專利名稱：SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測miR-126的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法。
背景技術(shù)：
microRNA(miRNA)是一類有21-25個核苷酸組成的非編碼小分子RNA，其廣泛 存在于真核生物中，其主要功能為在轉(zhuǎn)錄后水平抑制基因表達;miRNA在個體發(fā)育的不 同時期及不同組織中有不同的表達模式，都表明了其在發(fā)育和分化中起有重大的調(diào)控作 用。目前在動物與植物基因組中已發(fā)現(xiàn)4000多種miRNA，估計人類基因組中含1000種 以上miRNA。盡管這些miRNA的生物學功能及其靶基因仍不十分清楚，但可以確定他們 調(diào)控著細胞分化、增殖與死亡等復雜的生物學行為。Wang等人的研究結(jié)果提示，miR-126 能調(diào)節(jié)小鼠胚胎發(fā)育過程中的血管生成；Fish等人研究了鼠胚胎干細胞分化形成的內(nèi)皮 細胞中miRNA的表達情況，也證實miR-126與血管的形成密切相關(guān)，miR-126能夠直接負 調(diào)控 SPREDl(Sprouty-related protein)禾口 PIK3R2/p85β (phosphoinositol_3kinase regulatory subunit 2)的表達，從而促進血管形成的完整性；miR-126除了與血管完整性 有關(guān)，還與內(nèi)皮細胞分裂增殖和遷移能力有密切關(guān)系，對miR-126的表達檢測，可以成為腫 瘤檢測的指標之一。目前為止，對miRNA的檢測方法主要有Northern Blot、原位雜交、基因芯片、熒光 定量探針法，也有報道在miRNA 3’端進行加尾再進行逆轉(zhuǎn)錄的檢測方法；但NorthernBlot 檢測方法敏感度低、耗時長且RNA的用量較大；熒光定量探針法檢測靈敏度高，但檢測費用 昂貴；miRNA 3’端進行加尾再進行逆轉(zhuǎn)錄的檢測方法不能很好的區(qū)分miRNA的前體與成熟 體，特異性不高。要想建立一種特異性高，檢測方便，實驗操作環(huán)節(jié)少的檢測方法，無疑會對 MicroRNA的研究帶來方便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法，具 有實驗操作簡便、檢測成本低、特異性好、靈敏度和自動化程度高等優(yōu)點，可以為MicroRNA 的功能性研究提供可靠的實驗基礎(chǔ)。本發(fā)明提供了一種SYBR Green I熒光定量逆轉(zhuǎn)錄引物，其核苷酸序列組成如下5' GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCAT3'。另外，本發(fā)明還提供了一種SYBR Green I熒光定量檢測引物，其根據(jù)上述逆轉(zhuǎn)錄 引物成功對miR-126進行逆轉(zhuǎn)錄后得到的核苷酸序列，該熒光定量檢測引物由上下游兩條 引物組成，上游引物由19個核苷酸序列組成，詳細序列是5' AGTGCAGGGTCCGAGGTAT3'；下 游引物由25個核苷酸序列組成，詳細序列是5 ‘ GCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATG3 ‘。本發(fā)明還提出了一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法，該檢測方 法包括以下內(nèi)容1)細胞或組織總RNA的提取純化采用分子生物學傳統(tǒng)方法Trizol法提取細胞
3或組織總RNA，并用瓊脂糖電泳鑒定提取的總RNA ；2)逆轉(zhuǎn)錄和檢測引物設(shè)計依據(jù)microRNA專門序列登陸網(wǎng)站上報到的miR-126 (MI0000471)的核苷酸序列， 利用分子生物學軟件Clone Manager Suite 7設(shè)計而成，經(jīng)過實驗鑒定引物可以對miR-126 這種microRNA成功逆轉(zhuǎn)錄，得到逆轉(zhuǎn)錄引物序列；自主設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄引物成功對miR-126進行逆轉(zhuǎn)錄后得到的核苷酸序列，利用分 子生物學軟件Clone Manager Suite 7設(shè)計并且經(jīng)過實驗鑒定引物可以成功檢測miR-126 在生物細胞或組織中的含量，得到熒光定量檢測引物序列；3)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及半定量RT-PCR反應(yīng)利用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物來實現(xiàn)，使用約 IOOng總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA ；以及4) SYBR Green I熒光定量上機檢測，并對熒光定量檢測結(jié)果進行擴增曲線以及熔 解曲線分析，從而對實驗數(shù)據(jù)的可靠性給予評價；最后由公式=MicroRNA的相對表達量= 2_Δ Δετ,計算生物細胞或組織中的MicroRNA的相對含量。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法 至少具有的有益效果是本發(fā)明的檢測方法是通過提取細胞或組織總RNA或小分子RNAj^ 過自主設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再根據(jù)miR-126的相關(guān)核苷酸序列設(shè)計出了熒 光定量PCR檢測引物，來檢測miR-126這種MicroRNA在不同標本中的表達行差異；本方法 具有實驗操作簡便、檢測成本低、特異性好、靈敏度和自動化程度高，可以為MicroRNA的功 能性研究提供可靠的實驗基礎(chǔ)。


