專(zhuān)利名稱(chēng)：甲型肝炎病毒核酸熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑盒及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甲型肝炎病毒的檢測(cè)試劑盒及其使用方法，具體涉及基于RT-PCR方 法的試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
甲肝病毒(h印atitis Avires, HAV)是廣泛傳播的肝炎致病因子，它主要通過(guò)糞 一口消化道途徑引起人類(lèi)感染。是全球急性傳染性肝炎的主要原因，它可以引起甲型肝炎 暴發(fā)與流行。甲肝傳染源為急性期的病人和亞臨床感染者，他們的糞便、尿液、嘔吐物都可 能污染周?chē)h(huán)境、食物、水源等，被污染過(guò)的食物、水、各種物品充當(dāng)傳染媒介。因近岸貝類(lèi) 養(yǎng)殖區(qū)和海水浴場(chǎng)受到陸源生活污染水污染引發(fā)甲肝流行的事件，在國(guó)內(nèi)外都有過(guò)許多報(bào) 道。由于甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染引起，為了對(duì)該病迅速查明病因，及時(shí)采取 控制措施，急需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速診斷，但傳統(tǒng)甲肝病毒的檢測(cè)方法是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，可是甲 肝病毒不僅增殖周期長(zhǎng)、增殖能力低，且不形成細(xì)胞病變，難以滿(mǎn)足檢測(cè)的要求，不適合早 期診斷。申請(qǐng)?zhí)枮?00910010804. 9的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)了水產(chǎn)品中3種食源性病毒檢測(cè)試劑 盒及其檢測(cè)方法。該試劑盒中包括濃度為5υ/μ L的反轉(zhuǎn)錄-TagDNA聚合酶、濃度為5U/μ L 的反轉(zhuǎn)錄酶及RT-PCR反應(yīng)液；其中的RT-PCR反應(yīng)液中含有IOmM Tris 'HCUSOmM KCl、25mM MgCl2^dNTP各10mM、RNA酶抑制劑40U/ μ L及3種食源性病毒的上下游引物對(duì)各20 μ M ；所
述的引物序列如下 該發(fā)明專(zhuān)利的缺點(diǎn)是特異性程度不高，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是針對(duì)上述技術(shù)缺陷，提供一種快速檢測(cè)甲型肝炎病毒的甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明具有特異性程度高的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，它的引物和探針序列如下上游引物5，-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3，
下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，探針5，-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3，。此外本試劑盒中還包括dNTP，MgCl2, RNase抑制劑，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq酶等，這些 組分對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)屬于公知常識(shí)，可根據(jù)需要選用。本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種上述甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè) 試劑盒的使用方法。本發(fā)明的上述技術(shù)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的一種上述甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，它包括以 下步驟(1)根據(jù)甲型肝炎病毒基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針序列如下上游引物5，-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3，下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，探針5，-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3，；(2)提取待測(cè)樣品RNA，以待測(cè)樣品RNA為模板、在包括步驟(1)所述引物和探針 序列的RT-PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)；(3)對(duì)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光檢測(cè)的最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度 判斷結(jié)果，熒光RT-PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性，則待測(cè)樣品含有甲型肝炎病毒核酸。本發(fā)明關(guān)鍵在于引物和探針序列的設(shè)計(jì)，熒光RT-PCR反應(yīng)體系組成、反應(yīng)條件選 擇和反應(yīng)結(jié)果判斷均可按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。優(yōu)選的，所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系每25 μ L組成如下RT-PCR緩沖液終濃度為1 XExTaq HS (5U/ μ L)(0. IU/ μ L)RT Enzyme Mix II(0. IU/ μ L)上游與下游引物各1. 60 μ M探針1.20 μ M模板 RNA8 μ L
