12種腦炎病毒核酸多重pcr檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測領域，涉及一種利用通用引物介導的多重PCR擴增方法檢測 12種腦炎病毒核酸的試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 病毒性腦炎是由多種病毒引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，因一年四季均可發(fā) 生，故又稱為散發(fā)性腦炎，其發(fā)病率約為（3. 5~7. 4)/10萬，近年來呈逐年上升趨勢，病毒 性腦炎多發(fā)于兒童，該病往往缺乏特異性臨床表現(xiàn)，病情嚴重者腦實質嚴重受損，可導致神 經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，甚至死亡。目前認為，在腦脊液（Cerebrospinal fluids，CSF)中檢出病毒、 病毒核酸或病毒特異性抗體則可明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的病因。用分子生物學檢測方 法在CSF標本中檢出病毒核酸，被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染性疾病病因診斷的標準。
[0003] 引起病毒性腦炎的病毒較多，目前已知國內外報道的就有高達100多種病毒可導 致腦實質或腦膜炎癥病變，并且不斷發(fā)現(xiàn)新的病毒，腦炎發(fā)病率和發(fā)病人群有逐年增加的 趨勢。臨床統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，約20 %的病毒性腦炎是由DNA病毒感染所致，其余均由RNA病毒 感染引起。引起病毒性腦炎的病毒主要有腸道病毒、皰疹病毒（HSV1、HSV2、HHV6、EB、VZV、 HCMV)、流行性乙型腦炎病毒、西尼羅病毒、JC病毒、人T細胞白血病病毒（HTLV1、HTLV2)和 伯氏疏螺旋體。
[0004] 流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis)是由流行性乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV)，又稱日本腦炎病毒，是RNA病毒，引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害為 特征的一種急性傳染病，是一種自然疫源性人獸共患病，是病毒性腦炎中的重要一員，致死 率高達5%~35%，嚴重威脅人類的健康和生命安全。
[0005] 西尼羅病毒（WNV)屬于黃病毒科、黃病毒屬的重要成員，是RNA病毒。人感染W(wǎng)NV 后，通常表現(xiàn)為西尼羅熱、西尼羅病毒性腦炎，極少數(shù)患者表現(xiàn)為嚴重的胰腺炎、肝炎、心肌 炎等。大約有1/300~1/150的西尼羅病毒感染者發(fā)展為腦炎、腦膜腦炎，一般稱為西尼羅 病毒性腦炎，臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、抽搐、意識障礙、腦膜刺激等。西尼羅病毒性腦炎 病死率大約為3~15%，多為老年人或免疫力低下病人。
[0006] 人T細胞白血病病毒（HTLV))是1980年美國人Gallo首先從皮膚型T細胞淋巴 瘤患者體內發(fā)現(xiàn)的第一種人類逆轉錄病毒，按基因組學及血清學反應可分為1型（HTLV-I) 和2型（HTLV-II)。該病毒為球型顆粒，內部由RNA核蛋白及圍繞在外的20面體蛋白衣殼 組成，最外層具有包膜結構，表面鑲嵌有糖蛋白。目前全世界大約有1000到2000萬人感 染HTLV病毒，而在我國的北京、廣西、江西、新疆、柳州、合肥和四川等10多個省市已發(fā)現(xiàn)了 HTLV感染病例，同時某些沿海地區(qū)也出現(xiàn)了局部小規(guī)模流行。HTLV感染細胞主要通過細胞 間感染的方式，游離病毒顆粒是沒有感染能力的。HTLV感染細胞與未感染細胞建立突觸，進 而使病毒蛋白和RNA染色體組進入革El細胞。通過逆轉錄酶使病毒RNA逆轉錄為cDNA，同時 這種前病毒DNA被整合到宿主細胞，最終引起成人T細胞白血病、熱帶痙攣性癱瘓及其他相 關神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0007] 伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferi)屬于原核生物界螺旋體目、螺旋體科疏螺 旋體屬的一種，是一種單細胞疏松盤繞的左旋螺旋體。是由蜱蟲傳播的一種自然疫源性、人 畜共患疾病，通過肩突硬蜱感染人體宿主，可引起多系統(tǒng)器官損害，游走性紅斑、神經(jīng)炎、關 節(jié)炎、心肌炎等。伯氏疏螺旋體在細菌中是最復雜的一個，基因組包含950kb線性染色體， 由不同的線性質粒和環(huán)形質粒組成。對于伯氏疏螺旋體的分子生物學檢測主要是PCR方 法，在大多數(shù)的研究中針對不同的基因序列設計引物，如〇spA、ospC、16S rRNA等。
