專利名稱：將二倍體轉(zhuǎn)變成單倍體用于遺傳診斷的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明得到了美國政府基金的資助，即NIH撥款CA43460、CA57345、CA62924、CA67409、CA72851。因此，美國政府保留對本發(fā)明的某些權(quán)利。本申請要求1999年10月8日提交的臨時申請流水號60/158,160的收益，而且是1999年12月15提交的專利申請流水號09/461,047的部分繼續(xù)申請。
背景技術(shù)：
至少就遺傳診斷而言，人類和其它哺乳動物的問題在于它們是二倍體。一個等位基因中的突變(諸如負(fù)責(zé)所有顯性遺傳綜合癥的突變)總是伴隨著第二個等位基因的野生型序列。雖然在過去的十年里已經(jīng)開發(fā)了用于遺傳診斷的許多有力技術(shù)，但是它們都受到模板中存在的二倍性的限制。例如，與突變型條帶具有相同電泳遷移率的野生型條帶能夠使測序梯的解釋變得復(fù)雜，尤其是在突變型條帶的亮度較弱的時候。DNA區(qū)段的刪除甚至更成問題，因?yàn)樵谶@種情況中只有野生型等位基因通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)得到了擴(kuò)增和分析。這些問題呈現(xiàn)了診斷單基因疾病的困難，而對多基因疾病甚至更成問題，其中作為原因的突變可發(fā)生于幾種不同基因之任一種。這種多基因機(jī)制是常見易感性綜合癥的規(guī)則而非例外，諸如與乳腺癌和結(jié)腸癌、失明、以及血液學(xué)、神經(jīng)學(xué)、和心血管疾病有關(guān)的綜合癥。遺傳診斷這些疾病的靈敏度目前不是最佳的，其中30％-70％的情況難于遺傳分析。
本領(lǐng)域需要簡單的分離和分析來自人類和其它哺乳動物細(xì)胞的單個等位基因。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的是提供用于檢測人類或其它哺乳動物染色體上目的基因中的突變的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供用于使待測細(xì)胞適用于靈敏的遺傳測試的方法。
本發(fā)明的還有一個目的是提供可用于遺傳分析的融合雜交細(xì)胞群體。
下文所述一個或多個實(shí)施方案提供了本發(fā)明的這些和其它目的。在一個實(shí)施方案中，提供了用于檢測人類或其它哺乳動物目的基因中的突變的方法。使人類或其它哺乳動物的細(xì)胞融合嚙齒類細(xì)胞受者，以形成人類-嚙齒類或其它哺乳動物-嚙齒類雜交細(xì)胞。通過選擇嚙齒類染色體所含第一種標(biāo)記和第一人類或其它哺乳動物染色體所含第二種標(biāo)記來選擇融合后雜交細(xì)胞，以形成融合后雜交細(xì)胞群體。在融合后雜交細(xì)胞群體中檢測對于第二人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細(xì)胞亞群。該第二人類或其它哺乳動物染色體與第一人類或其它哺乳動物染色體是不同的而且沒有選擇。測試雜交細(xì)胞亞群以檢測基因、所述基因的mRNA產(chǎn)物、或所述基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。該基因位于第二種人類或其它哺乳動物染色體上。mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量減少或者基因、mRNA、或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的特性改變指示人類或其它哺乳動物的該基因中存在突變。
依照另一個實(shí)施方案，公開了為遺傳測試提供待測細(xì)胞的方法。待測細(xì)胞對于人類或其它哺乳動物基因而言是單倍體。使人類或其它哺乳動物的細(xì)胞融合經(jīng)轉(zhuǎn)化的二倍體嚙齒類細(xì)胞受者，以形成人類-嚙齒類或其它哺乳動物-嚙齒類雜交細(xì)胞。通過選擇第一人類或其它哺乳動物染色體和嚙齒類染色體各自的標(biāo)記來選擇融合后雜交細(xì)胞，以形成在沒有選擇人類或其它哺乳動物染色體的情況中穩(wěn)定維持一或多個人類或其它哺乳動物染色體的細(xì)胞群體。在細(xì)胞群體中檢測對于第二人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞，該第二人類或其它哺乳動物染色體不同于該第一人類或其它哺乳動物染色體，而且沒有選擇。
本發(fā)明還提供了嚙齒類-人類或嚙齒類-其它哺乳動物雜交細(xì)胞群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，在其中至少2個人類或其它哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
本發(fā)明由此通過提供對于一種或多種目的基因而言是單倍體的雜交細(xì)胞用于分析而為本領(lǐng)域提供了可用于提高多種診斷和分析方法的靈敏度和效力的方法。雜交細(xì)胞的人類或其它哺乳動物染色體成分是穩(wěn)定的且一致的。
圖的簡述


圖1用于生成雜交細(xì)胞的策略。使受者小鼠細(xì)胞系E2融合人類淋巴細(xì)胞，隨后用HAT+遺傳霉素(分別殺死未融合的E2細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)選擇克隆。所有克隆包含負(fù)責(zé)在HAT中生長的人類X染色體。測定克隆的基因型以確定保留了哪個人類染色體。標(biāo)有“A”和“B”的染色體表示代表性人類染色體的兩種同系物。圖中指出了所分析6種染色體同系物的二者皆未保留、二者都保留、或保留二者任一的克隆所占平均比例(見正文)。對保留待測基因的一個等位基因的克隆的核酸進(jìn)行突變分析。
