控制玉米單倍體自然加倍qtl連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記，由bnlg1380和bnlg1792兩對(duì)引物組成，以待測(cè)玉米總DNA為模板，用引物bnlg1380和bnlg1792進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)；如果擴(kuò)增產(chǎn)物具有與分子標(biāo)記bnlg1380和bnlg1792相同的目的條帶，則可判斷待測(cè)玉米含有單倍體雄花育性恢復(fù)基因，單倍體自然恢復(fù)為二倍體的概率較高；如果擴(kuò)增產(chǎn)物不具有與分子標(biāo)記bnlg1380和bnlg1792相同的目的條帶，則可判斷單倍體自然恢復(fù)為二倍體的概率很低。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過分子標(biāo)記的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)玉米產(chǎn)生的單倍體雄花自然加倍的能力，從而省去了化學(xué)加倍煩瑣復(fù)雜的過程，提高單倍體加倍效率，加速單倍體育種技術(shù)的工程化應(yīng)用。
【專利說明】
控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于玉米遺傳育種和分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制玉米單倍體 自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米自交系的選育是培育優(yōu)良品種的核心，而傳統(tǒng)的常規(guī)育種方法選育一個(gè)純合 的自交系的時(shí)間大約需要花費(fèi)6代左右，育種周期長(zhǎng)，成本高，因此如何縮短育種進(jìn)程、提高 育種效率是育種家們一直追求的目標(biāo)。而單倍體育種技術(shù)，能大大縮短自交系的選育年限， 只需兩個(gè)世代就可以獲得純合的雙單倍體系(Doubled Haploid，DH)。玉米單倍體育種技術(shù) 因其環(huán)節(jié)相對(duì)獨(dú)立，容易操作，可以快速實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?，成為我國(guó)玉米育種工程化以至現(xiàn)代化 的重要突破口。
[0003] 單倍體的加倍是單倍體育種技術(shù)大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵限制因素，尤其是雄花的成功 加倍。目前，玉米單倍體常用加倍方法有化學(xué)加倍和自然加倍，化學(xué)加倍主要是利用秋水仙 素和除草劑，其加倍效果容易受藥物的濃度、處理時(shí)間、輔助劑等因素的影響，濃度過高、處 理時(shí)間太長(zhǎng)不僅加重藥害，還會(huì)產(chǎn)生畸形現(xiàn)象;反之，濃度過低、處理時(shí)間太短則達(dá)不到加 倍目的。目前報(bào)道利用秋水仙素加倍的方法主要有:注射法、浸根法、浸種法和浸芽法，但每 一種方法都有不足之處，注射法對(duì)處理時(shí)期和注射部位都有一定要求，如果處理不當(dāng)，將大 大影響此方法的效果;浸根法對(duì)植株傷害嚴(yán)重，存活率低;Gayen等采取秋水仙素浸泡單倍 體種子，結(jié)果有18%的單倍體種子加倍成功，但處理程序比較復(fù)雜。它們共有的缺點(diǎn)是在處 理過程中部分單倍體可能因?yàn)椴僮髦袝?huì)受到傷害導(dǎo)致死亡，另外化學(xué)藥劑會(huì)對(duì)操作人員和 環(huán)境造成不同程度的危害，且不太適宜進(jìn)行規(guī)?；僮鳎瑔伪扼w的自然加倍方法簡(jiǎn)單、快 捷、成本低，顯現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)。
[0004] 前人研究表明，玉米單倍體雌花育性的自然恢復(fù)率可達(dá)90 %以上，但不同基因型 來源單倍體的雄花育性自然恢復(fù)率存在顯著性的差異，有的材料自然加倍率可達(dá)10%左 右，有的材料不發(fā)生自然加倍，可見單倍體的雄花育性恢復(fù)與基因型有很大關(guān)聯(lián)，是單倍體 自然加倍中的關(guān)鍵性狀。吳鵬昊報(bào)道利用正反交的單倍體進(jìn)行育性恢復(fù)的檢測(cè)，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)育性恢復(fù)率沒有顯著性差異，說明單倍體的育性恢復(fù)主要受核基因的控制，不受細(xì)胞 質(zhì)基因的調(diào)控，并且利用鄭單958F 2:3群體對(duì)單倍體雄花育性恢復(fù)進(jìn)行定位，共同檢測(cè)到8個(gè) 相關(guān)位點(diǎn)，分別位于2、3、8和9號(hào)染色體上。為了進(jìn)一步提高單倍體加倍效率，優(yōu)化加倍技 術(shù)，盡早檢測(cè)出單倍體的自然恢復(fù)能力，篩選出有效的檢測(cè)標(biāo)記顯得非常重要。