[0008] 單純性皰疹（Herpes Simplex)是一種由皰疹病毒所致的病毒性皮膚病。單純皰 疹病毒包括單純皰疹病毒I型（HSVI)和單純皰疹病毒II型（HSVII)，其中HSVI首要引起 生殖器以外的皮膚、粘膜（口腔粘膜）和器官（腦）的感染；HSVII首要引起生殖器部位皮 膚粘膜感染，通常認為與宮頸癌發(fā)生有關。
[0009] 水痘一帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV)，在兒童初次感染引起水 痘，恢復后病毒潛伏在體內，少數(shù)病人在成人后病毒再發(fā)而引起帶狀皰疹。多見于成年人和 老年人。成人水痘癥狀較嚴重，常并發(fā)肺炎，死亡率較高。有免疫缺陷的兒童和無免疫力的 新生兒感染水痘，病情兇險，可能是一種致死性感染。如孕婦患水痘除病情嚴重，可導致胎 兒畸形、流產或死亡。
[0010] 人巨細胞病毒（human cytomegalovirus)又稱為涎病毒，是人類皰疹病毒組中最 大的一種病毒。這種病毒進入細胞內以后會導致細胞增大，所以叫做巨細胞病毒。
[0011] ElB病毒（Epstein-Barr)是一種DNA病毒，呈球形，直徑為180nm~200nm，在B淋 巴細胞中復制，為95%以上的成人所攜帶。它是傳染性單核細胞增多癥的病原體，還與鼻咽 癌、兒童淋巴瘤的發(fā)生有密切關系，被列為可能致癌的人類腫瘤病毒之一。
[0012] 人皰疹病毒6型（HHV-6)原發(fā)感染后多無癥狀，少數(shù)可引起幼兒丘疹或嬰兒玫瑰 疹。常急性發(fā)病，先有高熱（39°C數(shù)天）和上呼吸道感染癥狀，退熱后頸部和軀干出現(xiàn)淡紅 色斑丘疹。此外，感染可導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，包括癲癇、腦膜炎和大腦炎等。
[0013] JC病毒為小雙鏈DNA病毒，在人群中廣泛感染，只有一種血清型，可分為30多個基 因型，JC病毒可垂直傳播，也可通過呼吸道、消化道傳播，嚴重免疫抑制患者感染JC病毒后 可引起進行性多灶腦白質病。
[0014] 在腦脊液（Cerebrospinal fluids，CSF)中檢出病毒、病毒核酸或病毒特異性抗 體則可明確中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的病因。病毒分離陽性為中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染性疾病 病原學診斷的標準，但費時、費力，且CSF中病毒含量低，分離的陽性率不高。急性期在CSF 中檢測到病毒的特異性IgM抗體，可作為早期診斷的依據(jù)，但CSF中IgM含量低，且不同病 毒及其血清型需要選擇相應的試劑盒，否則易漏診。PCR的出現(xiàn)，極大的增加了檢測手段的 敏感性，用分子生物學檢測方法在CSF標本中檢出病毒核酸，被認為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)病毒 感染性疾病病因診斷的金標準。但目前缺乏利用PCR方法檢測CSF標本中病毒核酸的試劑 盒，尤其缺乏利用多重PCR方法在一個反應管中同時檢測CSF標本中多種病毒核酸的試劑 盒。
[0015] 多重PCR(Multiplex PCR，M-PCR)是指在同一個反應體系中，加入多對特異性引 物，如果存在與各引物對特異性互補的模板，即可同時在一個反應管中擴增出一條以上的 目的DNA片段，實現(xiàn)了一次性檢測多種病原體的目的。然而，由于多重PCR是在同一 PCR反 應體系里加入多對引物以擴增多個DNA片段的PCR反應，因此同一反應體系中的多對引物 易發(fā)生相互作用，如形成發(fā)卡結構，二聚體結構等，引物對和引物量越多，引物之間的相互 作用越明顯，從而影響PCR擴增效率，進而影響了多重PCR的廣泛應用。

【發(fā)明內容】

[0016] 本發(fā)明解決的技術問題：為了解決同一反應體系中的多對引物之間相互作用的問 題，本發(fā)明采用了通用引物多重PCR擴增技術。通用引物多重PCR擴增是指在特異性引物 的5'端添加一段與待測模板無任何擴增的寡核苷酸序列而進行的PCR擴增，5'端添加的寡 核苷酸序列為通用引物，PCR擴增時嵌合引物濃度通常是通用引物的1/10, PCR擴增的最初 幾個循環(huán)中由嵌合引物的特異性序列進行擴增，富集核酸模板，隨著PCR反應的進行，嵌合 引物逐漸消耗，通用引物由于濃度較大發(fā)揮主要作用，余下循環(huán)中，所有的擴增均通過通用 引物進行擴增，降低了普通多重PCR的擴增偏好性，使得低濃度的核酸模板得到有效擴增， 且由于嵌合引物濃度較低，避免了引物間二級結構的影響。
[0017] 鑒于此，本發(fā)明提供一種特異性強、靈敏度高、通量高的12種腦炎病毒核酸多 重PCR檢測試劑盒，用于檢測腦炎病毒患者腦脊液或血液樣本中的流行性乙型腦炎病毒 (JeV)、人類T淋巴細胞白血病病毒I型（HTLVl)、西尼羅病毒（WNV)、單純皰疹病毒I型 (HSVl)、單純皰疹病毒II型（HSVII)、人皰疹病毒VI型（HHV6)、JC病毒（JCV)、人類T淋巴 細胞白血病病毒Π 型（HTLV2)、伯氏疏螺旋體（BBF)、人巨細胞病毒（