一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法
【專利摘要】一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。其包括以下步驟：1）收集冬孢子；2）冬孢子懸液；3）冬孢子培養(yǎng)；4）單孢分離培養(yǎng)；5）顯微觀察；6）性親和菌株篩選；7）PCR鑒定。通過以上方法可快速穩(wěn)定地篩選得到菰黑粉菌單倍體菌株，同時通過融合實驗初篩及PCR驗證交配型基因可準(zhǔn)確地獲得配對的性親和單倍體菌株。CGMCC No.1184420151207CGMCC No.1184220151207CGMCC No.1184120151207CGMCC No.1184320151207
【專利說明】
一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]菰黑粉菌屬于擔(dān)子菌亞門黑粉菌屬，是一種典型的二型態(tài)真菌，與玉米瘤黑粉菌近源。目前為止，茭白是其所知的唯一寄主，而茭白孕茭是茭白植株與該專一性地寄生在體內(nèi)的菰黑粉菌共同作用的結(jié)果。至今，茭白的種植及保種育種還是采用茭墩分離篩選的方式，人力物力投入較大，而且菰黑粉菌存在多個生理小種，其可能混合存在于茭白植株中，造成茭白品種性狀不穩(wěn)定，退化明顯。因此采用人工接種方式是茭白育種的發(fā)展方向。
[0003]研究表明菰黑粉菌的兩個性親和單倍體混合接種可以使野茭植株孕茭，即植株莖基部發(fā)生膨大，而非性親和單倍體菌株混合、單一單倍體菌株、雙核菌絲或冬孢子接種均無法使野茭植株孕茭(及由近源的玉米瘤黑粉菌研究進(jìn)展可知黑粉菌的侵染需要兩個性親和單倍體一起混合接種)，因此，菰黑粉菌性親和單倍體的獲得是保障茭白人工育種的前提。而由于自然界中菰黑粉菌以冬孢子或者雙核菌絲存在，沒有單倍體菌株。目前普遍采用的分離方法得到的菰黑粉菌一般是雙核菌絲，而采用體外梯度稀釋培養(yǎng)方式獲得的菌株大部分為雜合的單倍體菌株或者雙核菌絲，該方法不能標(biāo)準(zhǔn)化，無法保證產(chǎn)物的穩(wěn)定性。
[0004]因此我們通過對菰黑粉菌生活史及其生理特性研究，建立了一種快速穩(wěn)定分離菰黑粉菌單倍體菌株的方法，并進(jìn)行了成對的性親和單倍體菌株的簡易篩選鑒定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法的技術(shù)方案。
[0006]所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于包括以下步驟:
1)收集冬孢子:從龍茭2號灰茭直接挑取冬孢子;從龍茭2號正常茭挑取冬孢子；
2)冬孢子懸液:將挑取的冬孢子堆置于5mL無菌水中，經(jīng)過濾，獲得較純的冬孢子懸液，再用無菌水將冬孢子懸液稀釋成終濃度為13個孢子/mL;
3)冬孢子培養(yǎng):取100yL冬孢子懸液涂布于擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)60 h，以肉眼可見細(xì)小分散的單菌落為標(biāo)準(zhǔn)；
4)單孢分離培養(yǎng):挑取單個肉眼可見的菌落至清水中，稀釋成13個孢子/mL，每次取IHL置于顯微操作儀下用毛細(xì)吸管吸取單個擔(dān)孢子，將分離出的擔(dān)孢子在YEPS固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4 d；
5)顯微觀察:對擔(dān)孢子形成的菌落形態(tài)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，若菌落邊緣光滑則可初步鑒定為單倍體菌株，若邊緣產(chǎn)生了菌絲，則舍棄；
6)性親和菌株篩選:將初步鑒定的單倍體菌株編號，并用YEPS液體培養(yǎng)基分別稀釋成濃度為OD6qq為1.5-2.0的菌液，通過融合反應(yīng)實驗對性親和菌株進(jìn)行初步鑒定，培養(yǎng)后若可見白色氣生菌絲，則混合培養(yǎng)的兩個菌株可能為性親和單倍體菌株；
7)PCR鑒定:設(shè)計特異性引物用于進(jìn)一步對篩選得到的兩個性親和單倍體進(jìn)行PCR驗證，如性親和單倍體菌株能通過不同的特異性引物擴(kuò)增出長度在600 bp左右的片段，則確定為兩個性親和單倍體菌株，所述的特異性引物為引物pra1-F、引物pral-R、引物pra2_F、弓丨物pra2-R、引物pra3-F和引物pra3-R，所述的引物pral-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物pral-R的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，引物pra2_F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，引物pra2-R的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，引物pra3_F的核苷酸序列如SEQ IDN0:5所示，引物pra3-R的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0007]所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟2)中采用4層滅菌紗布過濾。