圖2雜交細(xì)胞中的等位基因狀況和基因表達(dá)。(圖2A)所示染色體的多態(tài)標(biāo)記用于測定所示雜交細(xì)胞的基因型?！肮w”指用于融合小鼠受者細(xì)胞的人類淋巴細(xì)胞。(圖2B)E2和4種雜交細(xì)胞的cDNA作為模板用于擴(kuò)增hMSH2、hMSH6、hMLH1、hTGF、β-RII、hPMS1、hPMS2、和APC序列。結(jié)果符合圖2A中觀察到的基因型，即雜交細(xì)胞5-7保留了包含所測試基因的每種染色體的至少一個等位基因，而雜交細(xì)胞8包含染色體3、5、和7的等位基因，但不含染色體2(包含hMSH2、hPMS1、和hMSH6基因)的等位基因。
圖3難于進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)遺傳診斷的HNPCC患者的突變分析。對來自所示雜交細(xì)胞的核酸測試染色體2和3的保留情況(使用多態(tài)標(biāo)記)(圖3A)和分別位于染色體2和3上的hMSH2和hMLH1基因的表達(dá)(圖3B)。雜交細(xì)胞1、2、3、和6包含來自染色體2的等位基因A，但不表達(dá)hMSH2轉(zhuǎn)錄本；而雜交細(xì)胞4和5包含等位基因B，并表達(dá)hMSH2。hMLH1表達(dá)作為cDNA完整性的對照。(圖3C)由所示雜交細(xì)胞擴(kuò)增代表所示hMSH2外顯子的序列。在包含等位基因A的雜交細(xì)胞中不存在外顯子1-6，但是在包含任一等位基因的雜交細(xì)胞中存在外顯子7-16。
圖4Warthin家族G的突變分析。(圖4A)對來自雜交細(xì)胞1(包含Warthin家族G患者的突變型等位基因)的hMSH2轉(zhuǎn)錄本的RT-PCR產(chǎn)物的序列分析圖示了24bp插入(標(biāo)有下劃線；將反義引物用于測序)。在雜交細(xì)胞3(包含野生型等位基因)中發(fā)現(xiàn)了野生型序列。來自患者淋巴樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本的RT-PCR分析顯示，突變型轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平顯著低于野生型序列。(圖4B)相同雜交細(xì)胞基因組DNA的序列分析顯示，插入是由于位于外顯子4剪接受體位點(diǎn)處的A向C突變(反義序列，以粗體和下劃線指示)，導(dǎo)致使用上游24bp的隱藏剪接位點(diǎn)。突變體C的信號不如供體DNA中的野生型A強(qiáng)。這種不等價在來自二倍體細(xì)胞的測序模板中并非不尋常，而且能夠?qū)е陆忉寣游鰣D的困難。(圖4C)來自雜交細(xì)胞1和5(攜帶染色體2的突變型等位基因)的提取物不含hMSH2蛋白質(zhì)，而雜交細(xì)胞2和3(攜帶野生型等位基因)的提取物包含hMSH2蛋白質(zhì)。雜交細(xì)胞4不含染色體2的任一等位基因。雜交細(xì)胞1、3、4、和5都攜帶染色體3的至少一個等位基因，而且都合成hMLH1蛋白質(zhì)。α-微管蛋白作為蛋白質(zhì)上樣對照。顯示了使用針對所示蛋白質(zhì)的抗體的免疫印跡。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳述我們已經(jīng)設(shè)計了使用一種融合和選擇條件而生成包含任何期望人類或其它哺乳動物染色體的雜交細(xì)胞的策略。重要且意外的是，在這些雜交細(xì)胞中的人類或其它哺乳動物染色體是穩(wěn)定的，而且它們以足以用于詳細(xì)分析的水平表達(dá)人類或其它哺乳動物基因。該方法基于的原理是，人類或其它哺乳動物細(xì)胞與嚙齒類細(xì)胞之間的融合可產(chǎn)生雜交細(xì)胞，該雜交細(xì)胞包含全套嚙齒類基因組和部分人類或其它哺乳動物染色體。在過去，例如通過營養(yǎng)缺陷型嚙齒類細(xì)胞的互補(bǔ)對保留特定人類或其它哺乳動物染色體的選擇，使得能夠分離包含期望染色體的雜交細(xì)胞(7，8)。雖然已經(jīng)證明這種融合體可用于多種目的(8，9)，但是它們的效用受到是否有適用于許多染色體的嚙齒類受者可供利用以及融合和選擇條件的低效性和變化的限制。為了分析多基因疾病，必需為每種染色體分開進(jìn)行融合和選擇。
人類或其它哺乳動物染色體在本發(fā)明雜交細(xì)胞中的穩(wěn)定性是令人驚訝的。雖然輻射雜交細(xì)胞的人類遺傳結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，但是這種穩(wěn)定性推測是由于在照射供體細(xì)胞后小片段人類DNA整合到嚙齒類染色體中造成的。而人類染色體在全細(xì)胞融合中被認(rèn)為是不穩(wěn)定的，除非施加針對個別染色體的持續(xù)選擇壓力。在我們的實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的穩(wěn)定性的原因尚不清楚，但是可能與嚙齒類配偶體的二倍體本質(zhì)有關(guān)。這種二倍性反映了在經(jīng)轉(zhuǎn)化嚙齒類細(xì)胞中不常見的染色體穩(wěn)定性。以前的實(shí)驗(yàn)確實(shí)顯示了，染色體穩(wěn)定的人類細(xì)胞在與其它染色體穩(wěn)定的人類細(xì)胞融合后保留了所有染色體，這與兩個配偶體之一染色體不穩(wěn)定的情形不同。
本發(fā)明的二倍體嚙齒類受者細(xì)胞提供了可用于容易的生成具有功能性單倍體人類基因組的細(xì)胞的反應(yīng)物。來自這些雜交細(xì)胞的核酸或蛋白質(zhì)可作為反應(yīng)物用于任何標(biāo)準(zhǔn)突變測定法。由于突變測定法正在不斷的得到改進(jìn)并實(shí)現(xiàn)自動化(1)，因此雜交細(xì)胞所生成材料的價值相應(yīng)的得到提高。事實(shí)上，不久將有可能檢查整個基因的序列(除了外顯子以外，還包括啟動子和內(nèi)含子)。對于這種分析而言，由單個等位基因產(chǎn)生的核酸模板顯然是優(yōu)越的，因?yàn)槟０宓木槐举|(zhì)可極大增強(qiáng)事實(shí)上任何診斷測定法的信噪比。因此，我們設(shè)想，這種方法可以有效的用于廣泛的研究和臨床難題。
