖9A中所示的試樣加工位置。在試樣加工位置中，試樣3面對平臺60A的表面,而基底2倚靠圖8中所不的偏置70A-D。偏置防止基底2接觸平臺60A的表面。在這種示例性方法中，在基底2的含有試樣的表面和平臺60A的表面之間的間隔92為約100微米或者200微米(例如，200微米)。
[0345]在第一固定階段(步驟1412，也參見圖15)中，在步驟1414中泵將固定溶液施用至試樣3。與圖8中所示的流體管道54A連接的泵200A將包含甲醇的固定溶液從固定劑貯存器210推動通過管道54A，離開端口 44A，到達(dá)平臺60A上，到達(dá)基底2上，并進(jìn)入平臺60A和基底2之間的間隔92中。泵200A從端口 44A以115微升/秒的流速推動固定溶液，歷時2秒時段Tl，由此將總共230微升固定溶液Vl引導(dǎo)至基底2上。
[0346]接著，在第一攪動步驟1416中，控制系統(tǒng)5通過以下方法攪動基底:指導(dǎo)致動器30A (步驟1418)將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離并使試樣返回至它的試樣加工位置。機(jī)器I再重復(fù)這種攪動步驟4次。機(jī)器I在約10秒(T2)內(nèi)完成五次攪動運(yùn)動，如圖23中所示。在攪動后,控制系統(tǒng)開始真空步驟1420。將- 0.1Opsi的真空力施加1.5秒(T3)，從而經(jīng)端口 40A和41A和廢物管道50A和51A排出存在于間隔中、平臺上或者基底上的任何殘留固定溶液(步驟1422)。將排出的固定溶液收集在廢物容器230和/或231中。
[0347]然后，在包括第二攪動步驟的第二固定階段中，重復(fù)第一固定階段和第一攪動步驟的前述步驟。
[0348]在固定階段后，控制系統(tǒng)5開始(步驟1424)第一染色階段。其中，控制系統(tǒng)5指導(dǎo)機(jī)器I染色試樣(步驟1426)。參考圖8和圖16的流程圖，與流體管道52A連接的泵201推動包含曙紅Y的第一染色溶液從染色劑貯存器21IA離開端口 42A，到達(dá)平臺60A上，到達(dá)基底2上，并進(jìn)入平臺60A和基底2之間的間隔92中。泵201通過端口 42A以115微升/秒的流速分配第一染色溶液，歷時2秒時段(T4)，由此將230微升第一染色溶液V2引導(dǎo)至基底上。
[0349]在將第一染色溶液施加至試樣3后，機(jī)器I通過以下方法實(shí)施第二攪動步驟1428:指導(dǎo)致動器30A在步驟1430中將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離，然后使試樣返回至試樣加工位置?？刂葡到y(tǒng)5導(dǎo)致機(jī)器I將這種攪動步驟再重復(fù)2次，并完成三次攪動，歷時約6秒(T5)，如圖23中所示。
[0350]接著，第二真空階段在步驟1432中開始。在步驟1434中施加5psi的真空,歷時3秒(T6)，以經(jīng)端口 40A和/或41A和廢物管道50A和5IA排出存在于間隔92中或者在平臺和基底上的任何殘留第一染色溶液。排出的第一染色溶液收集在廢物容器230A和/或231A 中。
[0351]在用包含曙紅Y的第一染色溶液染色試樣后，機(jī)器I在步驟1436中使用包含天青B和亞甲藍(lán)的第二染色溶液開始第二染色階段。與流體管道53A連接的泵202將第二染色溶液從染色劑貯存器推動經(jīng)過端口 43A，到達(dá)平臺60A上，到達(dá)基底2上，并進(jìn)入平臺60A和基底2之間的間隔92中(步驟1438)。機(jī)器I通過端口 43A以115微升/秒的流速分配第二染色溶液，歷時2秒時段(T7)，由此將總共230微升第二染色溶液V3引導(dǎo)至基底上。
[0352]在將染色劑施用至試樣3后，機(jī)器I通過以下方法在步驟1440中開始第三攪動階段:指導(dǎo)致動器30A將基底2的近邊緣(步驟1442)從試樣加工位置提高35微米的距離，然后使試樣3返回至它的試樣加工位置。機(jī)器I再重復(fù)這種攪動步驟三次。機(jī)器完成四次攪動運(yùn)動，歷經(jīng)約8秒的時段(T8)。