[0008]所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟3)中擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基含有以下組分:Κ2ΗΡ04 0.85-1.15 g/1,MgSO4.7H20 0.45-
0.55g/l,FeSO4.7H20 0.008-0.012g/l，KC1 0.45-0.55g/l，葡萄糖 16-20 g/1, (NH4)2SO45.0-5.5 g/1，瓊脂 10-15 g/1。
[0009]所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟6)中融合反應(yīng)實驗具體過程為:
a、選取一個單倍體菌株菌液先在YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點樣，每個點IuL，總點樣數(shù)為分離得到的單倍體菌株數(shù)；
b、將分離得到其它單倍體菌株的菌液各取IUL分別覆蓋于步驟a中的菌點上方，標(biāo)記菌株號，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 do
[0010]所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟7)中PCR條件為:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液5 yL，dNTP 4 yL，上游引物IyL，下游引物I yL，DNA模板I yL，Taq酶0.5 yL，加ddH20至50 yL;PCR擴(kuò)增程序為94 0C 4min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C 2 min，30個循環(huán)；72 °C 10 min；4 °C 終止。
[0011]通過以上方法可快速穩(wěn)定地篩選得到菰黑粉菌單倍體菌株，同時通過融合實驗初篩及PCR驗證交配型基因可準(zhǔn)確地獲得配對的性親和單倍體菌株。
【附圖說明】
[0012]圖1為菰黑粉菌單倍體菌株的分離及配對性親和單倍體菌株篩選流程圖；
圖2為冬孢子在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)后的菌經(jīng)PI染色后熒光顯微觀察圖；
圖3為兩個性親和單倍體菌株在不同碳氮源培養(yǎng)基上融合生長表型圖；
圖4為灰茭和正常茭白中菰黑粉菌性親和單倍體菌株的分離及鑒定；
圖5為菌種及交配型基因的PCR鑒定結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0013]以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。
[0014]實施例1:菰黑粉菌交配型位點的克隆分析
根據(jù)在不同菰黑粉菌單倍體菌株中獲得的部分a位點基因序列，結(jié)合實驗室前期的菰黑粉菌基因組測序及部分菌株重測序結(jié)果，分析發(fā)現(xiàn)在菰黑粉菌中存在三個交配型a位點，分別為Ue al，Ue a2和Ue a3，Ue al的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示，Ue a2的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示，Ue a3的左端基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，Ue a3的右端基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:10所示。其中Ue al包含了部分lba( 1-197 bp)、panC(7322_8000 bp)，完整的pral(4122-5437 bp)、mfal.2(1131-1250 bp)^mfal.3(2786-2911 bp)、rba(6652-7083 bp)，片段總長8000 bp；Ue a2包含了部分lba( 1-277 bp)、panC(8836_9594bp)，完整的pra2(2204-3421 bp)、mfa2.1(7330-7452 bp)、mfa2.3( 1212-1331 bp)、rba(8307-8597 bp);而Ue a3的位點基因比較特殊，a位點的基因被中間至少間距10kb的堿基隔斷，將其分為兩個片段，左端包含了完整的lba(l-1650 bp)、mfa3.2(2590-2709 bp)、pra3(4015-5493 bp)，片段總長5493 bp;右端包含完整的panC(771_2066 bp)、rba(2305-2595bp)、mfa3.1(3445-3567 bp)，片段總長4144 bp。
