一種母本起源的煙草單倍體及其育種方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種母本起源的煙草單倍體及其育種方法，包括以下步驟：1）以Coker176與Coker371 Gold雜交所得的雜交種F1作為母本；2）當(dāng)雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.0~2.5cm時，以非洲煙N. africana為父本進(jìn)行雜交，授粉后用紙管套住已授粉柱頭，待種子成熟后，收獲成熟的雜交種種子，進(jìn)行脫粒、精選，并播種；3）當(dāng)步驟2中播種的煙苗兩片真葉時，采集表型判斷為單倍體的植株葉片，利用流式細(xì)胞術(shù)分析其倍性，得到母本起源的單倍體。本發(fā)明的方法操作簡單、易于實(shí)現(xiàn)，單倍體誘導(dǎo)效果好，誘導(dǎo)效率高，鑒定快速準(zhǔn)確，對于煙草單倍體育種具有重要的作用。
【專利說明】
一種母本起源的煙草單倍體及其育種方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于煙草育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種母本起源的煙草單倍體及其育種方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草單倍體是含有煙草配子體染色體數(shù)目（n=24)的植株。單倍體育種可以縮短育 種年限。通過單倍體的染色體加倍可獲得純合二倍體，只要獲得的二倍體植株符合育種目 標(biāo)即可繁殖推廣，這樣從雜交到純合品系的整個過程只需3~4年，所花的時間比常規(guī)育種獲 得穩(wěn)定株系所需的時間要短。但是在自然界中出現(xiàn)單倍體植株的頻率低，且多數(shù)植株不能 成活，因此在育種中很難直接利用。誘導(dǎo)來源于父本的單倍體的常用方法為花藥培養(yǎng)，具有 步驟簡便，單倍體苗易獲得等優(yōu)點(diǎn)，但是花藥培養(yǎng)方式獲得的加倍單倍體，其品質(zhì)及農(nóng)藝性 狀等退化嚴(yán)重，同時利用父本來源的單倍體育成的煙草品種還存在產(chǎn)量降低等劣勢。
[0003] 目前母本起源單倍體育種技術(shù)已在實(shí)踐中得到了應(yīng)用，但是目前存在苗期單倍體 鑒別困難的問題，也沒有不同授粉時期和不同的套袋方式對母本起源單倍體誘導(dǎo)效果影響 的相關(guān)研究，大大阻礙了現(xiàn)有母本起源單倍體育種的發(fā)展。
[0004] 流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)是一種用于生物醫(yī)學(xué)中對血細(xì)胞進(jìn)行快速計數(shù)與 分析的技術(shù)，其利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動中的單個細(xì)胞或微小顆粒(細(xì)胞核、染色體 等)進(jìn)行快速定量分析和分選。因具有檢測方便、快速、用量少的特點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)用于動 物、微生物及細(xì)胞生物學(xué)方面的特定細(xì)胞分選研究。但現(xiàn)如今流式細(xì)胞儀在植物科學(xué)中的 應(yīng)用滯后于其它學(xué)科。因此，如果能夠用其在煙草母本起源單倍體方面進(jìn)行早期快速準(zhǔn)確 篩選，對加快煙草育種進(jìn)程具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種母本起源的煙草單倍體;本發(fā)明的第二目的在于 提供一種母本起源的煙草單倍體的育種方法。
[0006] 本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述煙草單倍體是以Cokerl76與Coker371 Gold雜交所得的雜交種F1作為母本，以非洲煙TV. a/rica/3a為父本，進(jìn)行雜交篩選所得。
