一種同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、大腸桿菌o157:h7、沙門氏菌和志賀氏菌的試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種可同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌的一管多重?cái)U(kuò)增內(nèi)標(biāo)PCR試劑盒，該試劑盒包含：PCR反應(yīng)預(yù)混液及對(duì)照品；檢測(cè)方法是：首先采集樣品，進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)后提取DNA，制備PCR反應(yīng)管，置于PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果判定。優(yōu)點(diǎn)是：該試劑盒一次反應(yīng)可以同時(shí)快速檢測(cè)上述四種細(xì)菌，且能避免因?yàn)闃悠诽幚磉^程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假陰性結(jié)果而導(dǎo)致的誤判。與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，該方法使用方便、可靠性好、檢測(cè)周期短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、操作步驟簡(jiǎn)單，適用于高通量操作、標(biāo)準(zhǔn)化操作，有助于提高食品安全檢測(cè)的水平及食源性疾病的預(yù)防和控制。
【專利說明】
一種同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、大腸桿菌0157: H7、沙門氏菌和志賀氏菌的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)，尤其涉及一種可同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌和志賀氏菌多重體系的試劑盒，可以對(duì)含有以上4種細(xì)菌的樣品同時(shí)進(jìn)行鑒別檢測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002]食源性疾病(foodborne disease)涵蓋范圍非常廣泛，在全世界范圍無論發(fā)達(dá)國家還是發(fā)展中國家都是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，2011年，中國每6.5人中就有I人曾經(jīng)發(fā)生過食源性疾病。食源性疾病的全球發(fā)病率難以估計(jì)，但據(jù)報(bào)告，僅2005年就有180萬人死于腹瀉病。這些病例的大部分可歸因于食品和飲用水污染，而食源性致病菌是主要的根源。
[0003]2012年9月25日，衛(wèi)生部公布了《食品中致病菌限量》征求意見稿，提出了沙門氏菌、大腸桿菌等主要致病菌在多類食品中的限量要求，同時(shí)宣布該標(biāo)準(zhǔn)將在正式發(fā)布后6個(gè)月施行。副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌和志賀氏菌是幾種最常見的食源性致病菌，它們能夠直接或間接污染食品及水源，人經(jīng)口感染可導(dǎo)致腸道傳染病的發(fā)生及食物中毒以及畜禽傳染病的流行。目前，對(duì)這幾種常見的食源性致病菌的常用方法主要有傳統(tǒng)生物學(xué)方法、膠體金試紙條檢測(cè)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等。傳統(tǒng)生物學(xué)方法耗時(shí)比較長(zhǎng)、檢測(cè)步驟比較復(fù)雜，膠體金試紙條檢測(cè)價(jià)格比較昂貴、檢測(cè)靈敏度偏低，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)價(jià)格昂貴、操作需要一定技術(shù)，因此需要建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異的檢測(cè)方法，特別是對(duì)大量樣品的高通量、快速、同時(shí)檢測(cè)。多重PCR方法是一種操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，除具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)之外，還可以在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)擴(kuò)增兩份或者多份DNA樣本的不同目的基因片段，特別適合用于食源性致病菌多重體系的快速診斷。本發(fā)明在多重PCR方法的基礎(chǔ)上又增加了一對(duì)擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引物，可以有效排除因?yàn)闃悠诽幚磉^程中存在對(duì)DNA聚合酶活性具有抑制作用的物質(zhì)或操作失誤等原因而導(dǎo)致的結(jié)果呈現(xiàn)假陰性，可以提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種可同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌和志賀氏菌的含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的多重體系的試劑盒，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、敏感性高、特異性強(qiáng)，適合高通量的快速檢測(cè)，能夠避免因?yàn)闃悠诽幚磉^程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假陰性結(jié)果而導(dǎo)致的誤判。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)解決方案是:一種同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌和志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特殊之處在于:
該試劑盒包含:無菌去離子水、PCR反應(yīng)預(yù)混液、對(duì)照品和DNA染料；
所述PCR反應(yīng)預(yù)混液含有PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，檢測(cè)用引物；
所述PCR反應(yīng)緩沖液中含Mg2+的濃度為0.8mM，脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0.12mM，Taq DNA聚合酶的濃度為0.03U/yl ；
所述檢測(cè)用引物為如下10條引物的混合物，其序列和產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為:
擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)27F 序列為:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R序列為:TACGGYTACCTTTGTTACGACTT，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度約 1500bp (見序列表11、16、17和18);
副溶血弧菌aadSF序列為:GGAATTCGCAGTGATCGCCGCTTGAG，aadSR序列為:CGCGTCGACAGCATCGCGGTTATAGG，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為1164bp(見序列表12);
大腸桿菌0157: H7rfbEF序列為:CTACTGTAAGTAATGGAACGGTTGC，rfbER序列為:TGCGGTCCTAGTTAGAATTGAGACC，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為713bp(見序列表13);
沙門氏菌 invAF序列為:GGAACGAACTAATTCAGCGATA，invAR序列為:AGATGTCATTAACCTTGTGGAG，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為435bp(見序列表14);