[0015]由其它物種的研究表明，Iba、rba以及panC在不同物種間具有較高的同源性，同時我們對獲得的菰黑粉菌中Ue al、Ue a2和Ue a3三個位點中的lba、rba以及panC三個基因進(jìn)行序列比對分析后發(fā)現(xiàn)三者之間的相似度在99%以上，序列基本一致，而mfa的基因序列長度在100-150 bp左右，產(chǎn)物片段太短檢測比較費力，因此pra基因是區(qū)分菰黑粉菌中的Ueal、Ue a2和Ue a3三個位點的比較好的選擇對象。pral的核苷酸序列如SEQ ID N0:11所示，pra2的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，pra3的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0016]
實施例2:快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法
I)收集冬孢子:龍茭2號灰茭(圖1B)直接挑取冬孢子。
[0017]2)冬孢子懸液:將挑取的冬孢子堆置于5 mL無菌水中，經(jīng)4層滅菌紗布過濾，獲得較純的冬孢子懸液，最后再用無菌水將冬孢子懸液稀釋成終濃度為13個孢子/mL。冬孢子形態(tài)如圖1C所示。
[0018]3)冬孢子培養(yǎng):取100 yL冬孢子懸液涂布于擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)約60h，以肉眼可見細(xì)小分散的單菌落(圖1D)為標(biāo)準(zhǔn)。擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基(I L)配方為:K2HPO4
0.85-1.15 g,MgSO4.7H20 0.45-0.55g,FeSO4.7H20 0.008_0.012g，KCl 0.45_0.55g，葡萄糖 16-20 g, (NH4)2SO4 5.0-5.5 g，瓊脂 10-15 g。
[0019]4)單孢分離培養(yǎng):挑取單個肉眼可見的菌落至清水中，稀釋成13個孢子/mL，每次取I yL置于顯微操作儀下用毛細(xì)吸管吸取單個擔(dān)孢子(圖1E)，將分離出的擔(dān)孢子在YEPS(2%蛋白胨，2%蔗糖，1%酵母粉，1.5%瓊脂粉)固體培養(yǎng)基上，28 0C培養(yǎng)4 d。一個單菌落分離5個擔(dān)孢子，取3個以上單菌落。擔(dān)孢子培養(yǎng)后的菌落形態(tài)如圖1F所示。
[0020]5)顯微觀察:對擔(dān)孢子形成的菌落形態(tài)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，若菌落邊緣光滑(圖1G)則可初步鑒定為單倍體菌株，若邊緣產(chǎn)生了菌絲(圖1H)，則舍棄。
[0021]6)性親和菌株篩選:將初步鑒定的單倍體菌株編號(圖1F)，并用YEPS液體培養(yǎng)基分別稀釋成濃度為0D_為1.5-2.0的菌液。通過融合反應(yīng)實驗對性親和菌株進(jìn)行初步鑒定。融合反應(yīng)實驗如圖1I，具體過程為:將I號菌液先在YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點樣，每個點I μL，總點樣數(shù)為分離得到的單倍體菌株數(shù)。之后將剩余的各菌液各取I UL分別覆蓋于I號菌株菌點上方，標(biāo)記菌株號，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d。培養(yǎng)后對菌落形態(tài)進(jìn)行肉眼觀察，若可見白色氣生菌絲，則混合培養(yǎng)的兩個菌株可能為性親和單倍體菌株。如圖1I中所示，I號菌株與2、3、4、8或11號菌株可能為性親和單倍體菌株。
[0022]7.PCR鑒定:眾所周知，一個單倍體菌株中只可能存在一個pra基因，而兩個性親和的單倍體菌株中pra基因不一樣。因此設(shè)計特異性引物用于進(jìn)一步對篩選得到的單倍體進(jìn)行PCR驗證并進(jìn)一步確認(rèn)彼此間的性親和性。