[0005] 分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)是隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展而產(chǎn)生的新技 術(shù)，它可以從分子水平上快速準(zhǔn)確地分析個(gè)體的遺傳組成，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接 選擇和表型預(yù)測(cè)。對(duì)于誘導(dǎo)率測(cè)定這種耗時(shí)費(fèi)力的性狀，可以在研究其遺傳機(jī)制的基礎(chǔ)上， 篩選出與目標(biāo)性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記來進(jìn)行早期預(yù)測(cè)單倍體的自然加倍能力，以提高育 種效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明提供一種控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記 及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的目的是以下述方式實(shí)現(xiàn)的： 控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記，由bnlgl380和bnlgl792兩對(duì)引物組成， 所述引物bnlgl380的序列為
所述引物bnlgl792的序列為：
[0008] 以待測(cè)玉米總DNA為模板，用引物bnlgl380和bnlgl792進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 凝膠電泳分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)；如果擴(kuò)增產(chǎn)物具有與分子標(biāo)記bnlgl380和 bnlgl792相同的目的條帶，則可判斷待測(cè)玉米含有單倍體雄花育性恢復(fù)基因，單倍體自然 恢復(fù)為二倍體的概率較高;如果擴(kuò)增產(chǎn)物不具有與分子標(biāo)記bnlgl380和bnlgl792相同的目 的條帶，則可判斷單倍體自然恢復(fù)為二倍體的概率很低。
[0009 ]所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記在玉米二倍體產(chǎn)生的單倍體 雄花育性自然恢復(fù)能力預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。
[0010] 所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記在單倍體自身雄花育性自然 恢復(fù)能力預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明通過SSR分子標(biāo)記和QTL分析，在玉米第七號(hào)染色體上位于分子標(biāo)記 bnlgl380和bnlgl792之間存在一個(gè)控制玉米單倍體自然加倍的QTL，它位于第七號(hào)染色體 的7.02位點(diǎn)，其兩標(biāo)記之間的遺傳距離為2. lcm，分析表明該標(biāo)記的有無直接關(guān)系到單倍體 玉米的自然加倍的能力，能夠用于玉米單倍體自然加倍能力的預(yù)測(cè)。
[0012]相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明通過分子標(biāo)記的檢測(cè)可以預(yù)測(cè)玉米產(chǎn)生的單倍體雄花自 然加倍的能力，從而省去了化學(xué)加倍煩瑣復(fù)雜的過程，提高單倍體加倍效率，加速單倍體育 種技術(shù)的工程化應(yīng)用。
【附圖說明】
[0013] 圖1是以鄭58、K22和F2群體的基因組DNA為模板，利用分子標(biāo)記bnlgl380進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型。
[0014] 圖2是玉米分子遺傳連鎖圖譜及其QTL位置圖。
[0015]圖3是以不同遺傳背景田間自然恢復(fù)的單倍體的基因組DNA為模板，利用分子標(biāo)記 bnlgl792進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的帶型。
【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明實(shí)施過程中所用的材料來源： 鄭58:河南農(nóng)科院，K22:陜西省農(nóng)科院，BY815:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，87-1:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 4F1:四平農(nóng)科所，B73:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院。
[0017] 控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記，由bnlgl380和bnlgl792兩對(duì)引物 組成，所述引物bnlgl380的序列為
所述引物bnlgl792的序列為：
[0018]以待測(cè)玉米總DNA為模板，用引物bnlgl380和bnlgl792進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 凝膠電泳分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)；如果擴(kuò)增產(chǎn)物具有與分子標(biāo)記bnlgl380和 bnlgl792相同的目的條帶，則可判斷待測(cè)玉米含有單倍體雄花育性恢復(fù)基因，單倍體自然 恢復(fù)為二倍體的概率較高;如果擴(kuò)增產(chǎn)物不具有與分子標(biāo)記bnlgl380和bnlgl792相同的目 的條帶，則可判斷單倍體自然恢復(fù)為二倍體的概率很低。
[0019]所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記在玉米二倍體產(chǎn)生的單倍體 雄花育性自然恢復(fù)能力預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。
