專利名稱：單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物分析技術領域，是一種動態(tài)調(diào)控細胞力學環(huán)境的芯片。
背景技術：
細胞作為生命體的基本單元，不斷與其環(huán)境(包括流體介質(zhì)與胞外基質(zhì))相互作用，這種相互作用使細胞始終處在力學動態(tài)變化的環(huán)境中，并對細胞的生長、增殖、分化、凋亡和遷移等生命活動產(chǎn)生重要影響。另一方面，細胞活動的一個重要表現(xiàn)就是細胞產(chǎn)生力學變化，并以此進一步調(diào)控細胞活動。因此，細胞如何感應環(huán)境的力學刺激并將其轉(zhuǎn)換為力學信號、調(diào)控細胞活動，即細胞力學，構成了生命活動的基本問題之一。作為支撐平臺，細胞力學技術的發(fā)展，推動著對這一基本問題的認識不斷深入，為改善人類健康發(fā)揮著日益重要的作用。傳統(tǒng)的細胞力學技術是在固定時間點、靜態(tài)地研究集團細胞的平均行為，不能對單個細胞進行環(huán)境動態(tài)調(diào)控，已遠不能滿足現(xiàn)代細胞力學研究與應用的需要。在單細胞水平上，監(jiān)測隨環(huán)境變化的細胞力學信號，正成為現(xiàn)代細胞力學技術的主要目標(參見 Discher D, et al. Biomechanics Cell Research and Applications for the Next Decade. Annals of Biomedical Engineering, 2009，37: 847 - 859)?，F(xiàn)代細胞力學技術始于微管吸吮技術(MAT)的發(fā)明，其核心是利用微管負壓調(diào)制外力，對微管吸持的單細胞進行粘附強度測試。MAT經(jīng)過二十多年的發(fā)展，已建立起較為成熟的測試系統(tǒng)與理論模型，力的調(diào)試精度可達幾個皮牛頓(10_12 N)，在細胞和分子生物力學中得到了廣泛應用(參見Addae-Mensah KA, Wikswo JP. Measurement techniques for cellular biomechanics in vitro. Experimental Biology and Medicine, 2008, 233: 792 — 809)。
利用光鑷、磁鑷和原子力顯微鏡(AFM)等精密手段，通過細胞表面固定力學探針，可施加小至幾個飛牛頓(10_15 N)的力，正成為細胞力學研究的重要技術手段，并獲得了多項重要禾斗學發(fā)現(xiàn)(參見 Neuman KCj Nagy A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods, 2008， 5: 491 - 505)。如采用AFM和流動腔技術，證實了細胞粘附中存在鍵壽命能夠隨力增加而增力口的‘‘逆鎖鍵，，(參見 Marshall BT, et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature, 2003，423: 190-193)；采用基于 AFM 的單細胞力譜技術，實現(xiàn)了細胞粘附單個受體-配體鍵強度的測量(參見Helenius J, et al. Single-cell force spectroscopy. Journal of Cell Science, 2008， 121: 1785-1791); 采用基于微磁珠的磁扭細胞測量技術，探測到細胞在受到外加短暫拉伸后其力學和動力學行為的改變過程，揭示了一系列新穎的細胞力學行為(參見iTr印at X，et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature, 2007, 447: 592-595)。同時，微納制造技術也開始應用于細胞力學平臺的構建(參見Kim DH, et al. Microengineered Platforms for Cell Mechanobiology. Annual Review of Biomedical Engineering, 2009, 11: 203-233)。其中，采用微流控芯片可對流體介質(zhì)的力學性質(zhì)進行動態(tài)調(diào)節(jié)，具有簡便、高通量的特點；如通過改變微流流速實現(xiàn)了流體介質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，即對粘著細胞的剪切力調(diào)制(參見Lu H, et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry, 2004, 76: 5257-5沈4)。另一方面，利用壓電振動可對表面物質(zhì)進行力學動態(tài)調(diào)控；如采用厚度剪切振動模式的石英壓電諧振器，通過調(diào)節(jié)其激勵電壓改變諧振振幅，實現(xiàn)了外力調(diào)制，使諧振器表面化學結合的病毒微粒割離脫落(參見Cooper MA, et al. Direct and sensitive detection of a human virus by rupture event scanning. Nature Biotechnology, 2001， 19: 833-837)。單細胞力學的關鍵技術之一是對單細胞包括流體介質(zhì)和胞外基質(zhì)的全部環(huán)境同時進行力學動態(tài)調(diào)控。在這個關鍵問題上，現(xiàn)有細胞力學分析技術還存在明顯不足。如以 MAT、AFM為代表的精密手段，需在細胞表面固定微珠等力學探針，通過使微珠運動直接對細胞進行力學刺激，但不能對胞外基質(zhì)進行力學動態(tài)調(diào)節(jié)，即存在胞外基質(zhì)這一環(huán)境調(diào)控盲區(qū)。