[0023]以上述篩選到的12個單倍體菌株為例，提取各菌株的DNA，先通過引物ITSl和ITS4擴(kuò)增ITS序列并測序進(jìn)行菌種鑒定，PCR結(jié)果如圖5D所示，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對后表明均屬于Ustilago esculenta。
[0024]接下來對各個菌株基因組DNA中的pral，pra2和pra3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5A，B，C所示，表明2、4號菌株的信息素受體基因為pra3，3、8、ll號菌株的信息素受體基因為pra2，其余菌株的信息素受體基因為pral，即我們篩選得到的菌株I信息素受體基因為pral，與2、3、4、8或11號菌株的基因型不一樣，因此I號菌株與2、3、4、8或11號菌株為性親和單倍體菌株。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液5 yL，dNTP 4 yL，上游引物I yL，下游引物I yL，DNA模板I yL，Taq酶0.5 yL，加ddH20至50 yl^PCR擴(kuò)增程序為94 °C 4 min；94 °C 30 s，55°C 30 s，72 °C 2 min，30個循環(huán)；72 V 10 min；4 °C終止，擴(kuò)增片段長度均在600 bp上下，引物序列如下:
ITSl:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO: 14所示)， ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ (核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示)， pral-F:5’-ATCGGCATCCTCGCTCATTATG-3’ (核苷酸序列如SEQ ID 勵:1所示)， pral-R:5’-TGCATGCTTGATCTCCGTTGCG-3’ (核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示)， pra2-F:5’-ACAGCACGCTTCCCACCTTTTC-3’ (核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示)， pra2-R:5’-GACAAAGCAGCAGTGAACTGCC-3’ (核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示)， pra3-F:5’-CACAATTCCCATCACGGTGCTC-3’ (核苷酸序列如SEQ ID N0:5所示)， pra3-R:5’-GAGCGAGAGCACTGATGGAAAG-3’ (核苷酸序列如SEQ ID 勵:6所示)。
[0025]8.確定單倍體菌株:當(dāng)采用引物pral-F和pral-R擴(kuò)增后得到長度在600 bp上下擴(kuò)增片段的菌株命名為單倍體菌株UETl，當(dāng)采用引物pra2-F和pra2-R擴(kuò)增后得到長度在600bp上下擴(kuò)增片段的菌株命名為單倍體菌株UET2。單倍體菌株UETl和UET2，菌落形態(tài)如圖4A和圖4B所示，在YEPS培養(yǎng)基上進(jìn)行融合反應(yīng)，結(jié)果如圖4C所示，UETl和UET2可以融合形成白色氣生菌絲，對菌絲基因組進(jìn)行PCR鑒定后表明菌絲中同時含有pral和pra2基因。
[0026]菰黑粉菌(Ustilago esculenta)UETl菌株于2015年12月07日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC N0.11843，保藏單位地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。菰黑粉菌(Ustilago esculenta)UET2菌株于2015年12月07日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC N0.11844，保藏單位地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0027]同樣的，從龍茭2號正常茭白中也分離得到了兩個單倍體菌株，分別命名為UEMT2和UEMT3，菌落形態(tài)如圖4D和圖4E所示，經(jīng)PCR驗證后表明UEMT2只含有pra2基因，UEMT3只含有pra3基因，證明它們是性親和的單倍體菌株。在YEPS培養(yǎng)基上進(jìn)行融合反應(yīng)，結(jié)果如圖4F所示，UEMT2和UEMT3可以融合形成白色氣生菌絲，對菌絲基因組進(jìn)行PCR鑒定后表明菌絲中同時含有pra2和pra3基因。