圖1是各樣品miR-126和β -actin基因擴增后的電泳圖。圖2是β-actin內(nèi)參基因擴增曲線a和基因的熔解曲線b的變化圖。圖3是miR-126擴增曲線c和基因的熔解曲線d的變化圖。圖4是相對正常組(1)，空載體轉(zhuǎn)染組(2)和過表達載體轉(zhuǎn)染組(3) miR-126的相 對表達量柱狀圖。
具體實施例方式本發(fā)明是建立在熒光定量PCR技術(shù)基礎(chǔ)上的一種利用熒光染料和特異性的逆轉(zhuǎn) 錄引物來實現(xiàn)對目標MicroRNA的定量檢測，發(fā)明技術(shù)內(nèi)容包括如下幾個方面 1細胞或組織總RNA的提取純化采用分子生物學傳統(tǒng)方法Trizol法提取細胞或組織總RNA，并用1 %瓊脂糖電泳 鑒定提取的總RNA。2逆轉(zhuǎn)錄和檢測引物設(shè)計2. ISYBR Green I熒光定量逆轉(zhuǎn)錄引物設(shè)計本發(fā)明的熒光定量逆轉(zhuǎn)錄引物為發(fā)明者依據(jù)microRNA專門序列登陸網(wǎng)站 (http://microrna. sanRer. ac. uk)上報到的 miR-126 (MI0000471)的核苷酸序列，利用分 子生物學軟件Clone Manager Suite 7設(shè)計而成，且經(jīng)過實驗鑒定引物可以對miR-126 這種microRNA成功逆轉(zhuǎn)錄，詳細逆轉(zhuǎn)錄引物序列如下5 ‘ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCAT3 ‘，此逆轉(zhuǎn)錄引物由49個核苷酸序列組成，對miR-126這種 microRNA進行逆轉(zhuǎn)錄后得到的擴增產(chǎn)物為66個核苷酸序列。2. 2SYBR Green I熒光定量檢測引物設(shè)計本發(fā)明的熒光定量檢測引物為發(fā)明者基于自主設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄引物成功對miR-126 進行逆轉(zhuǎn)錄后得到的核苷酸序列，利用分子生物學軟件Clone Manager Suite 7設(shè)計并且 經(jīng)過實驗鑒定引物可以成功檢測miR-126在生物細胞或組織中的含量，此引物由上下游兩 條引物組成，上游引物由19個核苷酸序列組成，詳細序列是5 ‘ AGTGCAGGGTCCGAGGTAT3 ‘， 下游引物由25個核苷酸序列組成，詳細序列是5' GCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATG3‘，此對 引物的檢測擴增片段為62個核苷酸序列。3逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)本發(fā)明的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程是利用發(fā)明者設(shè)計的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物來實現(xiàn)的，使用 約IOOng總RNA為模板，按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。4半定量RT-PCR反應(yīng)半定量RT-PCR反應(yīng)的目的是為熒光定量檢測摸索必要的參數(shù)，比如引物的濃度 及退火溫度等；反應(yīng)在普通的DNA擴增儀上進行，將DNA擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳來評價擴 增是否成功。5SYBR Green I熒光定量上機檢測利用ABI公司的7300/7500等熒光定量PCR儀實施上機檢測，結(jié)果可以實時的觀 測，檢測曲線和數(shù)據(jù)都有儀器自動輸出，檢測反應(yīng)的體系按照熒光定量試劑說明書操作即可。6檢測結(jié)果分析處理對熒光定量檢測結(jié)果進行擴增曲線以及熔解曲線分析，從而對實驗數(shù)據(jù)的可靠 性給予評價；最后由公式=MicroRNA的相對表達量=2_Δ Δετ，計算生物細胞或組織中的 MicroRNA的相對含量。以下通過具體實施例分別介紹上述每個步驟的具體實驗方法實施例一.實驗方法1.根據(jù) miR-126 (ΜΙ0000471)序列和管家基因 β -actin(NM 001101)序列信息設(shè) 計miR-126逆轉(zhuǎn)錄引物和熒光定量檢測引物。序列如表1所示。表lmiR-126逆轉(zhuǎn)錄引物及熒光定量PCR檢測引物引物名稱序列(5，to 3，)擴增片段(bps)miR126-RTGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT66—ATTCGCACTGGATACGACCGCATmiR126-RAGTGCAGGGTCCGAGGTAT62miR126-FGCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATGβ- actin -FAATCTGGGACCACACCTTCT163β- actin -RAGCCTGGATAGCAACGTACA2.