目的基因通常是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)涉及遺傳性疾病的基因，包括涉及結(jié)腸癌、乳腺癌、Li-Fraumeni病、囊性纖維化、2型神經(jīng)纖維瘤、vonHippel-Lindau病等的基因。經(jīng)鑒定基因包括APC、merlin、CF、VHL、hMSH2、p53、hPMS2、hMLH1、BRAC1等?？梢栽诘鞍踪|(zhì)水平鑒定的突變包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄或翻譯的序列中的突變、無義突變、剪接位點(diǎn)改變、易位、刪除、和插入，或者導(dǎo)致全長蛋白質(zhì)顯著減少的任何其它變化?？梢栽诤怂崴綑z測更細(xì)微的其它突變，諸如通過RT-PCR產(chǎn)物的測序進(jìn)行。
可用于融合的人類細(xì)胞是可以容易的融合嚙齒類細(xì)胞的任何細(xì)胞。易于由臨床樣本獲得的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)是好的融合配偶體，無論事先是否進(jìn)行促有絲分裂刺激，無論是新鮮的或于-80℃保存超過一年。既然遺傳突變是本發(fā)明的主題，那么可以使用人體的任何細(xì)胞，因?yàn)樗羞@些細(xì)胞都包含基本上相同的遺傳組成?？梢允褂玫钠渌溉閯游锛?xì)胞包括(特別是)貓、狗、牛、綿羊、山羊、馬、黑猩猩、狒狒、和豬的細(xì)胞。更一般的說，其它哺乳動物細(xì)胞可選自反芻類、靈長類、食肉類、復(fù)齒類(lagomorpha)、和奇蹄類。通常，其它哺乳動物細(xì)胞融合配偶體不是嚙齒類細(xì)胞。
用于融合的嚙齒類細(xì)胞受者優(yōu)選二倍體，更優(yōu)選經(jīng)癌基因轉(zhuǎn)化，甚至更優(yōu)選因錯配修復(fù)基因缺陷而具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性。旺盛生長、穩(wěn)定的二倍體、且高效融合的特定克隆的選擇完全屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。例如，嚙齒類細(xì)胞可以來自小鼠、大鼠、豚鼠、或倉鼠。
可以依照本領(lǐng)域任何已知方法來實(shí)現(xiàn)依照本發(fā)明的細(xì)胞融合。用于誘導(dǎo)融合的已知技術(shù)包括聚乙二醇介導(dǎo)的融合、仙臺病毒介導(dǎo)的融合、和電融合。可以以10∶1與1∶10之間的比率混合人類與嚙齒類的細(xì)胞。融合細(xì)胞的克隆通常在生長大約2-3周后變得明顯。
可以使用導(dǎo)致正選擇表型的任何標(biāo)記來選擇融合后雜交細(xì)胞，包括抗生素抗性基因、有毒代謝物抗性基因、原養(yǎng)型標(biāo)記等。本發(fā)明令人驚訝的優(yōu)點(diǎn)是，選擇中可以使用位于一條人類或其它哺乳動物染色體上的一個標(biāo)記，而且獲得不僅僅包含該所選擇的人類或其它哺乳動物染色體的穩(wěn)定雜交細(xì)胞。因而，甚至在沒有對標(biāo)記所處染色體進(jìn)行選擇時，也可以分析位于其它染色體上的標(biāo)記。
可以分析融合后雜交細(xì)胞以確定它們確實(shí)攜帶包含目的基因的人類或其它哺乳動物(非嚙齒類)染色體。可以將具有兩條相關(guān)人類或其它哺乳動物染色體之任一的雜交細(xì)胞在相互之間區(qū)分開，并且與包含兩條人類或其它哺乳動物染色體二者的雜交細(xì)胞區(qū)分開來(見
圖1)。雖然可以使用本領(lǐng)域用于鑒定人類或其它哺乳動物染色體的任何已知方法，但是可以通過評估位于人類或其它哺乳動物染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記而進(jìn)行容易的分析。連鎖的其它多態(tài)性標(biāo)記可用于鑒定雜交細(xì)胞中的期望人類或其它哺乳動物染色體。
一旦由測試的人類或其它哺乳動物分離得到包含一個拷貝的人類或其它哺乳動物目的基因的雜交細(xì)胞，就可以在雜交細(xì)胞上進(jìn)行突變分析?？梢灾苯訉驕y試突變，或者可以測試基因的mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物。使用合適抗體的Western印跡應(yīng)當(dāng)能夠檢測到導(dǎo)致全長基因產(chǎn)物表達(dá)減少的突變。還可以進(jìn)行依賴目的基因所編碼蛋白質(zhì)功能的測試法和酶測定法來檢測突變。還可以采用本領(lǐng)域已知的其它免疫學(xué)技術(shù)。
若使用免疫學(xué)方法來檢測雜交細(xì)胞中目的基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，則希望所用抗體與嚙齒類蛋白質(zhì)不發(fā)生交叉反應(yīng)?；蛘?，可以通過突變而滅活與目的基因同源的嚙齒類基因，從而簡化蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分析?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的靶向誘變方法來實(shí)現(xiàn)這種突變。
功能測試也可以用于評估每種等位基因產(chǎn)物的常態(tài)。例如，若將在p53轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)下游包含β-半乳糖苷酶基因的表達(dá)構(gòu)建物插入包含人類染色體17而不含內(nèi)源p53的嚙齒類-人類雜交細(xì)胞，則可以通過使用X-gal染色克隆來檢測人類染色體17上的p53突變?？梢栽O(shè)計特別為目的基因定制的其它酶促或功能測定法。
可以采用在DNA或RNA水平檢測突變的任何本領(lǐng)域已知方法，包括而不限于測序、等位基因特異性PCR、等位基因特異性雜交、微陣列、DGGE、和自動化測序。