[0007] 本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的母本起源煙草單倍體的育種方法包括以 下步驟： 1) 以0〇1^1'176與&31^13716〇1(1雜交所得的雜交種？1作為母本； 2) 當(dāng)雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.0~2.5cm時，以非洲煙見a/riCa/3a為父 本進(jìn)行雜交，授粉后用紙管套住已授粉柱頭，并將紙管的頂端折疊，封住柱頭，待種子成熟 后，收獲成熟的雜交種種子，進(jìn)行脫粒、精選，并播種； 3) 當(dāng)步驟2中播種的煙苗兩片真葉時，采集表型判斷為單倍體的植株葉片，利用流式細(xì) 胞術(shù)分析其倍性，得到母本起源的單倍體。
[0008] 本發(fā)明的有益效果： 1、 該方法操作簡單、易于實(shí)現(xiàn)，單倍體誘導(dǎo)效果好，誘導(dǎo)效率高，鑒定快速準(zhǔn)確，對于煙 草單倍體育種具有重要的作用； 2、 本發(fā)明的母本起源單倍體育種技術(shù)育種周期明顯縮短、目標(biāo)性狀選擇效率顯著提 高，可在苗期建立混倍體與單倍體標(biāo)準(zhǔn)倍性圖，在苗床上淘汰非單倍體植株，無需移栽所有 存活苗，節(jié)省時間與后續(xù)鑒定步驟； 3、 本發(fā)明通過對不同授粉時期和不同的套袋方式對母本起源單倍體誘導(dǎo)效果影響的 進(jìn)行研究，確定了最佳的授粉時期和套袋方式，在苗期鑒定單倍體植株，本發(fā)明的流式細(xì)胞 術(shù)通過結(jié)合已知不同倍性煙草材料，通過苗期表型指標(biāo)、成熟期發(fā)育情況觀測等，確定的分 析步驟對單倍體、二倍體和混倍體等不同倍性材料以及母本起源單倍體后代材料的分析結(jié) 果穩(wěn)定可靠，操作簡單，鑒別準(zhǔn)確性、效率均顯著提高。
【附圖說明】
[0009]圖1為流式細(xì)胞儀對實(shí)施例1的樣品倍性分析結(jié)果； 其中，圖1-A為已知單倍體的倍性分析結(jié)果，圖1-B為已知二倍體的倍性分析結(jié)果，圖ι? 為已知混倍體的倍性分析結(jié)果； 圖2為實(shí)施例3中不同SCD長度時花粉管萌發(fā)情況； 其中，圖2-Α為S⑶長度為2.5cm時的花粉管萌發(fā)情況，圖2-Β為S⑶長度為3.0cm時的花 粉管萌發(fā)情況。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] 本發(fā)明的煙草單倍體是以Cokerl76與Coker371 Gold雜交所得的雜交種F1作為母 本，以非洲煙I a/ricam為父本，進(jìn)行雜交篩選所得。
[0012] 本發(fā)明的母本起源煙草單倍體的育種方法，包括以下步驟： 1) 以0〇1^1'176與&31^13716〇1(1雜交所得的雜交種？1作為母本； 2) 當(dāng)雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.0~2.5〇111時，以非洲煙聽^〇^3/^ a/rica/^為父本進(jìn)行雜交，授粉后用紙管套住已授粉柱頭，并將紙管的頂端折疊，封住柱 頭，待種子成熟后，收獲成熟的雜交種種子，進(jìn)行脫粒、精選，并播種； 3) 當(dāng)步驟2中播種的煙苗兩片真葉時，采集表型判斷為單倍體的植株葉片，利用流式細(xì) 胞術(shù)分析其倍性，得到母本起源的單倍體。
[0013] 步驟2中所述的雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.5cm。
[0014] 步驟2中所述的雜交具體為用鑷子剝開母本花瓣，從0.5cm處用解剖刀切斷雄蕊花 絲，將父本花粉涂于母本柱頭。
[0015] 步驟2中所述的紙管為兩端開口，直徑為0.45~0.5cm，長為4.5~5.0cm的紙管。
[0016] 步驟3中所述的表型判斷為單倍體的植株葉片具體為觀察兩片真葉的表面有粒狀 或起皺、葉緣無波浪狀的煙苗判斷為單倍體苗。