DEPC 水補(bǔ)足至 25 μ L。所述RT-PCR緩沖液為one step RT-PCR緩沖液，其終濃度為1 X，是指緩沖液各組 分在反應(yīng)體系中的終濃度與IXone step RT-PCR中各組分的濃度相同。通常采用反應(yīng)體 系 1/2 體積的 2Xone step RT-PCR0優(yōu)選的，所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為42°C 30min,95°C 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然 后95°C 15s，52°C lmin，在52°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所述樣品RNA提取可按常規(guī)方法進(jìn)行，如采用德國(guó)QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。甲型肝炎是由甲型肝炎病毒感染引起，對(duì)甲型肝炎爆發(fā)疫情盡早作出實(shí)驗(yàn)室確診是及時(shí)采取防控措施與對(duì)診治療的關(guān)鍵。目前甲型肝炎檢測(cè)的幾種方法中常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng) 進(jìn)行病毒分離法雖然正確可靠，但繁雜耗時(shí)，不適應(yīng)早期應(yīng)急診斷；20世紀(jì)80年代建立的 RT-PCR和ICC/PCR(integratedcellculture，PCR)檢測(cè)技術(shù)提高了檢測(cè)的靈敏度和特異 性，且大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，目前已在甲型肝炎病毒的核酸檢測(cè)中得到應(yīng)用，但是需依據(jù)放 射性物質(zhì)標(biāo)記的DNA探針或通過(guò)凝膠電泳中的特定DNA條帶來(lái)判斷檢測(cè)結(jié)果，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi) 力，且給使用帶來(lái)很大不便近。而且容易因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染而產(chǎn)生假陽(yáng)性。因此目前對(duì)甲 肝病毒的檢測(cè)主要采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，而該法只能檢測(cè)到病毒抗原，對(duì)含空泡 病毒(無(wú)核酸)比例很高(50%左右)的甲肝病毒來(lái)說(shuō)，并不能反應(yīng)活性病毒的多少，且不 能確定HAV在檢測(cè)時(shí)一定存在。況且在臨床上患者血清中抗甲肝IgG或IgM于發(fā)病數(shù)日的 黃疸前期才可檢出。由于患者臨床就診與采血的時(shí)間往往處在發(fā)病初期，故在臨床上用IgG 或IgM抗體作為診斷手段不可避免地形成一定程度上的漏檢。然而甲肝最危險(xiǎn)的傳染源不 是明確發(fā)病的急性黃疸型肝炎患者，而是無(wú)黃疸型、隱性感染者，因癥狀不明顯，常被忽視， 這些人群約占甲型肝炎的50 % 90 %。尤其是兒童幾乎都是無(wú)黃疸型肝炎，隱蔽性極強(qiáng)， 但是他們都在不知不覺(jué)中向外界排放甲型肝炎病毒。而采用甲型肝炎病毒核酸檢測(cè)技術(shù)， 非常適用于甲型肝炎的早期診斷(不但可用于現(xiàn)癥病人的早期診斷，可從含有10 100個(gè) 病毒顆粒的糞便標(biāo)本中檢測(cè)出甲型肝炎病毒的基因組RNA)，還可用于亞臨床感染者和隱性 感染者的檢測(cè)以及水、水產(chǎn)品等環(huán)境污染HAV的檢測(cè)，也是進(jìn)行流行病研究的重要手段，在 方法學(xué)上能提高甲型肝炎病毒的檢出率。
近幾年發(fā)展起來(lái)的以特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)，實(shí)行完全閉管 式操作，不僅能大大減少擴(kuò)增產(chǎn)物污染的機(jī)會(huì)，而且較常規(guī)RT-PCR技術(shù)，無(wú)論從敏感性，特 異性與速度上都更具有優(yōu)勢(shì)，當(dāng)然它對(duì)引物和探針的設(shè)計(jì)也提出了更高的要求。本申請(qǐng)發(fā)明人從美國(guó)的NCBI基因庫(kù)上下載了近幾十年來(lái)世界各地的甲型肝炎病 毒毒株，對(duì)其進(jìn)行了同源性比較，在甲型肝炎病毒的保守區(qū)設(shè)計(jì)若干對(duì)引物與Taqman探 針，對(duì)該區(qū)域進(jìn)行特異性擴(kuò)增，從中篩選出最佳的引物和探針，并對(duì)熒光RT-PCR方法進(jìn)行 優(yōu)化，驗(yàn)證其敏感性、特異性和重復(fù)性。