[0353]然后開始第三真空步驟1444。施加5psi的真空，歷時2秒(T9)，以在攪動后在步驟1446中經(jīng)端口 40A和/或41A和廢物管道50A和/或51A排出存在于間隔中或者在平臺60A和基底2上的殘留第二染色溶液。將排出的第二染色溶液收集在廢物容器230A和/或231A中。
[0354]然后機(jī)器I實(shí)施兩個漂洗-攪動-真空階段序列。第一階段序列在步驟1448當(dāng)控制系統(tǒng)5指示機(jī)器I開始第一漂洗階段時開始。使含有漂洗溶液的貯存器213A與泵203和流體管道55A連接。泵203引導(dǎo)漂洗溶液通過洗滌管道55A，進(jìn)入端口 45A中，進(jìn)入間隔92中，并到達(dá)平臺60A和基底2上，以在步驟1450中漂洗試樣3?？蛇x擇地，在一些實(shí)施方案中，將漂洗溶液引導(dǎo)通過流體端口 42A-45A中的兩個或者更多個。泵203引導(dǎo)漂洗溶液以115微升/秒的流速離開端口 45A，歷時2秒(TlO)，由此將總共230微升(V4)水引導(dǎo)至基底上。
[0355]接著，控制系統(tǒng)5在步驟1452中開始第四攪動階段，從而指導(dǎo)致動器30A(步驟1454)將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高5微米的距離，并使試樣返回至它的試樣加工位置。控制系統(tǒng)5可指導(dǎo)機(jī)器I重復(fù)這種攪動階段，并在約4秒(Tll)內(nèi)完成兩次攪動。
[0356]然后，真空階段在步驟1456中開始。在步驟1458中施加5psi的真空，歷時5.5秒(T12)，在攪動后經(jīng)端口 40A和/或41A和廢物管道50A和/或51A排出存在于間隔92中或者在平臺60A和基底2上的殘留漂洗溶液。
[0357]然后，在步驟1460中，控制系統(tǒng)5指導(dǎo)機(jī)器I通過開始第二漂洗階段來開始第二漂洗-攪動-真空階段序列。第二漂洗階段(步驟1460，1462)、第五攪動階段(步驟1464，1466)和第五真空階段(步驟1468，1470)如上面對于第一漂洗-攪動-真空階段所公開以相同方式實(shí)施。在第二漂洗-攪動-真空階段中，漂洗溶液V5的量，以及加工時間T13、T14和T15通常與在第一漂洗-攪動-真空階段序列中相同。
[0358]在將試樣固定、用包含曙紅Y的第一染色溶液和包含天青B和亞甲藍(lán)的第二染色溶液染色和漂洗后，機(jī)器I在步驟1472中開始干燥階段。干燥器4以10升/分鐘的流速引導(dǎo)約120°的空氣流(步驟1474)經(jīng)過試樣，歷時8秒時段(T16)。
[0359]在完成這些步驟后，在步驟1476中使基底2返回至它的起始位置。在此步驟中，致動器30A將基底2從試樣加工位置旋轉(zhuǎn)至打開位置，如圖7中所示。然后可將基底2通過基底移動器移除，并可加載新的基底以加工新的試樣。[0360]如在上述示例性試樣加工步驟中所說明和在圖23中所示,與包括自動和手動試樣制備技術(shù)的常規(guī)試樣加工方法相比，本申請公開的系統(tǒng)和方法通過消耗較少試劑提供更有效的試樣加工。參見圖23，例如，對于在示例性加工步驟中固定、染色和漂洗試樣，機(jī)器I消耗少于1.5毫升試劑(例如，460微升固定溶液+230微升第一染色溶液+230微升第二染色溶液+460微升漂洗溶液=1380微升試劑)。在一些實(shí)施方案中，多于或者少于1380微升流體可在試樣加工期間使用。例如，在加工試樣中使用的流體量可為約1150微升(例如，通過消除漂洗階段中的一個)。
[0361]上述流體體積通常涉及在基底和平臺之間的約100微米的間距。當(dāng)在基底和平臺之間的間距較大時，在試樣加工期間通常消耗較大流體體積。例如，當(dāng)間距為約200微米時，消耗的流體的總體積需要超過1380微升。
[0362]更一般地，消耗的流體的總體積可為500微升或者更多(例如，520微升或者更多，540微升或者更多，560微升或者更多，580微升或者更多，600微升或者更多，650微升或者更多，700微升或者更多，750微升或者更多)和/或2mL或者更少(例如，1.5mL或者更少，
1.4mL或者更少，1.3mL或者更少，1.2mL或者更少，1.1mL或者更少，1.0mL或者更少，900微升或者更少)。
[0363]再次參見圖23，試樣制備過程在稍超過I分鐘內(nèi)完成(例如，在每個固定階段中