[0017] 步驟3中所述的利用流式細(xì)胞術(shù)分析的具體步驟為:取1.5 X 1.5cm2大小嫩葉，用 去離子水洗凈葉片表面，濾紙吸干表面水分后放入培養(yǎng)皿里，加入lml預(yù)冷到4°C的解離液， 所述解離液為Galbraith' s Buffer，用刀片快速切碎葉片，碎片大小約為0.5mm，整個切碎 過程，材料需保持浸沒在解離液里，最后再用0.5ml解離液清洗刀片，將培養(yǎng)皿擺成斜面，使 液體和切碎的材料流至培養(yǎng)皿底半弧側(cè)，用修飾過的移液槍頭輕輕混勻培養(yǎng)皿斜壁上粘連 液體;吸取培養(yǎng)皿中的液體，濾過300目濾膜，用1.5ml離心管收集濾液，置于冰中孵育5分鐘 后離心，轉(zhuǎn)速為11 OOrpm，溫度4°C，時間5min;吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴 解離液，再加入1微升母液濃度為2mg/ml的RNase，吹打混勻，避光冰浴染色20min作為樣 品，在流式細(xì)胞儀上采用FL2-A通道使用低速上樣檢測樣品染色體的倍性。
[0018] 所述的流式細(xì)胞儀為BD Accuri_C6 Flow Cytometer。
[0019] 實(shí)施例1 分別取已知單倍體、已知二倍體、已知混倍體播種35d后的植株的1.5 X 1.5cm2大小嫩 葉，用去離子水洗凈葉片表面，濾紙吸干表面水分后放入培養(yǎng)皿里，加入lml預(yù)冷到4°C的解 離液，所述解離液為Galbraith' s Buffer，用刀片快速切碎葉片，碎片大小約為0.5mm，整個 切碎過程，材料需保持浸沒在解離液里，最后再用0.5ml解離液清洗刀片，將培養(yǎng)皿擺成斜 面，使液體和切碎的材料流至培養(yǎng)皿底半弧側(cè)，用修飾過的移液槍頭輕輕混勻培養(yǎng)皿斜壁 上粘連液體;吸取培養(yǎng)皿中的液體，濾過300目濾膜，用1.5ml離心管收集濾液，置于冰中孵 育5分鐘后離心，轉(zhuǎn)速為llOOrpm，溫度4°C，時間5min;吸取上清液1300微升左右，加入200微 升冰浴解離液，再加入1微升母液濃度為2mg/ml的RNase，吹打混勻，避光冰浴染色20min作 為樣品，在流式細(xì)胞儀上采用FL2-A通道使用低速上樣檢測樣品染色體的倍性，所述的流式 細(xì)胞儀為BD Accuri_C6 Flow Cytometer。
[0020] 流式細(xì)胞儀對上述樣品分別進(jìn)行倍性分析結(jié)果見圖1，其中縱坐標(biāo)軸C值代表測定 細(xì)胞數(shù)的相對值，橫坐標(biāo)軸F值代表熒光的通道值，峰值為測試樣品倍性觀測位置。已知單 倍體見圖1-A，其熒光強(qiáng)度高峰出現(xiàn)在253220位置，已知二倍體見圖1-B，其熒光強(qiáng)度高峰出 現(xiàn)在513052位置，已知混倍體見圖1-C，其熒光強(qiáng)度高峰出現(xiàn)在635878的位置。結(jié)合已知不 同倍性材料，以及表型指標(biāo)觀測等，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明采用的流式細(xì)胞儀及其分析步驟對不同倍 性材料的分析結(jié)果穩(wěn)定可靠，操作簡單，鑒別效率顯著提高。
[0021] 實(shí)施例2 材料:二倍體植株Coker 176和Coker 371 Gold，雜交種Fl( Coker 176 為母本、Coker 371 Gold為父本），7V. a/!rica/3a〇
[0022] 不同套袋方法對單倍體誘導(dǎo)效果影響：1)以Cokerl76與Coker371 Gold雜交所得 的雜交種F1作為母本；2)當(dāng)雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.5cm時，以非洲煙 TV. a/rica/3a為父本進(jìn)行雜交，所述雜交為用鑷子剝開母本花瓣，從0.5cm處用解剖刀切斷雄 蕊花絲，將父本花粉涂于母本柱頭，授粉后分別以紙管和紙袋套袋(簡稱紙管法和紙袋法）， 所述紙管法為授粉后用紙管套住已授粉柱頭，并將紙管的頂端折疊，封住柱頭，所述的紙管 為兩端開口，直徑為〇. 45cm，長為4.5cm的紙管。收獲成熟的雜交種種子，按常規(guī)考種方法進(jìn) 行脫粒和精選，各選兩種方法得到的飽滿雜交種種子5000粒，分成9份播種于育苗盤中，35d 后統(tǒng)計存活率及單倍體誘導(dǎo)頻率。存活率為存活植株數(shù)量/播種種子數(shù)量*100%，單倍體誘 導(dǎo)頻率為單倍體數(shù)量/播種種子數(shù)量*100%，單倍體誘導(dǎo)效率為單倍體數(shù)量/存活植株數(shù)量* 100%〇