經(jīng)甲型肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)株、腸道病毒株與實(shí)際樣本的 檢測(cè)比較，該方法具有高特異性，只能檢出甲型肝炎病毒，與其他腸道病毒如脊髓灰質(zhì)炎病 毒、乙型腦炎病毒、腺病毒、新腸道病毒68、艾柯30、柯薩奇Al以及柯薩奇B5病毒株等毒株 均無(wú)交叉反應(yīng)，而且比常規(guī)RT-PCR法更敏感、快速和簡(jiǎn)便。甲型肝炎病毒的RT-PCR檢測(cè)敏 感度在1. OTCID5tl左右，從病毒核酸提取、RT-PCR反應(yīng)與電泳，整個(gè)過(guò)程大約需6 7h左右， 而采用本方法從核酸提取至完成檢測(cè)，僅需3h左右，能同時(shí)完成多個(gè)臨床樣本的高通量檢 測(cè)，敏感度達(dá)0. ITCID50,比普通PCR的靈敏度高10倍左右，可直接從甲型肝炎患者的糞便 等臨床樣本及雙殼貝類(lèi)如毛蛤、牡蠣等生物中檢測(cè)甲型肝炎病毒核酸。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明方法對(duì)甲型肝炎病毒的檢測(cè)有高度的特異 性，與其他腸道病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒、乙型腦炎病毒、腺病毒、新腸道病毒68、艾柯30、柯 薩奇Al以及柯薩奇B5病毒株等病毒無(wú)交叉反應(yīng)；本發(fā)明方法檢測(cè)的靈敏度達(dá)0. ITCID50, 可直接從雙殼貝類(lèi)如毛蛤、牡蠣等生物等標(biāo)本中檢測(cè)甲型肝炎病毒核酸，從病毒核酸提取 至完成檢測(cè)僅需3h左右。


圖1為熒光定量RT-PCR法檢測(cè)甲型肝炎病毒的靈敏度；1 6分別代表不同的病 毒濃度，從 1 至 6 依次為 IO4UO3UO2UO1,1,0. ITCID50 ；圖2為熒光RT-PCR法檢測(cè)實(shí)際樣本中甲型肝炎病毒核酸；1 甲型肝炎病毒陽(yáng)性 對(duì)照；2至5:實(shí)際樣本的檢測(cè)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此。實(shí)施例一本發(fā)明的試劑盒組成甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，它的引物和探針序列如下上游引物5，-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3，下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，探針5，-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3，。另外，它還包括以下部分制品內(nèi)容(50 μ L反應(yīng)X 100次) 實(shí)施例二試驗(yàn)論證以下試驗(yàn)是利用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行的甲肝病毒檢測(cè)試驗(yàn)以及驗(yàn)證本試劑盒對(duì)于 甲肝病毒檢測(cè)的特異性試驗(yàn)。1材料和方法1. 1 病毒甲肝病毒株由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，脊灰質(zhì)炎病毒、乙型腦炎病毒、腺病毒、新 腸道病毒68、艾柯30、柯薩奇Al以及柯薩奇B5病毒株皆由浙江省疾控中心病毒研究所提{共。1.2引物與探針 上游引物5，-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3，下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，
探針5，-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3，；引物和探針委托上海英俊生物技術(shù)有限公司合成并標(biāo)記。1. 3病毒定量標(biāo)準(zhǔn)與病毒RNA的提取
以甲型肝炎病毒株為標(biāo)準(zhǔn)毒株進(jìn)行病毒效價(jià)滴定((IO5 TCID5(l/ml)后作為參考 株，將其稀釋至10000、1000、100、10、1、0. 1、0. OlTCID5tl每個(gè)反應(yīng)管。病毒RNA的提取采用 德國(guó)QIAGEN公司的Reansy Mini Kit，按試劑盒說(shuō)明書(shū)提取。1. 4熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化試齊[J 盒選用 TakaRa 公司的 one step Prime Script RT-PCR (Perfect Realtime), Code :DRR064A。按說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系為25 μ 1，其中2Xonest印RT-PCR 緩沖液 12.5ul，Ex Taq HS (5U/μ 1) 0. 5ul，RT Enzyme Mix 110. 5ul，上游與下游引物 (20ymol/L)各 0· 8 μ 1，探針(20 μ mol/L) 0· 6 μ 1，模板 RNA 8 μ 1，DEPC 水補(bǔ)足 25 μ 1。