13.5秒流逝，固定總共流逝27秒+在第一染色階段中流逝11秒+在第二染色階段中流逝12秒+在漂洗階段中流逝23秒+在干燥階段中流逝8秒=總共流逝時間81秒)。在某些實(shí)施方案中，試樣制備可在多于或者少于81秒內(nèi)完成。例如，試樣加工可在180秒或者更少時間(例如，150秒或者更少時間，120秒或者更少時間，90秒或者更少時間，80秒或者更少時間，70秒或者更少時間,60秒或者更少時間，50秒或者更少時間，或者40秒或者更少時間)內(nèi)完成。
[0364]此外,盡管前述不例性方法描述了單一試樣的加工時間，但是用于加工多個基底的系統(tǒng)和方法(例如，圖7中的機(jī)器I，其設(shè)置成加工兩個基底和/或設(shè)置成加工三個或者較多基底的系統(tǒng))能夠每小時加工超過100個試樣(例如，每小時60個試樣至120個試樣)。與常規(guī)自動系統(tǒng)和手動試樣制備技術(shù)相比，以實(shí)驗(yàn)室設(shè)置使用本申請公開的系統(tǒng)和方法可導(dǎo)致基于每個試樣較快的生產(chǎn)能力，同時流體(例如，固定、染色和漂洗流體)的消耗減少。
[0365]實(shí)施例2
[0366]上面對于實(shí)施例1所述的加工步驟可在下面的本發(fā)明其它實(shí)施方案中調(diào)節(jié)。另夕卜，本申請所述的固定、染色和漂洗溶液制劑可在下面的實(shí)施例加工步驟中使用。
[0367]在第一固定階段(步驟1412，也參見圖22)中，在步驟1414中泵將固定溶液施用至試樣3。圖8中所示的與流體管道54A連接的泵200A將包含甲醇的固定溶液從固定劑貯存器210推動通過管道54A，離開端口 44A，到達(dá)平臺60A上，到達(dá)基底2上，并進(jìn)入平臺60A和基底2之間的間隔92中。泵200A從端口 44A以115微升/秒的流速推動固定溶液，歷時2秒時段(Tl)，由此將總共230微升固定溶液(Vl)引導(dǎo)至基底2上。
[0368]接著，在第一攪動步驟1416中，控制系統(tǒng)5通過以下方法攪動基底:指導(dǎo)致動器30A(步驟1418)將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離并使試樣返回至它的試樣加工位置。機(jī)器I再重復(fù)這種攪動步驟五次。在約12秒內(nèi)機(jī)器I完成六次攪動運(yùn)動。在攪動后，控制系統(tǒng)開始真空步驟1420。施加-6psi的真空力，歷時1.5秒(T3)，從而經(jīng)端口 40A和4IA和廢物管道50A和5IA排出存在于間隔中、平臺上或者基底上的任何殘留固定溶液(步驟1422)。排出的固定溶液收集在廢物容器230和/或231中。
[0369]然后，在包括第二攪動步驟的第二固定階段中，重復(fù)第一固定階段和第一攪動步驟的前述步驟。
[0370]在固定階段后，控制系統(tǒng)5開始(步驟1424)第一染色階段。其中，控制系統(tǒng)5指導(dǎo)機(jī)器I染色試樣(步驟1426)。參考圖8和圖16的流程圖，與流體管道52A連接的泵201推動包含曙紅Y的第一染色溶液從染色劑貯存器21IA離開端口 42A，到達(dá)平臺60A上，到達(dá)包含試樣3的基底2上，并進(jìn)入平臺60A和基底2之間的間隔92中。泵201通過端口 42A以115微升/秒的流速分配第一染色溶液，歷時2秒時段(T4)，由此將230微升第一染色溶液V2引導(dǎo)至基底上。
[0371 ] 在將第一染色溶液施加至試樣3后，機(jī)器I通過以下方法實(shí)施第二攪動步驟1428:指導(dǎo)致動器30A在步驟1430中將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離，然后使試樣返回至試樣加工位置?？刂葡到y(tǒng)5導(dǎo)致機(jī)器I將這種攪動步驟再重復(fù)2次，并完成三次攪動，歷時約6秒(T5)，如圖23中所示。
[0372]接著,第二真空階段在步驟1432中開始。在步驟1434中施加_5psi的真空,歷時3秒(T6)，以經(jīng)端口 40A和/或41A和廢物管道50A和51A排出存在于間隔92中或者在平臺和基底上的任何殘留第一染色溶液。排出的第一染色溶液收集在廢物容器230A和/或231A 中。