[0023] 紙袋法與紙管法采收的（Cokerl76與Coker371雜交種）XjV. a/rica/3a雜交組合種 子在播種后1周出苗，多數(shù)幼苗的子葉小，并且不能長出真葉，最終死亡，能夠存活并生長的 植株是混倍體或母本起源單倍體。表1可知，在播種35d后，紙袋法存活苗數(shù)為78株，存活苗 率為1.56%，明顯比紙管法的存活苗多。
[0024] 表型鑒定:觀察兩片真葉的表面有粒狀或起皺、葉緣無波浪狀的煙苗判斷為單倍 體苗，利用流式細(xì)胞術(shù)分析其倍性，得到母本起源的單倍體；流式細(xì)胞儀分析：取1.5 X 1.5cm2大小嫩葉，用去離子水洗凈葉片表面，濾紙吸干表面水分后放入培養(yǎng)皿里，加入lml 預(yù)冷到4°C的解離液，所述解離液為Galbraith' s Buffer，用刀片快速切碎葉片，碎片大小 約為0.5mm，整個切碎過程，材料需保持浸沒在解離液里，最后再用0.5ml解離液清洗刀片， 將培養(yǎng)皿擺成斜面，使液體和切碎的材料流至培養(yǎng)皿底半弧側(cè)，用修飾過的移液槍頭輕輕 混勻培養(yǎng)皿斜壁上粘連液體;吸取培養(yǎng)皿中的液體，濾過300目濾膜，用1.5ml離心管收集濾 液，置于冰中孵育5分鐘后離心，轉(zhuǎn)速為11 OOrpm，溫度4°C，時間5min;吸取上清液1300微升 左右，加入200微升冰浴解離液，再加入1微升母液濃度為2mg/ml的RNase，吹打混勻，避光 冰浴染色20min作為樣品，在流式細(xì)胞儀上采用FL2-A通道使用低速上樣檢測樣品染色體的 倍性。所述的流式細(xì)胞儀為BD Accuri-C6 Flow Cytometer。經(jīng)過表型鑒定和流式細(xì)胞術(shù)分 析結(jié)果表明，紙管法單倍體的誘導(dǎo)頻率比紙袋法高出20%?？梢娂埓ㄝ^易混雜雜交種，存 活苗數(shù)多，增加了單倍體鑒別的難度和工作量。
[0025] 表1不同套袋方法對單倍體誘導(dǎo)效果(5000粒種子）
實(shí)施例3 材料:二倍體植株Coker 176和Coker 371 Gold，雜交種Fl( Coker 176 為母本、Coker 371 Gold為父本），非洲煙TV. a/rica/3a。
[0026] 不同授粉時期對單倍體誘導(dǎo)效果影響：以雜交種Fl(Cokerl76為母本、Coker371 Gold為父本)的花冠長度與萼片長度之差（以SCD表示)為指標(biāo)，分別在SCD為0.5cm、1.5cm、 2.0cm、2.5cm、3.0cm及3.5cm時，剝?nèi)』ɡ?，用解剖刀縱切雄蕊并涂布在花粉萌發(fā)培養(yǎng)基 (0.02%硼酸+2%蔗糖+0.6%瓊脂）上，花粉培養(yǎng)5h后觀察花粉管萌發(fā)情況。在Zeiss Imager A1顯微鏡20倍物鏡下，統(tǒng)計5個視野花粉數(shù)目與花粉管萌發(fā)數(shù)，花粉萌發(fā)率為萌發(fā)的花粉 數(shù)/總花粉數(shù)*100%。
[0027] 在SCD長度為2.5cm、3.0cm時，進(jìn)行授粉，按照實(shí)施例2中的紙管法，以紙管套袋，收 獲成熟的雜交種種子，按常規(guī)考種方法進(jìn)行脫粒、精選，并播種，采用實(shí)施例2中表型鑒定和 流式細(xì)胞儀分析的方法計算存活率和單倍體誘導(dǎo)頻率。
[0028] 在不同SCD長度時期，母本花粉萌發(fā)情況如表2和圖2所示。由表和圖可知，在SCD長 度小于等于2.5cm時，花粉萌發(fā)率為0，母本的花粉還未萌發(fā)，花粉管未伸長，這時去雄，進(jìn)行 雜交，不會有自交情況的發(fā)生。而如果大于3cm時，母本材料的花粉萌發(fā)率在9.6%以上，這時 植株的自交可能已經(jīng)發(fā)生，不利于真雜交種的產(chǎn)生。當(dāng)SCD長度為3.5cm時，母本的花粉基本 完全萌發(fā)，此時母本已經(jīng)完成自交授粉。因此SCD長度為1.5~2.5cm，是開展非洲煙雜交、預(yù) 防混雜的適宜時期，當(dāng)SCD長度太小，母本花柱和柱頭發(fā)育并未成熟，授粉也不容易成功。 [0029]表2不同S⑶長度時花粉萌發(fā)情況