菰黑粉菌(Ustilago esculenta)UEMT2菌株于2015年12月07日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCCN0.11841。保藏單位地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。菰黑粉菌(Ustilagoesculenta)UEMT3菌株于2015年12月07日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏號為CGMCC N0.118420保藏單位地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
[0028]對菌落形態(tài)對比后我們發(fā)現(xiàn)不同基因型的單倍體菌株形態(tài)沒有明顯區(qū)別，但是分離自灰茭的兩個單倍體菌株體外融合能力遠(yuǎn)高于分離自正常茭白的兩個單倍體菌株。
[0029]實施例3:擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基選擇
本發(fā)明中擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基是關(guān)鍵，篩選結(jié)果表明葡萄糖和(NH4)2SO4的組合可以有效抑制性親和單倍體孢子融合形成菌絲，使冬孢子萌發(fā)形成的擔(dān)孢子一直保持芽殖生長階段，避免了分離培養(yǎng)過程中提前形成雙核菌絲等干擾形態(tài)，使整個過程可以達(dá)到快速穩(wěn)定的效果。由于自然環(huán)境中無純的單倍體擔(dān)孢子，我們分離的樣品為雙核菌絲或者二倍體冬孢子，若使用常規(guī)的PDA或YEPS或基礎(chǔ)培養(yǎng)基(即更換擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基中的碳源葡萄糖和氮源(NH4)2S04，選擇其它碳源如蔗糖、半乳糖等或其它氮源如KNO3,尿素等)，在第3步冬孢子培養(yǎng)24 h后均會出現(xiàn)雙核菌絲，50 h后幾乎全部形成菌絲，無法分離得到單倍體，而其中部分形態(tài)如單倍體的多核的菌絲更會對實驗者造成干擾，造成人力物力的浪費。圖2A為冬孢子在常規(guī)PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后的菌形態(tài)，其形態(tài)如擔(dān)孢子，但經(jīng)PI染色后可見多個核，表明其為多核菌絲(白色箭頭所示)。而圖2B為冬孢子在擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基上培養(yǎng)60 h后的菌形態(tài)，經(jīng)PI染色后發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)中的菌均為單核。
[0030]最佳的擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基篩選過程如下:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(K2HPO4 I g,MgSO4.7H20
0.5 g,FeSO4.7H20 0.01g，KCl 0.5 g，瓊脂10 g，l L)中添加不同的碳氮源，檢測其對性親和菌株融合能力的影響，已期篩選得到能夠抑制性親和單倍體菌株體外融合的培養(yǎng)基，使單倍體菌株始終保持芽殖生長狀態(tài)。在碳氮源篩選過程中，我們分別選用了半乳糖，葡萄糖，果糖，山梨醇，甘露醇，蔗糖，乳糖，麥芽糖作為碳源;硝酸鉀，硝酸銨，硫酸銨，谷氨酸鈉，甲硫氨酸，精氨酸，尿素，蛋白胨作為氮源;其中碳源以C6為單位，濃度為20 mm/L，氮源以N1為單位，濃度為100 mm/L。以硝酸鉀為氮源，我們首先將分離得到的菰黑粉菌性親和單倍體在不同碳源培養(yǎng)基上進(jìn)行融合實驗。發(fā)現(xiàn)在葡萄糖培養(yǎng)基上性親和菌株融合能力最弱，表現(xiàn)為融合時間最遲及融合菌絲長度最短，圖3A。因此我們以葡萄糖為碳源，在不同的氮源培養(yǎng)基上進(jìn)行融合實驗，結(jié)果如圖3B所示，當(dāng)硫酸銨作為氮源時兩個性親和菌株不能進(jìn)行融合反應(yīng)，表現(xiàn)為菌落邊緣光滑，無融合菌絲形成。
【主權(quán)項】