[0020] 所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記在單倍體自身雄花育性自然 恢復(fù)能力預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。
[0021] 實(shí)施例1:單倍體雄花育性自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn) 1.制備F2代植株 利用單倍體雄花自然恢復(fù)率低的玉米自交系鄭58為親本UPD與單倍體雄花育性自然 恢復(fù)率較高的玉米自交系K22為親本2(P2)進(jìn)行雜交，得到的雜交種子為Fi代種子，將Fi代種 子進(jìn)行播種得到的植株即為Fi代植株，將Fi代植株自交，得到的種子為內(nèi)代種子。
[0022] 2.玉米F2:3家系群體的單倍體的性狀鑒定群體的構(gòu)建及單倍體雄花自然恢復(fù)率的 統(tǒng)計(jì) 取親本1、親本2和&代群體單株幼苗期(5片真葉期以后)的少量葉片，利用玉米基因組 DNA快速提取方法，提取單株基因組DNA。
[0023] ^代植株自交得到F2:3群體，種植F2:3家系的群體并利用自選的孤雌生殖誘導(dǎo)系進(jìn) 行誘導(dǎo)產(chǎn)生玉米單倍體，就獲得F2:3家系群體的單倍體的性狀鑒定家系。
[0024] 2014年夏和2014年冬分別在河南鄭州、海南三亞種植F2:3家系群體的單倍體，并對(duì) 單倍體雄花是否能夠產(chǎn)生可育的花粉進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
[0025] 3.遺傳圖譜構(gòu)建及QTL分析 在兩個(gè)親本間進(jìn)行多態(tài)性的標(biāo)記的篩選，篩選出來的差異標(biāo)記，對(duì)284個(gè)分離的^單株 玉米葉片的總DNA，采用微衛(wèi)星（simplesequence repeat，SSR)分子標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝膠上分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)。
[0026] PCR體系：模板DNA 20ng/yl 2yl，引物20ng/yl 1.5yl，dNTPs 0.5mmol/l 0.3yl， 10 X buff er(含MgC12) 1 ? 5yl，TaqDNA聚合酶（0 ? 5U)0 ? 2yl，ddH20 5yl，總反應(yīng)體系 10 ? 5yl。 TaqDNA聚合酶購于上海生工生物工程有限公司。
[0027] PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C 3min; 8 個(gè)循環(huán) 95 °C lmin，65 °C lmin，-l°C/cycle，72 °C lmin; 28 個(gè)循環(huán) 951€4586(3,581€4586(3,72°(：1111111;72°(：1〇111111 ;4°(：保存。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3111 loading buffer，95°C變性5min，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028]上述標(biāo)記的檢測(cè)方法為6%的聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)。1XTBE為電泳緩沖液，55W的恒 定功率，電泳1小時(shí)。電泳后進(jìn)行固定、銀染、顯影。固定方法為：在固定液（900ml蒸餾水+ 100ml乙醇+5ml冰乙酸)浸泡15-20分鐘，在放銀染液之前用蒸餾水清洗30秒，然后浸泡在銀 染液（1.5L蒸餾水+3g AgN03) 10-15分鐘；蒸餾水清洗30秒；最后浸泡顯影液（1.5L蒸餾水+ 30gNa0H+7.5ml甲醛)顯影5-10分鐘，用清水沖洗。
[0029] 電泳之后記錄分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)，擴(kuò)增帶型如圖1所示，圖中，1-2、7_12和15-16 (即H)為雜合帶型，3和5-6(即P2)為與自交系K22-致的帶型，4和13-14為（即P1)為與自交 系鄭58-致的帶型。表1為1 -16每個(gè)單株對(duì)應(yīng)的單倍體的平均自然恢復(fù)率。 表1每個(gè)單株對(duì)應(yīng)的單倍體的平均自然恢復(fù)率
[0030] 將電泳之后記錄的數(shù)據(jù)利用mapmaker軟件進(jìn)行連鎖圖譜的構(gòu)建，然后結(jié)合F2:3家 系群體單倍體雄花自然恢復(fù)率的表型，用WinQTLCart 2.5復(fù)合區(qū)間作圖法（Composite Interval Mapping，CIM)進(jìn)行QTL的掃描定位和效應(yīng)估計(jì)。
[0031] 本發(fā)明應(yīng)用優(yōu)良自交系鄭58和K22雜交得到的F2代分離群體進(jìn)行分子標(biāo)記連鎖圖 譜的構(gòu)建，對(duì)F2:3家系群體進(jìn)行生物誘導(dǎo)，所產(chǎn)生的單倍體群體用于雄花育性自然恢復(fù)QTL 定位，鑒定出與雄花育性自然恢復(fù)QTL緊密連鎖的分子標(biāo)記。
[0032] 2014年夏和2014年冬分別在河南鄭州和海南三亞種植F2:3家系的單倍體并進(jìn)行雄 花自然散粉率性狀的調(diào)查，共鑒定了 12個(gè)QTL，其中在兩地均檢測(cè)到的QTL有5個(gè)，表現(xiàn)出大 量的QTL與環(huán)境的互作。兩點(diǎn)的定位結(jié)果共同將QTL定位在第七染色體的7.02bin的 bnlgl792_bnlgl380區(qū)段之間，其兩標(biāo)記之間的遺傳距離為2. lcm，附圖2為分子標(biāo)記與QTL 連鎖情況。該QTL由來自于K22，起增效作用。