反 應(yīng)條件為42°C 30min,95°C 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后95°C 15s，52°C lmin，在52°C進(jìn)行單點(diǎn) 熒光檢測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，結(jié)果判斷選擇熒光檢測(cè)模式FAM，熒光基線(xiàn)調(diào)整取3-15個(gè) 循環(huán)的熒光信號(hào)平均值，閾值設(shè)定以閾值線(xiàn)剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品的最高點(diǎn)，樣本呈典 型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，判斷為陽(yáng)性。無(wú)典型的擴(kuò)增曲線(xiàn)，判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗(yàn)，在以相同 濃度陽(yáng)性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從100 900μπιΟ1/μ 1，探針濃度從50 300 μ mol/μ ，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增 加值(ARn)選擇最佳引物和探針濃度。1. 5RT-PCR 反應(yīng)甲型肝炎病毒RT-PCR引物序列HAV-R(上游)5，-CAGCACATCAGAAAGGAGAG-3，HAV-F (下游)5，-CTCCAGAATCATCTCCAAC-3，擴(kuò)增片斷192bp。采用 TaKaRa 公司 one step RT-kit (code :DRR024A)，按試劑盒 說(shuō)明書(shū)操作，反應(yīng)體系為25μ 1，其中10XRT-PCR緩沖液2. 5ul，MgCl2 2. 5ul (25mM), dNTP 混合物(各 IOmM) 2· 5 μ 1，RNase 抑制劑(40U/ μ 1) 0· 5 μ 1，AMV 酶(5U/ μ 1) 0. 5ul, Taq 酶 (5U/ μ 1) 0. 5ul，上游與下游引物(20 μ M)各 0. 5 μ 1，模板 RNA 8 μ 1，DEPC 水 4. 5 μ 1。反應(yīng) 條件為 50°C 30min,95°C 3min 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后 95°C 20s, 50°C 25s，72°C 30s 進(jìn)行擴(kuò)增，40 個(gè)循環(huán)后轉(zhuǎn)入72°C lOmin，取8μ1產(chǎn)物電泳后判斷有無(wú)特異性條帶(192bp)。1. 6熒光RT-PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)分別選取甲型肝炎病毒、脊灰病毒、乙型腦炎病毒、腺病毒、新腸道病毒68、艾柯 30、柯薩奇Al以及柯薩奇B5病毒分別提取病毒RNA，采用甲肝病毒TaqMan熒光定量RT-PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行檢測(cè)，以考核該體系的特異性；對(duì)已知效價(jià)(IO5TCID5ciAiI)的甲肝病毒株稀 釋成=10000,1000，100，10，1,0. 1,0. OlTCID50,分別提取病毒 RNA，用本研究建立的 TaqMan 熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系進(jìn)行檢測(cè)，考察檢測(cè)下限，對(duì)敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，對(duì)每一個(gè)濃 度的樣本都作3個(gè)重復(fù)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果CT值的平均值和變異系數(shù)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，驗(yàn)證 方法的重復(fù)性。2 結(jié)果2. 1熒光RT-PCR反應(yīng)體系及條件采用TaKaRa公司的一步法熒光RT-PCR試劑盒，總反應(yīng)體系為25 μ 1。矩陣法優(yōu)選后引物最佳濃度均為1. 6 μ M，探針最佳濃度為1. 2 μ Μ，模板RNA 8 μ 1，最后用DEPC水補(bǔ) 至25μ1。用MJ Research Option 2熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)參數(shù)為42°C 30min逆 轉(zhuǎn)錄，95°C變性2min，以95°C 15s，52°C Imin擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，在52°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，可 獲得最低CT值和最高熒光強(qiáng)度。2. 2特異性試驗(yàn)本發(fā)明建立的熒光RT-PCR方法對(duì)甲型肝炎病毒具有較好的特異性，對(duì)其他腸道 病毒如脊灰病毒、乙型腦炎病毒、腺病毒、新腸道病毒68、艾柯30、柯薩奇Al以及柯薩奇B5 病毒等無(wú)交叉反應(yīng)。2. 3敏感性試驗(yàn)已知效價(jià)(l05TCID50/ml)的甲肝病毒株稀釋成10000，1000，100，10，1，0.1， 0. OlTCID50提取病毒RNA，分別用熒光RT-PCR與RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果熒光RT-PCR方 法檢測(cè)敏感性達(dá)到0. ITCID50 (見(jiàn)圖1)。RT-PCR方法檢測(cè)敏感性達(dá)到1. OTCID50,熒光RT-PCR 方法比常規(guī)RT-PCR方法的敏感度高10倍左右。