1.一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)收集冬孢子:從龍茭2號灰茭直接挑取冬孢子;從龍茭2號正常茭挑取冬孢子； 2)冬孢子懸液:將挑取的冬孢子堆置于5mL無菌水中，經(jīng)過濾，獲得較純的冬孢子懸液，再用無菌水將冬孢子懸液稀釋成終濃度為13個孢子/mL; 3)冬孢子培養(yǎng):取100yL冬孢子懸液涂布于擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)60 h，以肉眼可見細(xì)小分散的單菌落為標(biāo)準(zhǔn)； 4)單孢分離培養(yǎng):挑取單個肉眼可見的菌落至清水中，稀釋成13個孢子/mL，每次取IμL置于顯微操作儀下用毛細(xì)吸管吸取單個擔(dān)孢子，將分離出的擔(dān)孢子在YEPS固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)4 d； 5)顯微觀察:對擔(dān)孢子形成的菌落形態(tài)用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行顯微觀察，若菌落邊緣光滑則可初步鑒定為單倍體菌株，若邊緣產(chǎn)生了菌絲，則舍棄； 6)性親和菌株篩選:將初步鑒定的單倍體菌株編號，并用YEPS液體培養(yǎng)基分別稀釋成濃度為OD6qq為1.5-2.0的菌液，通過融合反應(yīng)實驗對性親和菌株進(jìn)行初步鑒定，培養(yǎng)后若可見白色氣生菌絲，則混合培養(yǎng)的兩個菌株可能為性親和單倍體菌株； 7)PCR鑒定:設(shè)計特異性引物用于進(jìn)一步對篩選得到的兩個性親和單倍體進(jìn)行PCR驗證，如性親和單倍體菌株能通過不同的特異性引物擴(kuò)增出長度在600 bp左右的片段，則確定為兩個性親和單倍體菌株，所述的特異性引物為引物pra1-F、引物pral-R、引物pra2_F、弓丨物pra2-R、引物pra3-F和引物pra3-R，所述的引物pral-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物pral-R的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，引物pra2_F的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，引物pra2-R的核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示，引物pra3_F的核苷酸序列如SEQ IDN0:5所示，引物pra3-R的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。2.如權(quán)利要求1所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟2)中采用4層滅菌紗布過濾。3.如權(quán)利要求1所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟3)中擔(dān)孢子分離培養(yǎng)基含有以下組分:Κ2ΗΡ04 0.85-1.15 g/1，MgSO4.7H20 0.45-0.55g/l, FeSO4.7H20 0.008-0.012g/l，KC1 0.45-0.55g/l，葡萄糖 16-20 g/1, (NH4)2SO4 5.0-5.5 g/1，瓊脂 10-15 g/1。4.如權(quán)利要求1所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟6)中融合反應(yīng)實驗具體過程為: a、選取一個單倍體菌株菌液先在YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行點樣，每個點IuL，總點樣數(shù)為分離得到的單倍體菌株數(shù)； b、將分離得到其它單倍體菌株的菌液各取IUL分別覆蓋于步驟a中的菌點上方，標(biāo)記菌株號，于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 do5.如權(quán)利要求1所述的一種快速穩(wěn)定分離鑒定菰黑粉菌性親和單倍體菌株的方法，其特征在于所述的步驟7)中PCR條件為:PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10XPCR緩沖液5 yL，dNTP 4 μL，上游引物I yL，下游引物I yL，DNA模板I yL，Taq酶0.5 yL，加ddH20至50 yL;PCR擴(kuò)增程序為94 0C 4 min；94 °C 30 s，55 °C 30 s，72 °C I min，30個循環(huán)；72 °C 10 min；4 °C終止。
【文檔編號】C12Q1/68GK105838782SQ201610058041
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年1月28日
【發(fā)明人】張雅芬, 葉子弘, 崔海峰, 俞曉平
【申請人】中國計量學(xué)院