不同S⑶長度時花粉管萌發(fā)情況見圖2，其中圖2-A為S⑶長度為2.5cm，圖2-B為S⑶長度 為3·Ocm。
[0030] 分別在SCD長度為2.5cm和3.0cm時進(jìn)行授粉，紙管法套袋，后代單倍體獲得效率如 表3所示。由表可知，不同時期授粉獲得的單倍體數(shù)和誘導(dǎo)頻率相同，但后代存活苗數(shù)差異 顯著，在S⑶長度3.0cm時授粉，后代存活苗數(shù)明顯比S⑶長度2.5cm時的高?？梢?，在S⑶長度 3.0cm時授粉，后代的植株中有其他混雜的植株，不利于單倍體植株的選擇和鑒別，增加了 單倍體鑒別的難度和工作量。
[0031] 表3不同S⑶長度下授粉單倍體獲得效率(5000粒種子）
通過本發(fā)明實(shí)施例的結(jié)果表明，紙管法單倍體的誘導(dǎo)頻率比紙袋法高、其他非二倍體 材料少，而紙袋法較易混雜其他雜交種，存活苗數(shù)多，增加了苗期單倍體鑒別的難度和工作 量。此外，在SCD長度等于2.5cm時，母本的花粉還未萌發(fā)，花粉管未伸長，這時去雄，進(jìn)行雜 交，不會有自交情況的發(fā)生。而雖然S⑶長度小于2.5cm時，如0.5cm、l .5 cm，母本的花粉也 還未萌發(fā)，花粉管也未伸長，但此時母本花柱和柱頭的發(fā)育不如SCD長度2.5cm時的成熟，對 雜交的成功率和雜交種的產(chǎn)量有較大的影響。而如果SCD大于3cm時，母本材料花粉已經(jīng)萌 發(fā)，特別是當(dāng)其長度為3.5cm時，母本的花粉基本完全萌發(fā)，此時母本有可能已經(jīng)完成自交 授粉。由此可見，S⑶長度為2.5cm左右，是開展非洲煙雜交、預(yù)防混雜的最適宜時期。
[0032] 實(shí)施例4 材料:二倍體植株Coker 176和Coker 371 Gold，雜交種Fl( Coker 176 為母本、Coker 371 Gold為父本），非洲煙TV. a/rica/3a。
[0033] 1)以Cokerl76與Coker371 Gold雜交所得的雜交種F1作為母本； 2) 當(dāng)雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.0時，以非洲煙#.a/riCa/3a為父本進(jìn)行 雜交，所述的雜交具體為用鑷子剝開母本花瓣，從〇.5cm處用解剖刀切斷雄蕊花絲，將父本 花粉涂于母本柱頭，授粉后用紙管套住已授粉柱頭，所述的紙管為兩端開口，直徑為〇.5cm， 長為5.0cm的紙管，并將紙管的頂端折疊，封住柱頭，待種子成熟后，收獲成熟的雜交種種 子，進(jìn)行脫粒、精選，并播種； 3) 當(dāng)步驟2中播種的煙苗兩片真葉時，采集表型判斷為單倍體的植株葉片，利用流式細(xì) 胞術(shù)分析其倍性，得到母本起源的單倍體。所述的表型判斷為單倍體的植株葉片具體為觀 察兩片真葉的表面有粒狀或起皺、葉緣無波浪狀的煙苗判斷為單倍體苗;所述的利用流式 細(xì)胞術(shù)分析的具體步驟為:取1.5 X 1.5cm2大小嫩葉，用去離子水洗凈葉片表面，濾紙吸干 表面水分后放入培養(yǎng)皿里，加入lml預(yù)冷到4°C的解離液，所述解離液為Galbraith's Buffer，用刀片快速切碎葉片，碎片大小約為0.5mm，整個切碎過程，材料需保持浸沒在解離 液里，最后再用0.5ml解離液清洗刀片，將培養(yǎng)皿擺成斜面，使液體和切碎的材料流至培養(yǎng) 皿底半弧側(cè)，用修飾過的移液槍頭輕輕混勻培養(yǎng)皿斜壁上粘連液體;吸取培養(yǎng)皿中的液體， 濾過300目濾膜，用1.5ml離心管收集濾液，置于冰中孵育5分鐘后離心，轉(zhuǎn)速為11 OOrpm，溫 度4°C，時間5min;吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴解離液，再加入1微升母液濃 度為2mg/ml的RNase，吹打混勻，避光冰浴染色20min作為樣品，在流式細(xì)胞儀上采用FL2-A 通道使用低速上樣檢測樣品染色體的倍性，所述的流式細(xì)胞儀為BD Accuri-Ce Flow Cytometer。