有可能的是，目的基因在雜交細(xì)胞環(huán)境中的表達(dá)可能受到抑制。為了將目的基因在雜交細(xì)胞中的表達(dá)損失有意義的解釋為指示人類或其它哺乳動物中的突變，必須確認(rèn)目的基因(在野生型時)在嚙齒類-人類或其它哺乳動物雜交細(xì)胞中表達(dá)。不需要為每位患者進(jìn)行這種確認(rèn)，而是可以在建立測定法時進(jìn)行。
當(dāng)本發(fā)明的測定法指示目的基因中存在突變時，可以測試其他家族成員以確定他們是否也攜帶突變?；蛘撸梢詼y試其他家族成員以了解他們是否攜帶與受影響家族成員相同的染色體。這可以通過測試單倍型來測定，即在受影響家族成員中攜帶突變的染色體上找到的一套不同標(biāo)記。單倍型的測定是對第一個家族成員進(jìn)行本發(fā)明測定法的副產(chǎn)物。當(dāng)例如通過使用微衛(wèi)星標(biāo)記來測試雜交細(xì)胞以確認(rèn)雜交細(xì)胞中相關(guān)染色體的存在時，將可鑒定一套不同的標(biāo)記，然后作為單倍型使用。
通過本發(fā)明融合方法生成的雜交細(xì)胞混合群體可能包含對于許多不同人類或其它哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細(xì)胞。通常，在單倍體狀態(tài)的群體中，在100個、75個、50個、30個、或28個細(xì)胞中至少有1個，將存在至少2條、至少5條、至少10條、至少15條、至少20條、甚至22條人類或其它哺乳動物常染色體的每種同系物。因而，高比例的細(xì)胞包含多條人類或其它哺乳動物染色體，而且必需測試較少數(shù)目的細(xì)胞以找到包含單拷貝未選擇染色體的細(xì)胞。
由于人類或其它哺乳動物染色體在本發(fā)明雜交細(xì)胞中的高穩(wěn)定性，因此由一個雜交細(xì)胞生成的細(xì)胞群體是一致的且均一的。因而，在由一個雜交細(xì)胞生成的群體中至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、或100％的細(xì)胞包含同一套人類或其它哺乳動物染色體。
下列實(shí)施例提供的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)例證了進(jìn)行本發(fā)明的許多方法之一。本發(fā)明不限于實(shí)施例中所采用細(xì)胞的具體方法。權(quán)利要求書和說明書作為一個整體提供了本發(fā)明的量度。
實(shí)施例所有雜交細(xì)胞都包含人類X染色體，因?yàn)樵撊旧w包含使之能夠在HAT中生長的HPRT基因。為了測定雜交細(xì)胞中是否存在其它人類染色體，將多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記(12)作為探針用于基于PCR的測定法(圖2A)。我們關(guān)注已知包含結(jié)腸直腸癌(CRC)易感基因的染色體臂(2p、2q、3p、5q、7q、和16q)。在顯著比例的雜交克隆中存在這些染色體臂每一種的一個拷貝。例如，在由14個個體衍生并檢查染色體3的476個雜交細(xì)胞中，136個雜交細(xì)胞不包含任一條供體染色體，211個雜交細(xì)胞包含兩條供體染色體，60個雜交細(xì)胞包含一條親本染色體，69個雜交細(xì)胞包含另一條親本染色體。對所分析的6種染色體臂都發(fā)現(xiàn)相似保留頻率。對來自一條染色體兩臂的標(biāo)記的測試顯示，雜交細(xì)胞保留了整條染色體而非染色體片段。對雜交細(xì)胞中期染色體涂片進(jìn)行的熒光原位雜交(FISH)確認(rèn)了這個結(jié)果，指出在每個雜交細(xì)胞中存在11±3條人類染色體?；诨蛐蛿?shù)據(jù)的計算指出，就研究中的一條染色體而言，對25個雜交細(xì)胞的分析將確保有95％的概率可鑒定到至少1個包含母本等位基因的雜交細(xì)胞和至少1個包含父本等位基因的雜交細(xì)胞。此外，它將只需要45個雜交細(xì)胞來相似確保在至少一個雜交細(xì)胞中存在所有22種常染色體的每一種等位基因且與其同系物分開(13)。
上文所述結(jié)果證明，在融合小鼠細(xì)胞后可以容易的分離人類染色體的個別等位基因。
HNPCC為轉(zhuǎn)變方法的力量提供了令人信服的實(shí)證，因?yàn)樗且呀?jīng)廣泛研究的常見遺傳性疾病。在最近3年里，例如已經(jīng)對來自遍布全世界的9個組中的303個HNPCC同類進(jìn)行了主要MMR基因的廣泛研究(25-34)。根據(jù)在他們的癌中具有特征性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的這些患者的比例(30-34)，可以估計，239個(78％)同類在錯配修復(fù)基因中具有生殖系突變。然而，只在這239個同類的127個(42％)中鑒定到MMR基因突變(25-34)。我們的組是相似的，即來源于總共25個同類，其中22個患有腫瘤，而且具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和假定的MMR基因突變。在這22個中，我們的最初分析揭示只在12個(54％)中存在突變(參考14和未發(fā)表數(shù)據(jù))。只有在轉(zhuǎn)變分析之后揭示了其他10名患者的突變，由此將靈敏度由54％提高到100％。事實(shí)上與MSI有關(guān)的HNPCC的所有案例都?xì)w咎于已知MMR基因的生殖系突變，這一結(jié)論與最近證明在絕大多數(shù)HNPCC患者的癌中不存在MSH2或MLH1蛋白質(zhì)染色的免疫組織化學(xué)數(shù)據(jù)是一致的(40、41)。這些結(jié)果的推論是，對新的人類MMR基因的搜索不應(yīng)當(dāng)基于大部分HNPCC案例將證明可歸咎于這些未知基因的前提。