[0373]在用包含曙紅Y的第一染色溶液染色試樣后，機(jī)器I在步驟1436中使用包含天青B和亞甲藍(lán)的第二染色溶液開始第二染色階段。與流體管道53A連接的泵202將第二染色溶液從染色劑貯存器推動經(jīng)過端口 43A，到達(dá)平臺60A上，到達(dá)基底2上，并進(jìn)入平臺60A和基底2之間的間隔92中(步驟1438)。機(jī)器I通過端口 43A以115微升/秒的流速分配第二染色溶液，歷時2秒時段(T7)，由此將總共230微升第二染色溶液V3引導(dǎo)至基底上。
[0374]在將染色劑施用至試樣3后，機(jī)器I通過以下方法在步驟1440中開始第三攪動階段:指導(dǎo)致動器30A將基底2的近邊緣(步驟1442)從試樣加工位置提高35微米的距離，然后使試樣3返回至它的試樣加工位置。機(jī)器I再重復(fù)這種攪動步驟2次。機(jī)器完成3次攪動運(yùn)動，歷經(jīng)約6秒的時段(T8)。
[0375]然后開始第三真空步驟1444。施加_6psi的真空，歷時2秒(T9)，以在攪動后在步驟1446中經(jīng)端口 40A和/或41A和廢物管道50A和/或51A排出存在于間隔中或者在平臺60A和基底2上的殘留第二染色溶液。將排出的第二染色溶液收集在廢物容器230A和/或231A中。
[0376]然后機(jī)器I實(shí)施兩個漂洗-攪動-真空階段序列。第一階段序列在步驟1448當(dāng)控制系統(tǒng)5指示機(jī)器I開始第一漂洗階段時開始。使含有漂洗溶液的貯存器213A與泵203和流體管道55A連接。泵203引導(dǎo)漂洗溶液通過洗滌管道55A，進(jìn)入端口 45A中，進(jìn)入間隔92中，并到達(dá)平臺60A和基底2上，以在步驟1450中漂洗試樣3?？蛇x擇地，在一些實(shí)施方案中，將漂洗溶液引導(dǎo)通過流體端口 42A-45A中的兩個或者更多個。泵203引導(dǎo)漂洗溶液以115微升/秒的流速離開端口 45A，歷時2秒(TlO)，由此將總共230微升(V4)水引導(dǎo)至基底上。[0377]接著，控制系統(tǒng)5在步驟1452中開始第四攪動階段，從而指導(dǎo)致動器30A(步驟1454)將基底2的近邊緣從試樣加工位置垂直提高35微米的距離，并使試樣返回至它的試樣加工位置。然后控制系統(tǒng)5指導(dǎo)機(jī)器I再重復(fù)這種攪動階段3次，并在約8秒(Tll)內(nèi)完成4次攪動。
[0378]然后，真空階段在步驟1456中開始。在步驟1458中施加5psi的真空，歷時5.5秒(T12)，在攪動后經(jīng)端口 40A和/或41A和廢物管道50A和/或51A排出存在于間隔92中或者在平臺60A和基底2上的殘留漂洗溶液。
[0379]然后，在步驟1460中，控制系統(tǒng)5指導(dǎo)機(jī)器I通過開始第二漂洗階段來開始第二漂洗-攪動-真空階段序列。第二漂洗階段(步驟1460，1462)、在約12秒內(nèi)完成的包含6次攪動的第五攪動階段和第五真空階段(步驟1468，1470)如上面對于第一漂洗-攪動-真空階段所公開以相同方式實(shí)施。在第二漂洗-攪動-真空階段中，漂洗溶液V5的量，以及加工時間T13、T14和T15通常與在第一漂洗-攪動-真空階段序列中相同。另外，在即將開始真空階段之前，致動器30A將基底2的近邊緣從試樣加工位置提高15-35微米的距離。這種增加的在基底2和平臺60之間的間隔改善在最終真空階段中在間隔92中任何殘留流體的排出。
[0380]在將試樣固定、用含有曙紅Y的第一染色溶液和含有天青B和亞甲藍(lán)的第二染色溶液染色，并漂洗后，機(jī)器I在步驟1472中開始干燥階段。干燥器4以10升/分鐘的流速引導(dǎo)約120°的空氣流(步驟1474)經(jīng)過試樣，歷時8秒時段(T16)。
[0381]在完成這些步驟后，在步驟1476中使基底2返回至它的起始位置。在此步驟中，致動器30A將基底2從試樣加工位置旋轉(zhuǎn)至打開位置，如圖7中所示。然后可將基底2通過基底移動器移除，并可加載新的基底以加工新的試樣。