而細胞與非流體表面接觸形成的胞外基質(zhì)對細胞活動起著十分關鍵的作用，新近發(fā)現(xiàn)作為細胞支撐的胞外基質(zhì)與細胞核之間存在力學耦合(參見Wang N, Tytell JD, Ingber DE. Mechanotransduction at a distance mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2009， 10， 75-82)，因此對胞外基質(zhì)進行力學調(diào)控將具有重要的科學和應用價值。另外，MAT、AFM等技術需要精密、復雜的設備裝置，難以實現(xiàn)與高通量芯片的集成，在實現(xiàn)高通量細胞生物力學分析上存在難以逾越的障礙。目前還沒有能對流體介質(zhì)和胞外基質(zhì)即細胞全環(huán)境同時進行力學動態(tài)調(diào)控的技術報導。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有細胞力學技術存在的上述問題，提供一種單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，可同時對單細胞的流體介質(zhì)和胞外基質(zhì)進行力學動態(tài)調(diào)控，不存在環(huán)境調(diào)控盲區(qū)，并具有簡便靈活、高通量等特點，適用于生物力學、組織工程、藥物篩選、臨床醫(yī)學等領域。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下
所述單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片包含微流控層、壓電振動層和至少一個單細胞池；上述微流控層是具有剛性、絕緣性和生物相容性的材料薄片，在該材料薄片的一面采用通常的微細加工方法制作多個溶液出入孔，另一面微加工至少一個凹阱以及多個各種圖形的微管道，溶液出入孔分別通過微管道與凹阱連通；上述壓電振動層是具有壓電性和生物相容性的材料薄片，在該材料薄片的一面采用通常的微細加工方法制作至少一個凹阱，在該材料薄片的兩面或一面采用通常的薄膜制備方法制作至少一對電極，壓電薄片與其表面的電極對構成壓電微諧振器；微流控層與壓電振動層鍵合構成單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，微流控層與壓電振動層的凹阱兩兩吻合形成上述單細胞池。本發(fā)明將微流控層與壓電振動層在芯片上集成，通過調(diào)節(jié)進入該芯片的微流體的方向和流速進行單細胞的流體介質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，同時通過調(diào)節(jié)該芯片壓電振動的振幅和頻率進行單細胞的胞外基質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，從而在芯片上同時實現(xiàn)單細胞的全環(huán)境的力學動態(tài)調(diào)控。
使用本發(fā)明時，采用通常微流控的方法，導入細胞溶液并使單個細胞定位于單細胞池；然后通入流體介質(zhì)；同時采用通常壓電振動的方法，使壓電振動層與細胞在其表面形成的胞外基質(zhì)(細胞與壓電振動層接觸，在兩者之間的表面存在胞外基質(zhì))產(chǎn)生振動；上述微流控方法包括按各種模式改變流體介質(zhì)的流速，上述壓電振動方法包括按各種模式改變電極對外加電壓的振幅和頻率。本發(fā)明與已有細胞力學技術相比具有以下優(yōu)點和效果
1、本發(fā)明單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，通過將微流控與壓電振動相結合，具有同時對流體介質(zhì)和胞外基質(zhì)的細胞環(huán)境進行全方位力學動態(tài)調(diào)控的優(yōu)點；
2、本發(fā)明單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，可動態(tài)調(diào)控胞外基質(zhì)的力學行為，具有不存在環(huán)境調(diào)控盲區(qū)的優(yōu)點，并能對細胞環(huán)境進行多模式的力學動態(tài)調(diào)控；
3、本發(fā)明單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，具有可陣列化的優(yōu)點，能應用于高通量單細胞力學分析。本發(fā)明設備簡單、方法靈活，適用于檢測、研究力學環(huán)境對細胞的調(diào)控作用，在組織工程、藥物篩選、臨床醫(yī)學等領域具有廣泛的應用前景。


圖1是本發(fā)明的一種單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片示意圖。圖2是本發(fā)明的一種單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片微流控層示意圖。圖3是本發(fā)明的一種單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片壓電振動層示意圖。