總 RNA 抽提每孔細胞中加入Iml Trizol，冰上放置5min，槍頭吹打；將各孔裂解液吸到1. 5ml EP管中，加入氯仿0.2ml/管，用力振搖15s。15-30°C下孵育2_3min，離心(4°C, 12, OOOg, 15min)；離心后液體分為三層(上層_無色水樣層為RNA，中層白色為DNA和底層紅色為 蛋白質(zhì))，小心吸取上層無色液體移入一新的EP管中；加入等體積異丙醇，0. 4-0. SmlJg 勻，_20°C下孵育lh，離心(4°C, 12, 000g, IOmin)；去上清，沉淀加入75%乙醇lml，漩渦振 蕩30s，離心(4°C，7，500g, 5min)；小心去上清，管內(nèi)沉淀在超凈臺中鼓風靜置干燥3-5min。 后每管加入20ul DEPC水溶解，_70°C冰箱保存；細胞總RNA的鑒定瓊脂糖電泳鑒定細 胞總RNA，觀察電泳條帶及各條帶亮度后，測其濃度，準備下步逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。3.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取IOOng總RNA用MMLV-RT逆轉(zhuǎn)錄酶按照說明合成cDNA。具體是先在IOOng總RNA 中加入 oligo dt (25 μ M) 1 μ l，miR_126RT 引物(25 μ Μ) 1 μ 1, IOmM dNTPmixl μ 1，用 DEPC處 理過的滅菌水補足到15. 5 μ 1，混勻，65°C溫育IOmin變性后置于冰上。依次加入RNA酶抑 制劑 0. 5μ 1、MMLV-RT 2XBuffer 2 μ l.DTT 1 μ l.MMLV-RT SPCLl μ 1 (200U/μ 1) 16°C孵育 30min，42°C孵育30min，70°C保溫IOmin滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為下步PCR模板。4.半定量RT-PCR反應(yīng)引物溶解后使用普通PCR反應(yīng)進行條件探索及優(yōu)化，為上機熒光定量檢測摸 索必要的參數(shù)，比如引物的濃度及退火溫度等。反應(yīng)體系設(shè)計為25μ 1總體系，具體是 IOXPCRbuffer 2. 5 μ 1, IOmM dNTPmix 1 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ 1，DNA 聚合酶 0. 3μ 1(2. 5υ/μ 1)，樣品模板2μ 1(約100叫)，用滅菌水補足25111體系。反應(yīng)條件為 950C 5min 預(yù)變性，循環(huán)內(nèi) 95°C 30s 變性，β-actin 基因用 58°C退火 30s (miR-126 用 60°C 退火30s)，72°C延伸25s，PCR反應(yīng)25個循環(huán)后72°C 7min，然后4°C保存。5.實時熒光定量PCR上機檢測按照試劑說明書配好反應(yīng)體系，每個樣本重復3次，上機進行RealTime PCR擴增 和檢測。反應(yīng)體系為20 μ 1總體系，具體是2XMix SYBR Green I熒光反應(yīng)液10 μ 1，上下 游引物(4μΜ)各Ιμ ，樣品模板Ιμ ，用滅菌水補足20μ1體系。反應(yīng)條件95°C、2min預(yù) 變性，循環(huán)內(nèi)95°C、30s變性，60°C退火延伸35s，PCR反應(yīng)設(shè)置40個循環(huán)，并在每個循環(huán)延 伸末端點收集熒光信號，繪制擴增曲線；40個循環(huán)后設(shè)置(95°C、15S，60°C、30S，95°C、15S) 一個繪制熔解曲線的程序，對60°C到95°C整個升溫過程進行全程熒光信號收集，繪制熔解 曲線。
6.檢測結(jié)果分析處理對檢測結(jié)果進行擴增曲線以及熔解曲線分析，從而對實驗數(shù)據(jù)的可靠性給予評 價；基因相對表達量=2_ΔΔ 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11. 5軟件進行統(tǒng)計學分析，配對定量數(shù) 據(jù)用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，P <0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。二.結(jié)果1.半定量RT-PCR結(jié)果用上述1. 4步驟中的PCR反應(yīng)條件分別擴增內(nèi)參基因β -actin (163bp)和 miR-126(163bp)，采用3%瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行電泳檢測，檢測電泳圖照片如圖1所 示，結(jié)果表明，引物設(shè)計較為成功，能擴增出特異性條帶，最后確定了熒光定量PCR檢測的 退火溫度為60°C。(Μ =MarkerlOOLadder ；1,2孔道分別為正常和轉(zhuǎn)染空載體細胞；3、4、5孔道分別為 轉(zhuǎn)染過表達miR-126載體細胞三次重復；陰性對照為用水做模板的擴增。)2.實時熒光定量PCR上機檢測結(jié)果