[0382]如在上述實(shí)施例試樣加工步驟中所說明，與包括自動和手動試樣制備技術(shù)的常規(guī)試樣加工方法相比，本申請公開的系統(tǒng)和方法通過消耗較少試劑提供更有效的試樣加工。參見實(shí)施例2，對于在示例性加工步驟中固定、染色和漂洗試樣，機(jī)器I消耗少于1.5毫升試劑(例如，460微升固定溶液+230微升第一染色溶液+230微升第二染色溶液+460微升漂洗溶液=1380微升試劑)。在一些實(shí)施方案中，多于或者少于1380微升流體可在試樣加工期間使用。例如，在加工試樣中使用的流體量可為約1150微升(例如，通過消除漂洗階段中的一個)或者少于1，000微升(例如，通過進(jìn)一步消除固定階段中的一個)。
[0383]關(guān)于圖23，對于實(shí)施例1，機(jī)器I消耗少于I毫升試劑用于在示例性加工步驟中固定、染色和漂洗試樣(例如，140微升甲醇固定劑+140微升熒光素染料+140微升噻嗪染料+280微升漂洗溶液=700微升試劑)。在一些實(shí)施方案中，在試樣加工中可使用多于或者少于700微升流體。例如，在加工試樣中使用的流體量可為約560微升(例如，通過消除漂洗階段中的一個)。
[0384]通常，消耗的流體總體積可為500微升或者更多(例如，520微升或者更多，540微升或者更多，560微升或者更多，580微升或者更多，600微升或者更多，650微升或者更多，700微升或者更多，750微升或者更多)和/或2mL或者更少(例如，1.5mL或者更少，1.4mL或者更少，1.3mL或者更少，1.2mL或者更少，1.1mL或者更少，1.0mL或者更少,900微升或者更少)。
[0385]參見圖23和實(shí)施例1，試樣制備方法在稍超過I分鐘內(nèi)完成(例如，在固定階段中流逝13.5秒+在熒光素染料階段中流逝11秒+在噻嗪染料階段中流逝12秒+在漂洗階段中流逝23秒+在干燥階段中流逝8秒=總共流逝時間67.5秒)。在某些實(shí)施方案中，試樣制備可在多于67.5秒(如在實(shí)施例2中一樣)，或者少于67.5秒內(nèi)完成。例如，試樣加工可在180秒或者更少時間(例如，150秒或者更少時間，120秒或者更少時間，90秒或者更少時間，80秒或者更少時間，70秒或者更少時間，60秒或者更少時間，50秒或者更少時間，或者40秒或者更少時間)內(nèi)完成。
[0386]此外,盡管前述不例性方法描述了單一試樣的加工時間，但是用于加工多個基底的系統(tǒng)和方法(例如，圖7中的機(jī)器I，其設(shè)置成加工兩個基底和/或設(shè)置成加工三個或者較多基底的系統(tǒng))能夠每小時加工超過100個試樣(例如，每小時60個試樣至120個試樣)。與常規(guī)自動系統(tǒng)和手動試樣制備技術(shù)相比，以實(shí)驗(yàn)室設(shè)置使用本申請公開的系統(tǒng)和方法可導(dǎo)致基于每個試樣較快的生產(chǎn)能力，同時流體(例如，固定、染色和漂洗流體)的消耗減少。
[0387]實(shí)施例3
[0388]對于表1中的系列實(shí)驗(yàn)中的每個，使用例如在美國公開US20090269799中描述的樣品制備技術(shù)制備血液樣品。然后將樣品通過固定、染色和漂洗大體上根據(jù)實(shí)施例1加工，以及對于固定溶液、染色溶液和漂洗溶液中的每個，流速為lMyL/s，歷時2秒。對于下面列舉的每組實(shí)驗(yàn)，從至少5個血液樣品制備基底(例如，顯微鏡載玻片)。接著，手動評估經(jīng)加工的樣品，并在顯微鏡下使用至少IOX放大倍率評價樣品染色和制備的質(zhì)量(例如，染色的總體均勻性、顏色、細(xì)胞特征的區(qū)別、在背景中存在/不存在碎片等)。實(shí)施手動評估以相對于對照試樣的染色和樣品制備質(zhì)量比較樣品試樣的染色和樣品制備質(zhì)量。通常使用"滾動對照條件(rolling control condition)",其中使用提供最佳染色和樣品制備的在先制劑作為對照，用于相對于不同制劑比較新的調(diào)節(jié)。因此(除非在下面另有說明)，在表I中任何給出的行通常表示在下面的行中總結(jié)的系列實(shí)驗(yàn)的對照條件。對于有限數(shù)目的樣品和在人工審核后，樣品在成像器上如US20090269799中所述加工，以測試制劑如何影響成像器的將存在于樣品中的五種類型的WBC分類的能力。這些結(jié)果在表2中報告。
[0389]表1.制劑評估實(shí)驗(yàn)
【權(quán)利要求】
1.細(xì)胞學(xué)固定溶液，其包含: 天青B; 表面活性劑； 甲醇；和 乙二醇。