[0033] 實(shí)施例2: 利用本發(fā)明所涉及的兩個(gè)標(biāo)記引物對(duì)來自于K22和鄭58雜交后代不同單株的DNA進(jìn)行 基因檢測(cè)，來判斷其單倍體是否能夠具有自然加倍的能力，本發(fā)明對(duì)定位群體進(jìn)行基因型 檢測(cè)并對(duì)其后代單倍體雄花育性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果表明：雄花自然恢復(fù)率在40%以上的家系， 其對(duì)應(yīng)的二倍體植株含K22帶型的為86.27%和85.11 % (結(jié)果見表2)。 表2 F2:3家系單倍體在兩地自然散粉率在40%以上的家系所對(duì)應(yīng)的F2單株標(biāo)記類型
1表示未含K22的帶型;0表示未出帶類型;3表示含有K22的類型
[0034] 實(shí)施例3: 利用本發(fā)明所涉及的兩個(gè)標(biāo)記引物對(duì)20株來自不同遺傳背景材料田間表現(xiàn)出自然加 倍的單倍體DNA進(jìn)行基因檢測(cè)，結(jié)果表明自然加倍的單倍體中90%的單倍體植株中均含有 K22帶型或與K22相同的帶型（結(jié)果見表3)。利用分子標(biāo)記bnlgl792檢測(cè)不同遺傳背景田間 自然恢復(fù)的單倍體的擴(kuò)增帶型如圖3所示，其中，其來源分別是1 -7: BY815 X K22，8-10: K22 X87-iai-12：4FlXK22〇 表3不同遺傳背景自然加倍單倍體所對(duì)應(yīng)的標(biāo)記類型
1表示未含K22的帶型，0表示未出帶，2表示來自K22或同K22相同的帶型，X表示雜交
[0035]以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說， 在不脫離本發(fā)明整體構(gòu)思前提下，還可以作出若干改變和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的 保護(hù)范圍。 SEQUENCE LISTING <110> .河南農(nóng)業(yè)大學(xué) <120>控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記及其應(yīng)用 <130> 2 <160> 2 <170> Palcnlln version 3 J <210> 1 <2!1> 20 <212> DNA <213> 玉米（Zea mays L.) <400> 1 acaalicgal cgagagcgag 20 <210> 2 <21 卜 20 <212> ：D.NA 玉米（Zeamays L.) <400-> 2 ccUtcltgc [ggiicligc 20 <210> 1 <211> 20 <212> HNA <213> 玉米（ZearaaysL,) <4〇〇> 1 gcgctccltc accllclUa 20 <210> 2 <211〉 20 <212> DNA <213> . .k 米（Zea mays L.) <400> 2 egggaatgaa taagccaaga W
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于：由bnlgl380和bnlgl792 兩對(duì)引物組成，所述引物bnlgl380的序列為 SEQ ID NOiFl^7- ACAATTCGATCGAGAGCGAG- 37 SEQ ID N0:R1:57- CCTTTCTTGCTGGTTCTTGC-37; 所述引物bnlgl792的序列為： SEQ ID GCGCTCCTTCACCTTCTTTA-37 SEQ ID NOiI^j'-CGGGAATGAATAAGCCAAGA-S^2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記的方法，其特征 在于：以待測(cè)玉米總DNA為模板，用引物bnlgl380和bnlgl792進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠 電泳分離后，獲得分子標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)；如果擴(kuò)增產(chǎn)物具有與分子標(biāo)記bnlgl380和 bnlgl792相同的目的條帶，則可判斷待測(cè)玉米含有單倍體雄花育性恢復(fù)基因，單倍體自然 恢復(fù)為二倍體的概率較高;如果擴(kuò)增產(chǎn)物不具有與分子標(biāo)記bnlgl380和bnlgl792相同的目 的條帶，則可判斷單倍體自然恢復(fù)為二倍體的概率很低。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記在玉米二倍體 產(chǎn)生的單倍體雄花育性自然恢復(fù)能力預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制玉米單倍體自然加倍QTL連鎖的分子標(biāo)記在單倍體自身 雄花育性自然恢復(fù)能力預(yù)測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105821140SQ201610327143
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】李浩川, 劉宗華, 楊繼偉, 曲彥志, 湯繼華, 丁冬, 付志遠(yuǎn), 李衛(wèi)華
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)