采用1. 3. 5步驟檢測條件，實時熒光定量PCR檢測擴增曲線、熔解曲線如圖2和3 所示，其中a圖為β-actin內(nèi)參基因擴增曲線，b圖為β-actin內(nèi)參基因熔解曲線，c圖為 miR-126擴增曲線，d圖為miR-126的熔解曲線。3.檢測結(jié)果分析處理檢測結(jié)果進行擴增曲線以及熔解曲線分析。由圖2、3中的b、d變化曲線可知， 兩個基因的熔解曲線顯示內(nèi)參基因β -actin和miR-126PCR產(chǎn)物的Tm值分別為88. 6°C、 82. 1°C，再次說明PCR擴增無非特異性擴增，其擴增是目的基因真實擴增；由基因相對表達 量=2_ΔΔσ，計算得出相對正常組(A)，空載體轉(zhuǎn)染組⑶和過表達載體轉(zhuǎn)染組(C)miR-126 表達量分別為111%、812% ；各組相對表達量柱狀圖如圖4所示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11. 5軟件進行統(tǒng)計學分析，配對定量數(shù)據(jù)用t檢驗進行統(tǒng)計 學分析，過表達載體轉(zhuǎn)染組相對正常組和空載體轉(zhuǎn)染組差異均有統(tǒng)計學意義(P < 0. 05)， 而正常組和空載體轉(zhuǎn)染組相比差異無統(tǒng)計學意義(P > 0. 05)，詳細統(tǒng)計分析參見表2。
表2RT-QPCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 注A組正常對照組；B組轉(zhuǎn)染空載體組；C組轉(zhuǎn)染過表達miR-126載體組； β 1,2,3 β-actin內(nèi)參基因重復檢測三次分別CT值；ml，2，3 :miR_126重復檢測三次分別 CT值；Mean ReL Quant 各組miR-126平均相對表達量。三.結(jié)論
本發(fā)明建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法，具有實驗操作簡 便、檢測成本低、特異性好、靈敏度和自動化程度高等優(yōu)點，可以為MicroRNA的功能性研究 提供可靠的實驗基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
一種SYBR Green I熒光定量逆轉(zhuǎn)錄引物，其特征在于該逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列組成如下5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCAT3′。
2.—種SYBR Green I熒光定量檢測引物，其特征在于該熒光定量檢測 引物由上下游兩條引物組成，上游引物由19個核苷酸序列組成，核苷酸序列是 5 ‘ AGTGCAGGGTCCGAGGTAT3 ‘；下游引物由25個核苷酸序列組成，核苷酸序列是 5' GCCGCTCGTACCGTGAGTAATAATG3‘。
3.一種SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法，其特征在于其包括以下步驟1)細胞或組織總RNA的提取純化；2)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)利用權(quán)利要求1所述的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，使用總RNA為模板，進行逆 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA ；3)半定量RT-PCR反應(yīng)將權(quán)利要求2所述的熒光定量檢測上下游兩條引物作為引物， 利用cDNA作為PCR模板，進行PCR反應(yīng)；以及4)SYBR Green I熒光定量上機檢測在反應(yīng)體系中進行RealTime PCR擴增和檢測， 并對熒光定量檢測結(jié)果進行擴增曲線以及熔解曲線分析，從而對實驗數(shù)據(jù)的可靠性給予評 價；最后由公式=MicroRNA的相對表達量=2_Δ Δετ，計算生物細胞或組織中的MicroRNA的 相對含量。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于所述逆轉(zhuǎn)錄引物是對miR-126這種 microRNA進行逆轉(zhuǎn)錄后得到的擴增產(chǎn)物為66個核苷酸序列；所述檢測引物是對引物的檢 測擴增片段為62個核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種利用SYBR Green I熒光定量PCR檢測miR-126的方法，該檢測方法是提取細胞或組織總RNA或小分子RNA，經(jīng)過自主設(shè)計的逆轉(zhuǎn)錄引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再根據(jù)miR-126的相關(guān)核苷酸序列設(shè)計出了熒光定量PCR檢測引物，來檢測miR-126這種MicroRNA在不同標本中的表達差異。本檢測方法由逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)、PCR擴增反應(yīng)系統(tǒng)和對應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄引物、檢測引物組成。本發(fā)明的檢測方法具有實驗操作簡便、檢測成本低、特異性好、靈敏度和自動化程度高，可以為MicroRNA的功能性研究提供可靠的實驗基礎(chǔ)。
文檔編號G01N21/64GK101899503SQ20101015816
公開日2010年12月1日 申請日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者張茂雷 申請人:廣州博川生物科技有限公司