2.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液包含約0.5至約5g/L天青B。
3.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.05%至約0.5%的所述表面活性劑。
4.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.05%至約0.3%的所述表面活性劑。
5.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述表面活性劑選自非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。
6.權(quán)利要求7的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述非離子的表面活性劑為聚山梨酯20。
7.權(quán)利要求6的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液包含約0.5mL/L至約2mL/L聚山梨酯20。
8.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其還包含緩沖劑。`
9.權(quán)利要求8的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述緩沖劑選自bis-tris、磷酸鹽、HEPES、MES、Tris和它們的任何組合。
10.權(quán)利要求9的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液在水中的1:10稀釋液具有6至8的pH,并包含約0.5mM至約IOmM HEPES。
11.權(quán)利要求9的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液在水中的1:10稀釋液具有6.7至7.3的pH，并包含約0.5mM至約IOmM HEPES。
12.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.5至約5%乙二醇。
13.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述固定溶液在水中的1:1000稀釋液在約640至約650nm的峰值波長具有約0.1至約I的UV吸光度。
14.權(quán)利要求1的細(xì)胞學(xué)固定溶液，其中所述表面活性劑為非離子的。
15.細(xì)胞學(xué)固定溶液，其包含 約0.5g/L至約5.0g/L天青B ； 約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ； 約5mL/L至約50mL/L乙二醇； 約0.10g/L至約10g/L HEPES鈉鹽；和 甲醇。
16.細(xì)胞學(xué)染色溶液，其包含 曙紅Y ； 緩沖劑； 表面活性劑； 氯化鈉； 乙二醇；和 水。
17.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其還包含抗微生物劑。
18.權(quán)利要求17的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.2至約50ppm的所述抗微生物劑。
19.權(quán)利要求17的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述抗微生物劑選自苯扎氯銨、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、ProClin"、疊氮化物、硫柳汞類、抗生素和它們的任何組合。
20.權(quán)利要求17的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述抗微生物劑包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。
21.權(quán)利要求20的細(xì)胞學(xué)染色溶液,其中所述抗微生物劑為ProClin300?。
22.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其還包含乙酸。