具體實施例方式以下結合附圖對本發(fā)明作進一步地說明，但本發(fā)明不限于附圖所示實施例。單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片如圖1所示，由微流控層10、壓電振動層20和至少一個單細胞池30構成。芯片呈平片形，其片面形狀可為圓形、或橢圓形、或邊數(shù)η ？ 3 的η邊形。上述的微流控層10如圖2所示，是具有剛性、絕緣性和生物相容性的材料薄片，如石英、玻璃、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯等無機或有機材料。采用通常的微細加工方法，在該材料薄片的一面制作深5(T200 mm、直徑5(T500 mm的四個溶液出入孔，分別是細胞溶液入孔 11、兩個流體介質(zhì)入孔12、一個溶液出孔13，在該材料薄片的另一面制作至少一個5(Γ200 mm、直徑50 500 mm的凹阱14，以及深50 500 mm、寬100 1000 mm的與溶液出入孔數(shù)量對應的具有各種圖形的微管道。上述的壓電振動層20如圖3所示，是采用具有壓電性和生物相容性的材料薄片， 如石英、鉭酸鋰、鋯鈦酸鉛、偏聚氟乙烯等無機或有機材料以及兩者混合的復合材料，在該材料薄片的兩面(圖3A)采用通常的薄膜制備方法制作厚度為0. 1 10 mm、直徑0. 6飛.0 mm的電極膜21，電極材料包括鉬、金、銀、鈦、鋁等金屬或是多種金屬的復合材料。在該材料薄片的一面采用通常的微細加工方法制作至少一個直徑5(T500 mm的凹阱22，上述凹阱22 位于電極膜21的中心(圖3A)。電極膜21也可制作在材料薄片的一面，如圖:3B，形成一對， 凹阱22則位于兩電極膜21的中間位置。上述的微流控層10與壓電振動層20采用通常的鍵合方法，如熱壓、超聲波微熔融等方法，結成一體構成單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，芯片內(nèi)微流控層10與壓電振動層 20的凹阱兩兩吻合構成單細胞池30。 在該芯片上，采用通常的微流控方法，如采用注射泵調(diào)節(jié)液速進行液流操控，從細胞溶液入口 11導入細胞溶液，同時從入口 12以相同流速通入同一緩沖溶液，使單個細胞31 在微管道中分離，流入單細胞池30后停止溶液流動，細胞進入細胞池后由于壓電振動層的凹阱可使細胞在一定流速以下保持在池內(nèi)，溶液流動由注射泵控制。然后從入口 12通入流體介質(zhì)32，通過改變流體介質(zhì)32的流速，實現(xiàn)流體介質(zhì)32的力學動態(tài)調(diào)控。采用通常的壓電振動方法，如在電極對上外加交流電壓使壓電振動層20振動，同時帶動壓電振動層表面的胞外基質(zhì)33振動。通過改變外加交流電壓的振幅和頻率，改變壓電振動層20振動的振幅和頻率，實現(xiàn)胞外基質(zhì)33的力學動態(tài)調(diào)控。如此，采用該芯片，單個細胞被捕獲在單細胞池30內(nèi)，可同時進行其流體介質(zhì)和胞外基質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控。上述力學動態(tài)調(diào)控包括按各種模式改變上述細胞流體介質(zhì)的流速以及外加電壓的幅度和頻率，如流速、幅度和頻率等參數(shù)隨時間按線性、三角等函數(shù)關系變化。
權利要求
1. 一種單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，其包括微流控層、壓電振動層和至少一個單細胞池；其特征在于所述微流控層與壓電振動層鍵合成一體，構成單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片；所述微流控層由具有剛性、絕緣性和生物相容性的材料薄片制成，其與壓電振動層鍵合面具有多個微管道和至少一個凹阱，另一面有多個溶液出入孔，溶液出入孔分別通過微管道與凹阱連通；所述壓電振動層由具有壓電性和生物相容性的材料薄片制成，其與微流控層鍵合一面具有至少一個凹阱，其一面或兩面上分布有至少一對電極，壓電材料薄片與其表面電極對構成壓電微諧振器產(chǎn)生壓電振動；在所述調(diào)控芯片內(nèi)，微流控層與壓電振動層的凹阱兩兩吻合構成至少一個單細胞池；所述調(diào)控芯片是通過調(diào)節(jié)進入芯片的微流體的方向和流速進行單細胞的流體介質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，同時通過調(diào)節(jié)所述芯片壓電振動的振幅和頻率進行單細胞的胞外基質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，從而在芯片上同時實現(xiàn)單細胞的所有環(huán)境的力學動態(tài)調(diào)控。
全文摘要
本發(fā)明提供一種單細胞全環(huán)境力學動態(tài)調(diào)控芯片，包括微流控層、壓電振動層和至少一個單細胞池，其特征在于，將微流控層和壓電振動層在芯片上集成，通過調(diào)節(jié)該芯片微流體的方向和流速進行單細胞的流體介質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，同時通過調(diào)節(jié)該芯片壓電振動的振幅和頻率進行單細胞的胞外基質(zhì)的力學動態(tài)調(diào)控，從而在芯片上同時實現(xiàn)單細胞的所有環(huán)境的力學動態(tài)調(diào)控。本發(fā)明旨在解決在單細胞力學技術中存在環(huán)境動態(tài)調(diào)控困難的問題，不存在力學動態(tài)調(diào)節(jié)盲區(qū)，并具有簡便靈活、高通量的特點，可在細胞和分子層面上、在時間和空間上發(fā)現(xiàn)細胞的生物力學特性，適合于生物力學、組織工程、藥物篩選、臨床醫(yī)學等廣泛領域應用。
文檔編號G01N33/487GK102279255SQ20101051299
公開日2011年12月14日 申請日期2010年10月20日 優(yōu)先權日2010年10月20日
發(fā)明者單振秀, 王崇均, 王竹青, 韋曉蘭 申請人:重慶工商大學