2. 4重復(fù)性試驗(yàn)甲型肝炎病毒株按10倍梯度稀釋成4個(gè)不同濃度，對(duì)每一個(gè)濃度的樣本作3個(gè)重 復(fù)檢測(cè)，CT值的變異系數(shù)在合理范圍內(nèi)(最大為3. 78%，均小于5%)。證實(shí)本研究建立的 HAV TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系重復(fù)性很好。(表2)。表2TaqManRT-PCR檢測(cè)甲肝病毒的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 2. 5實(shí)際樣本的檢測(cè)從市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的毛蛤、牡蠣等雙殼貝類(lèi)生物樣本共50份，直接提取病毒RNA，用本發(fā) 明甲型肝炎病毒熒光RT-PCR方法和普通RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果本發(fā)明甲型肝炎病毒 熒光RT-PCR方法檢測(cè)出甲型肝炎病毒核酸陽(yáng)性4份，普通RT-PCR法檢測(cè)出甲型肝炎病毒 核酸陽(yáng)性3份，本發(fā)明甲型肝炎病毒熒光RT-PCR方法比普通RT-PCR法檢測(cè)甲型肝炎病毒 的陽(yáng)性率高。圖2顯示的是實(shí)際樣本的檢測(cè)圖譜。
權(quán)利要求
甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它的引物和探針序列如下上游引物5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’下游引物5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’探針5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’。
2.甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于所述方法 包括以下步驟(1)根據(jù)甲型肝炎病毒基因序列，設(shè)計(jì)引物和探針序列如下 上游引物5’ -GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’下游引物5，-AAAACCATTCAACGCCGG-3，探針5’ -FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’ ；(2)提取待測(cè)樣品RNA，以待測(cè)樣品RNA為模板、在包括步驟(1)所述引物和探針序列 的RT-PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)；(3)對(duì)RT-PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光檢測(cè)的最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度判斷 結(jié)果，熒光RT-PCR反應(yīng)呈陽(yáng)性，則待測(cè)樣品含有甲型肝炎病毒核酸。
3.如權(quán)利要求2所述的甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法，其 特征在于所述RT-PCR反應(yīng)體系每25 μ L組成如下RT-PCR緩沖液終濃度為1 XEx Taq HS(5U/μ L) (0. IU/μ L) RT Enzyme Mix II (0. IU/μ L) 上游與下游引物各1.60 μ M 探針1.20 μ M模板RNA8 μ LDEPC水補(bǔ)足至25 μ L。
4.如權(quán)利要求2所述的甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒的使用方法， 其特征在于所述熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件為42°C 30min,95°C 2min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后 950C 15s，52°C lmin，在52°C進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于RT-PCR方法的試劑盒及其使用方法。一種甲型肝炎病毒核酸熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，它的引物和探針序列如下上游引物5’-GAAGAGATGCCTTGGATAGGGTAA-3’下游引物5’-AAAACCATTCAACGCCGG-3’探針5’-FAM-AGCGGCGGATATTGGTGAGTTGTTAAGAC-TAMRA-3’本發(fā)明方法對(duì)甲型肝炎病毒的檢測(cè)有高度的特異性，靈敏度達(dá)0.1TCID50，可直接雙殼貝類(lèi)如毛蛤、牡蠣等生物等標(biāo)本中檢測(cè)甲型肝炎病毒核酸，從病毒核酸提取至完成檢測(cè)僅需3h左右。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101838710SQ20101019259
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2010年6月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月4日
發(fā)明者吳曉芳, 徐德順, 紀(jì)蕾, 韓建康 申請(qǐng)人:湖州市疾病預(yù)防控制中心