23.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.5至約5%乙二醇。
24.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液具有約5至約8的pH和約5至約250mM的緩沖劑濃度。
25.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述緩沖劑包括bis-tris、磷酸鹽、HEPES,MES、Tris和它們的任何組合。`
26.權(quán)利要求25的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液具有5.8至6.2的pH和約5mM至約250mM的bis-tris緩沖劑濃度。
27.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.05至約0.5%的所述表面活性劑。
28.權(quán)利要求27的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.05%至約0.3%的所述表面活性劑。
29.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述表面活性劑選自非離子的、陽離子的、陰離子的或者兩性離子的表面活性劑。
30.權(quán)利要求29的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述非離子的表面活性劑為聚山梨酯20。
31.權(quán)利要求30的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.5mL/L至約2mL/L的聚山梨酯20。
32.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約I至約20g/L氯化鈉。
33.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液在水中的1:500稀釋液在約510至約530nm的峰值波長具有約0.1至約I的UV吸光度。
34.權(quán)利要求16的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述表面活性劑為非離子的。
35.細(xì)胞學(xué)染色溶液，其包含 約0.5g/L至約5.0g/L曙紅Y ； 約5mM至約250mM bis-tris緩沖劑； 約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ； 約lg/L至約20g/L氯化鈉； 約5mL/L至約50mL/L乙二醇；
約 0.2ppm 至約 50ppm ProCiin 300 '；乙酸；和 水， 其中所述溶液具有5.8至6.2的pH。
36.細(xì)胞學(xué)染色溶液，其包含 天青B; 亞甲藍(lán)； 緩沖劑； 表面活性劑， 氯化鈉和 水。
37.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其還包含抗微生物劑。
38.權(quán)利要求37的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.2至約50ppm的所述抗微生物劑。
39.權(quán)利要求37的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述抗微生物劑選自苯扎氯銨、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、Proaiir'.疊氮化物、硫柳汞類、抗生素和它們的任何組合。
40.權(quán)利要求37的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述抗微生物劑包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-`異噻唑啉-3-酮。
41.權(quán)利要求40的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述抗微生物劑為p1Oain300*?