上文所述系統(tǒng)可以以直接了當(dāng)?shù)姆绞接糜谄渌z傳性疾病。應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，這種方法并非目前用于搜索特定突變的許多有力方法的替代。更正確的說，轉(zhuǎn)變可用于將現(xiàn)有技術(shù)的靈敏度最大化。由于轉(zhuǎn)變核酸可得到較高信噪比而且野生型等位基因不能夠掩飾或混淆突變型等位基因的檢測，因而轉(zhuǎn)變核酸為這些方法提供了優(yōu)選底物。由于基于DNA的突變測定法在未來將獲得改進(jìn)，而且日益增多的摻入微陣和其它自動化特征(42-44)，因此轉(zhuǎn)變生成核酸的價值將相應(yīng)提高，顯著增強(qiáng)遺傳性疾病的遺傳測試法的效力。方法細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胚性成纖維細(xì)胞衍生自MSH2缺陷型小鼠(46)并經(jīng)腺病毒E1A和RAS癌基因轉(zhuǎn)化。通過在10μM 2-氨基6-巰基嘌呤中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞來選擇HPRT缺陷型亞克隆。在添加10％FCS和10μM 2-氨基6-巰基嘌呤的Dulbecco氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中維持克隆。細(xì)胞融合和雜交細(xì)胞的生成患者來自由阿姆斯特丹標(biāo)準(zhǔn)定義的患HNPCC同類(44)；由于缺乏足夠數(shù)目的患病個體，因而沒有一個案例可以進(jìn)行連鎖分析。通過參考文獻(xiàn)45推薦的標(biāo)記，測定了來自這些患者的癌中的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)。將3×106個E2細(xì)胞與12×106個淋巴細(xì)胞混合，清洗，在融合培養(yǎng)基(0.25M D-山梨醇、0.1mM醋酸鈣、0.5mM醋酸鎂、0.1％牛血清清蛋白(BSA)，pH7)中離心兩次，并重懸于640μl融合培養(yǎng)基。將溶液轉(zhuǎn)移到電擊杯(BTX電擊杯470；BTX，San Diego)中。使用BTXECM200型ElectroCell操作儀融合細(xì)胞。生成最大數(shù)目雜交細(xì)胞的設(shè)置是30V(AC)、22sec，隨后3次300V(DC)、每次15μsec脈沖。將來自一個融合的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有添加10％ FCS的DMEM的3個48孔板(Costar)中。24小時后，用添加10％ FCS、0.5mg/ml遺傳霉素、和1x HAT(Life Technologies，Gaithersburg，MD)的DMEM更換培養(yǎng)基。一周后更換培養(yǎng)基。融合兩周后雜交克隆變得明顯，并在測定基因型前再擴(kuò)增一周。由一個融合獲得平均23±15個雜交克隆。用于本文所述實(shí)驗(yàn)的淋巴細(xì)胞衍生自外周血淋巴細(xì)胞的Epstein-Barr病毒感染，但是發(fā)現(xiàn)新鮮采集的淋巴細(xì)胞也能夠成功的使用相同方法進(jìn)行融合和分析。基因型測定如參考文獻(xiàn)12所述進(jìn)行基因型測定。在6％變性凝膠上分離PCR產(chǎn)物并通過放射自顯影可視化。所用微衛(wèi)星標(biāo)記是分別來自染色體2p、2q、3p、5q、7q、和16q的D2S1788和D2S1360、D2S1384、D3S2406、D7S1824、和D16S3095。如先前所述進(jìn)行熒光原位雜交(21)。PCR和測序如先前所述純化聚腺苷酸化RNA并進(jìn)行RT-PCR。使用ABI Big Dye終止物和ABI 377型自動化測序儀進(jìn)行測序。用于擴(kuò)增和測序的所有引物將可以通過互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)獲得。統(tǒng)計分析所測試每種染色體的等位基因二者皆無、二者都包含、或僅包含二者之一的雜交細(xì)胞的數(shù)目符合多維正態(tài)分布。蒙特卡洛模擬用于估計生成包含特定數(shù)目每種染色體的單等位基因雜交細(xì)胞所需要的雜交細(xì)胞數(shù)目。
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10.E2細(xì)胞衍生自由MSH2缺陷型小鼠(由T.Mak慷慨提供)衍生的小鼠胚性成纖維細(xì)胞并經(jīng)腺病毒E1A和RAS癌基因轉(zhuǎn)化。通過在10μM2-氨基6-巰基嘌呤中培養(yǎng)成纖維細(xì)胞來選擇HPRT缺陷型亞克隆。在添加10％FCS和10μM 2-氨基6-巰基嘌呤的Dulbecco氏修改Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中維持克隆。
11.將3×106個淋巴細(xì)胞混合，清洗，在融合培養(yǎng)基(0.25M D-山梨醇、0.1mM醋酸鈣、0.5mM醋酸鎂、0.1％牛血清清蛋白(BSA)，pH7)中離心兩次，并重懸于640μl融合培養(yǎng)基。將溶液轉(zhuǎn)移到電擊杯(BTX電擊杯470；BTX，San Diego)中。使用BTX ECM200型ElectroCell操作儀融合細(xì)胞。生成最大數(shù)目雜交細(xì)胞的設(shè)置是30V(AC)、22sec，隨后3次300V(DC)、15μsec脈沖。將來自一次融合的細(xì)胞鋪到裝有添加10％FCS的DMEM的3個48孔板(Costar)中。24小時后，用添加10％ FCS、0.5mg/ml遺傳霉素、和1x HAT(Life Technologies，Gaithersberg，MD)的DMEM更換培養(yǎng)基。一周后更換培養(yǎng)基。融合兩周后雜交克隆變得明顯，并在測定基因型前再擴(kuò)增一周。用于本文所述實(shí)驗(yàn)的淋巴細(xì)胞衍生自外周血淋巴細(xì)胞的Epstein-Barr病毒感染，但是我們發(fā)現(xiàn)新鮮采集的淋巴細(xì)胞也能夠成功的使用相同方法進(jìn)行融合和分析。