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種母本起源的煙草單倍體，其特征在于所述煙草單倍體是以Coker 176與Coker371 Gold雜交所得的雜交種F1作為母本，以非洲煙TV. a/rica/3a為父本，進(jìn)行雜交篩選所得。2. -種如權(quán)利要求1所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于包括以下步 驟： 1) 以0〇1^1'176與&31^13716〇1(1雜交所得的雜交種？1作為母本； 2) 當(dāng)雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.0~2.5cm時，以非洲煙見a/riCa/3a為父 本進(jìn)行雜交，授粉后用紙管套住已授粉柱頭，并將紙管的頂端折疊，封住柱頭，待種子成熟 后，收獲成熟的雜交種種子，進(jìn)行脫粒、精選，并播種； 3) 當(dāng)步驟2中播種的煙苗兩片真葉時，采集表型判斷為單倍體的植株葉片，利用流式細(xì) 胞術(shù)分析其倍性，得到母本起源的單倍體。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于步驟2中所述的 雜交種F1的花冠長度與萼片長度之差為2.5cm。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于步驟2中所述的 雜交具體為用鑷子剝開母本花瓣，從〇. 5cm處用解剖刀切斷雄蕊花絲，將父本花粉涂于母本 柱頭。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于步驟2中所述的 紙管為兩端開口，直徑為〇 · 45~0 · 5cm，長為4 · 5~5 · 0cm的紙管。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于步驟3中所述的 表型判斷為單倍體的植株葉片具體為觀察兩片真葉的表面有粒狀或起皺、葉緣無波浪狀的 煙苗判斷為單倍體苗。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于步驟3中所述的 利用流式細(xì)胞術(shù)分析的具體步驟為:取1.5 X 1.5cm2大小嫩葉，用去離子水洗凈葉片表面， 濾紙吸干表面水分后放入培養(yǎng)皿里，加入lml預(yù)冷到4 °C的解離液，所述解離液為 Galbraith' s Buffer，用刀片快速切碎葉片，碎片大小約為0.5mm，整個切碎過程，材料需保 持浸沒在解離液里，最后再用〇. 5ml解離液清洗刀片，將培養(yǎng)皿擺成斜面，使液體和切碎的 材料流至培養(yǎng)皿底半弧側(cè)，用修飾過的移液槍頭輕輕混勻培養(yǎng)皿斜壁上粘連液體;吸取培 養(yǎng)皿中的液體，濾過300目濾膜，用1.5ml離心管收集濾液，置于冰中孵育5分鐘后離心，轉(zhuǎn)速 為1 lOOrpm，溫度4°C，時間5min;吸取上清液1300微升左右，加入200微升冰浴解離液，再加 入1微升母液濃度為2mg/ml的RNase，吹打混勻，避光冰浴染色20min作為樣品，在流式細(xì)胞 儀上采用FL2-A通道使用低速上樣檢測樣品染色體的倍性。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的母本起源煙草單倍體的育種方法，其特征在于所述的流式細(xì) 胞儀為BD Accuri_C6 Flow Cytometer。
【文檔編號】A01H1/02GK105993929SQ201610585228
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月25日
【發(fā)明人】陳學(xué)軍, 曾建敏, 焦芳嬋, 童治軍, 肖炳光, 張誼寒, 李永平
【申請人】云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院