42.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其還包含乙酸。
43.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.25至約lg/L天青B。
44.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.25至約lg/L亞甲藍(lán)。
45.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液具有5至8的pH和約5mM至約250mM的緩沖劑濃度。
46.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液,其中所述緩沖劑包括bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、HEPES、MES、Tris和它們的任何組合。
47.權(quán)利要求46的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液具有6.8至7.2的pH和約25mM至約IOOmM的bis-tris緩沖劑濃度。
48.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.05至約0.5%的所述表面活性劑。
49.權(quán)利要求48的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.05%至約0.3%的所述表面活性劑。
50.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述表面活性劑選自非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。
51.權(quán)利要求50的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述非離子的表面活性劑為聚山梨酯20。
52.權(quán)利要求51的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約0.5mL/L至約2mL/L聚山梨酯20。
53.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液包含約I至約20g/L氯化鈉。
54.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述溶液在水中的1:1000稀釋液在約640至約660nm的峰值波長具有約0.1至約I的UV吸光度。
55.權(quán)利要求36的細(xì)胞學(xué)染色溶液，其中所述表面活性劑為非離子的。
56.細(xì)胞學(xué)染色溶液，其包含 約0.25g/L至約2.5g/L天青B ； 約0.25g/L至約2.5g/L亞甲藍(lán); 約5mM至約250mM bis-tris緩沖劑； 約0.5mL/L至約2.0mL/L聚山梨酯20 ； 約1.0g/L至約20g/L氯化鈉和
約 0.2ppm 至約 50ppm PmCIin 300?； 乙酸；和 水， 其中所述溶液的pH為6.8至7.2。
57.用于自動試樣制備裝置的漂洗溶液，其包含 聚乙二醇； 緩沖劑； 表面活性劑；` 甲醇；和 水。
58.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其還包含抗微生物劑。
59.權(quán)利要求58的漂洗溶液，其中所述溶液包含約0.2至約50ppm的所述抗微生物劑。
60.權(quán)利要求58的漂洗溶液，其中所述抗微生物劑選自苯扎氯銨、5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、PmCIin\疊氮化物、硫柳汞類、抗生素和它們的任何組合。
61.權(quán)利要求58的漂洗溶液，其中所述抗微生物劑包括5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮。
62.權(quán)利要求61的漂洗溶液，其中所述抗微生物劑為PioCIui300
63.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述溶液包含約0.2至約2g/L聚乙二醇。
64.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述溶液具有5至8的pH和約ImM至約50mM的緩沖劑濃度。
65.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述緩沖劑包括bis-tris緩沖劑、磷酸鹽、HEPES,MES、Tris和它們的任何組合。
66.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.01至約0.1%的所述表面活性劑。
67.權(quán)利要求66的漂洗溶液，其中所述溶液包含以體積計約0.0501%至約0.306%的所述表面活性劑。
68.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述表面活性劑選自非離子的、陽離子的、陰離子的和兩性離子的表面活性劑。
69.權(quán)利要求68的漂洗溶液，其中所述非離子的表面活性劑為聚山梨酯20。
70.權(quán)利要求69的漂洗溶液，其中所述溶液包含約0.lmL/L至約0.4mL/L聚山梨酯20。
71.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述溶液包含約9至約llmL/L甲醇。
72.權(quán)利要求57的漂洗溶液，其中所述表面活性劑為非離子的。
73.用于自動試樣制備裝置的漂洗溶液，其包含:約0.2g/L至約10g/L聚乙二醇；約ImM至約250mM HEPES緩沖劑；約0.1 OmL/L至約2.40mL/L聚山梨酯20 ；約 0.04ppm 至約 50ppm ProClin 300κ ;約9mL/L至約200mL/L甲醇；和水，其中所述漂洗溶液的pH為6.6至7.0。
74.試樣制備試劑盒，其包含:權(quán)利要求15的細(xì)胞學(xué)固定溶液；權(quán)利要求35的細(xì)胞學(xué)染色溶液； 權(quán)利要求56的細(xì)胞學(xué)染色溶液；和權(quán)利要求73的漂洗溶液。
75.制備試樣的方法，其包括:用權(quán)利要求15的細(xì)胞學(xué)固定溶液處理所述試樣；用權(quán)利要求35的細(xì)胞學(xué)染色溶液處理所述試樣；用權(quán)利要求56的細(xì)胞學(xué)染色溶液處理所述試樣；和用權(quán)利要求73的漂洗溶液處理所述試樣。
【文檔編號】G01N35/10GK103874913SQ201280039988
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月17日
【發(fā)明者】D.拉彭, K.利卡里 申請人:羅氏血液診斷股份有限公司