12.如F.S.Leach等人，Cell，751215，1993中所述進(jìn)行基因型測定。在6％變性凝膠上分離PCR產(chǎn)物并通過放射自顯影可視化。所用微衛(wèi)星標(biāo)記是分別來自染色體2p、2q、3p、5q和16q的D2S1788和D2S13360、D3S2406、D7S1824、和D16S3095。
13.所測試每種染色體的二者皆未包含、二者都包含、或僅包含二者之一的雜交細(xì)胞的數(shù)目符合多維正態(tài)分布。蒙特卡洛模擬用于估計生成包含特定數(shù)目每種染色體的單等位基因雜交細(xì)胞所需要的雜交細(xì)胞數(shù)目。
14.如B.Liu等人，Nat Medicine，2169，1996中所述純化聚腺苷酸化RNA并進(jìn)行RT-PCR。
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18.使用ABI Big Dye終止物和ABI 377型自動化測序儀進(jìn)行測序。用于擴(kuò)增和測序的所有引物將可以通過Science互聯(lián)網(wǎng)站點(diǎn)獲得。
19.將雜交細(xì)胞的胞質(zhì)提取物通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，并用針對人類hMSH2(#NA26，Calboiochem)、人類hMLH1(#13271A，Pharmingen)、或β-微管蛋白(#N357，Amersham)的特異性抗體進(jìn)行免疫印跡。
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權(quán)利要求
1.用于檢測非嚙齒類哺乳動物目的基因中的突變的方法，包括下列步驟融合非嚙齒類哺乳動物細(xì)胞與嚙齒類細(xì)胞受者，以形成非嚙齒類哺乳動物-嚙齒類雜交細(xì)胞；通過選擇嚙齒類染色體所含第一標(biāo)記和第一非嚙齒類哺乳動物染色體所含第二標(biāo)記來選擇融合后雜交細(xì)胞，以形成融合后雜交細(xì)胞群體；在融合后雜交細(xì)胞群體中檢測對于第二非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細(xì)胞亞群，所述第二非嚙齒類哺乳動物染色體與第一非嚙齒類哺乳動物染色體不是相同染色體，而且沒有經(jīng)過選擇；分析雜交細(xì)胞亞群以檢測所述基因或其mRNA產(chǎn)物中的突變，其中該基因位于第二非嚙齒類哺乳動物染色體上。
2.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞是二倍體。
3.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者是錯配修復(fù)缺陷的。
4.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者是遺傳霉素抗性的。
5.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者經(jīng)癌基因轉(zhuǎn)化。
6.權(quán)利要求5的方法，其中癌基因是ras。
7.權(quán)利要求5的方法，其中癌基因是E1A。
8.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者經(jīng)ras和E1A癌基因轉(zhuǎn)化。
9.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者是MSH2。
10.權(quán)利要求1的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者是二倍體而且包含可選擇標(biāo)記和反選擇標(biāo)記。
11.權(quán)利要求10的方法，其中反選擇標(biāo)記是HPRT缺陷。
12.權(quán)利要求1的方法，其中還包括步驟在融合后雜交細(xì)胞群體中檢測第三非嚙齒類哺乳動物染色體，其中第一、第二、和第三非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的，而且第二和第三非嚙齒類哺乳動物都沒有經(jīng)過選擇。
13.權(quán)利要求1的方法，還包括步驟在融合后雜交細(xì)胞群體中檢測第三和第四非嚙齒類哺乳動物染色體，其中第一至第四非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的，而且第二至第四非嚙齒類哺乳動物染色體都沒有經(jīng)過選擇。
14.權(quán)利要求12的方法，其中還包括步驟測試所述雜交細(xì)胞亞群以檢測第二基因的mRNA產(chǎn)物或所述第二基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中第二基因位于第三非嚙齒類哺乳動物染色體上，其中來自所述第二基因的所述mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量降低或所述mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的特性改變指示該非嚙齒類哺乳動物的第二基因中存在突變。
15.權(quán)利要求13的方法，其中還包括步驟測試所述雜交細(xì)胞亞群以檢測第二和第三基因的mRNA產(chǎn)物或所述第二和第三基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中第二和第三基因位于第三和第四非嚙齒類哺乳動物染色體上，其中所述第三或第四基因的所述mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的量降低或者所述mRNA或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的特性改變指示該非嚙齒類哺乳動物的第三或第四基因中存在突變。
16.權(quán)利要求1的方法，其中非嚙齒類哺乳動物細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
17.權(quán)利要求1的方法，其中檢測對于第二非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的雜交細(xì)胞亞群的步驟是通過鑒定第二非嚙齒類哺乳動物染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記而實(shí)現(xiàn)的。
18.權(quán)利要求1的方法，其中分析以檢測突變的步驟是通過選自下組的技術(shù)而進(jìn)行的核酸測序、等位基因特異性PCR、等位基因特異性雜交、微陣列雜交、不連續(xù)梯度凝膠電泳(DGGE)、和自動化核酸測序。
19.用于為遺傳測試提供待測細(xì)胞的方法，其中所述待測細(xì)胞對于非嚙齒類哺乳動物基因而言是單倍體，該方法包括下列步驟使非嚙齒類哺乳動物的細(xì)胞融合經(jīng)轉(zhuǎn)化的二倍體嚙齒類細(xì)胞受者，以形成非嚙齒類哺乳動物-嚙齒類雜交細(xì)胞；通過選擇第一非嚙齒類哺乳動物染色體和嚙齒類染色體各自的標(biāo)記來選擇融合后雜交細(xì)胞，以形成在沒有選擇非嚙齒類哺乳動物染色體的情況下穩(wěn)定維持一或多個非嚙齒類哺乳動物染色體的細(xì)胞群體；在細(xì)胞群體中檢測對于第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞，所述第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體與第一非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的，而且沒有經(jīng)過選擇。
20.權(quán)利要求19的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者是遺傳霉素抗性的。
21.權(quán)利要求19的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者經(jīng)癌基因轉(zhuǎn)化。
22.權(quán)利要求21的方法，其中癌基因是ras。
23.權(quán)利要求21的方法，其中癌基因是E1A。
24.權(quán)利要求19的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者經(jīng)ras和E1A癌基因轉(zhuǎn)化。
25.權(quán)利要求19的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者是錯配修復(fù)缺陷的。
26.權(quán)利要求19的方法，其中嚙齒類細(xì)胞受者包含反選擇標(biāo)記。
27.權(quán)利要求26的方法，其中反選擇標(biāo)記是HPRT缺陷。
28.權(quán)利要求19的方法，其中非嚙齒類哺乳動物細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。
29.權(quán)利要求19的方法，其中檢測對于所述第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞的步驟是通過鑒定所述第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體上的微衛(wèi)星標(biāo)記而實(shí)現(xiàn)的。
30.權(quán)利要求19的方法，還包括步驟在細(xì)胞群體中檢測對于第四非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞，其中所述第四非嚙齒類哺乳動物染色體與第一、第二、和第三非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的而且沒有經(jīng)過選擇。
31.權(quán)利要求19的方法，還包括步驟在細(xì)胞群體中檢測對于第四、第五、和第六非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞，其中所述第四至第六非嚙齒類哺乳動物染色體與第一、第二、和第三非嚙齒類哺乳動物染色體是不同的而且沒有經(jīng)過選擇。
32.權(quán)利要求19的方法，還包括步驟對對于第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞的核酸測試第三非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
33.權(quán)利要求19的方法，還包括步驟對對于第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體而言是單倍體的細(xì)胞測試該第二和第三非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
34.權(quán)利要求1的方法，其中對雜交細(xì)胞亞群中細(xì)胞的mRNA測試第二非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
35.權(quán)利要求1的方法，其中對雜交細(xì)胞亞群中細(xì)胞的蛋白質(zhì)測試第二非嚙齒類哺乳動物染色體上的基因中的突變。
36.嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細(xì)胞群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少2種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
37.權(quán)利要求36的群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少5種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
38.權(quán)利要求36的群體，其中，在50個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少5種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
39.權(quán)利要求36的群體，其中，在30個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少5種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
40.權(quán)利要求36的群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少10種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
41.權(quán)利要求36的群體，其中，在50個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少10種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
42.權(quán)利要求36的群體，其中，在30個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少10種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
43.權(quán)利要求36的群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少15種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
44.權(quán)利要求36的群體，其中，在50個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少15種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
45.權(quán)利要求36的群體，其中，在30個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少15種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
46.權(quán)利要求36的群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少20種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
47.權(quán)利要求36的群體，其中，在50個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少20種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
48.權(quán)利要求36的群體，其中，在30個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少20種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
49.權(quán)利要求36的群體，其中，在100個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少22種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
50.權(quán)利要求36的群體，其中，在50個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少22種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
51.權(quán)利要求36的群體，其中，在30個細(xì)胞中至少有1個細(xì)胞，其中至少22種非嚙齒類哺乳動物常染色體的每種同系物以單倍體形式存在。
52.嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細(xì)胞群體，其穩(wěn)定維持它們的非嚙齒類哺乳動物染色體成分，使得至少95％的雜交細(xì)胞包含相同的非嚙齒類哺乳動物染色體。
53.權(quán)利要求52的嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細(xì)胞群體，其中至少97％的雜交細(xì)胞包含相同的非嚙齒類哺乳動物染色體。
54.權(quán)利要求52的嚙齒類-非嚙齒類哺乳動物雜交細(xì)胞群體，其中至少99％的雜交細(xì)胞包含相同的非嚙齒類哺乳動物染色體。
55.權(quán)利要求1的方法，其中非嚙齒類哺乳動物是人類。
56.權(quán)利要求1的方法，其中非嚙齒類哺乳動物選自山羊、綿羊、馬、牛、豬、肥豬、貓、和狗。
全文摘要
與遺傳性疾病有關(guān)的突變的檢測因哺乳動物細(xì)胞的二倍性而變得復(fù)雜。在一個等位基因中存在的突變常常受到另一等位基因的野生型序列的掩飾。在由通過一個融合產(chǎn)生的雜交體細(xì)胞中,每一染色體的各等位基因可分離開。可以以明確的方式對來自雜交細(xì)胞的核酸分析突變。將這種方法用于檢測先前難于遺傳診斷的兩種引起癌癥的突變。研究的家族之一(Warthin家族G)是具有生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中描述的遺傳性結(jié)腸癌綜合癥的第一個家族。
文檔編號C12Q1/68GK1384887SQ00814879
公開日2002年12月11日 申請日期2000年10月6日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月8日
發(fā)明者B·沃戈爾斯滕, K·W·金澤勒, H·炎, N·派帕多普勒斯 申請人:約翰斯霍普金斯大學(xué)