志賀氏菌ipaHF序列為:GAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG，ipaHR序列為:GTGATTATGAATGGTGCAGTCGTGAGC，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為298bp(見序列表15);
所述對(duì)照品分為陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，陰性對(duì)照品模板為無菌去離子水，陽性對(duì)照品模板為各對(duì)引物相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至T載體后獲得的質(zhì)?；蚪M混合物。
[0006]一種同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌、大腸桿菌0157: H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，方法是:
(1)樣品采集:無菌采集可疑乳及乳制品樣品；
(2)增菌培養(yǎng):將采集的可疑乳及乳制品樣品混合均勻后無菌取樣，液體乳及乳制品直接無菌量取，固體奶制品放入無菌研缽、組織研磨器或均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2?5min，加入預(yù)熱至45 0C的無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ± I °(:振蕩培養(yǎng)6?8h，得到增菌液；
(3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取Iml于離心管中1000?1500r/mim離心I?2min，除去較大塊的碎片，取上清8000?12000r/mim離心I?2min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000?12000r/mim離心I?2min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5?1min，冰浴5?1min，1000?5000r/mim離心5?lOmin，上清液即為樣品模板DNA，調(diào)整濃度至10?30ng/yl備用，或-20°C保存；
(4)PCR反應(yīng)管制備:所有操作均需在冰上進(jìn)行;先將PCR反應(yīng)預(yù)混液置于冰上融化，吸取50μ1置于PCR反應(yīng)管中，再加入Ιμ?樣品模板DNA，用手指輕彈制備好的PCR反應(yīng)管或用微量移液器吹打混勻，瞬時(shí)高速離心2s ;按照陰性對(duì)照品、實(shí)際檢測(cè)樣品、陽性對(duì)照品的順序分別制備PCR反應(yīng)管；
(5)擴(kuò)增檢測(cè):將制備的陰性對(duì)照品、樣品模板DNA和陽性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?95 °C預(yù)變性5min ； 95 V變性40s，56.7 °C退火40s，72 °C延伸70s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 °C延伸1min，4 °C保存。擴(kuò)增得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，判定檢測(cè)結(jié)果；
(6)檢測(cè)結(jié)果判定:將Ig瓊脂糖溶于10ml的0.5XTBE電泳緩沖液中，然后加入5μ1DNA染料，混勻煮沸，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，用微量移液器吸取PCR產(chǎn)物5μ1加入凝膠孔中進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍照，判定結(jié)果:(a)陽性對(duì)照的凝膠孔有5條電泳條帶而陰性對(duì)照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應(yīng)檢測(cè)成功；(b)若陰性對(duì)照有條帶，說明PCR反應(yīng)管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進(jìn)行PCR檢測(cè)；(c)陽性對(duì)照有5條帶，陰性對(duì)照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500bp的電泳條帶與陽性對(duì)照的凝膠孔相應(yīng)位置的條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性；(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)2條或2條以上電泳條帶，且與陽性對(duì)照的凝膠孔中相應(yīng)位置的條帶大小一致，而陰性對(duì)照無條帶，則判定為與相應(yīng)條帶大小對(duì)應(yīng)的目的細(xì)菌呈陽性;副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的特異性條帶大小分別為1164bp、713bp、435bp、298bp;(e)陽性對(duì)照的凝膠孔有5條電泳條帶，陰性對(duì)照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在1500bp位置沒有電泳條帶，說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進(jìn)行樣品處理；(f)陽性對(duì)照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測(cè)結(jié)果無效。
[0007]本發(fā)明的有益效果:檢測(cè)用引物是根據(jù)目的細(xì)菌的特異性基因或特異片段而設(shè)計(jì)的特征性引物，組裝成試劑盒后可以用于食品中目的細(xì)菌的快速檢測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查、藥物療效監(jiān)測(cè)等方面。與現(xiàn)有的檢測(cè)方法相比，該方法使用方便、可靠性好、檢測(cè)周期短、靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低廉、操作步驟簡(jiǎn)單，適用于高通量操作、標(biāo)準(zhǔn)化操作，而且可以鑒別因?yàn)闃悠诽幚磉^程中存在DNA聚合酶的抑制因子得到假陰性結(jié)果而導(dǎo)致的誤判，對(duì)提高食品安全檢測(cè)水平具有重要意義。
【附圖說明】
[0008]圖1:檢測(cè)成功的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。陰性對(duì)照無條帶，而陽性對(duì)照在約1500bp、1164bp、713bp、435bp和298bp處分別有5條電泳條帶，說明檢測(cè)成功。檢樣I只在約1500bp處有I條擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)條帶，與陽性對(duì)照相應(yīng)位置條帶大小一致，在其他位置無條帶，說明檢樣I中副溶血弧菌、大腸桿菌0157: H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種細(xì)菌均為陰性;第2泳道在1500bp和1164bp處有2個(gè)條帶與陽性對(duì)照位置一致，說明檢樣I副溶血弧菌呈陽性;第3泳道在1500bp和713bp處有2個(gè)條帶與陽性對(duì)照位置一致，說明檢樣3大腸桿菌0157:H7呈陽性;第4泳道在1500bp和435bp處有2個(gè)條帶與陽性對(duì)照位置一致，說明檢樣4沙門氏菌呈陽性;第5在1500bp和298bp處有2個(gè)條帶與陽性對(duì)照位置一致，說明檢樣5志賀氏菌呈陽性。
[0009]圖2:檢測(cè)過程中發(fā)生交叉污染而導(dǎo)致檢測(cè)失敗的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。陰性對(duì)照有電泳條帶出現(xiàn)，說明樣品處理過程中被交叉污染，檢測(cè)結(jié)果不可信，需要重新進(jìn)行檢測(cè)。
[0010]圖3:樣品處理過程中存在抑制DNA聚合酶活性的物質(zhì)或操作失誤而導(dǎo)致檢測(cè)失敗的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。陰對(duì)照無條帶，陽性對(duì)照有5條電泳條帶，而檢樣I在約1500bp處無擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)條帶，說明樣品處理過程中存在抑軸)NA聚合酶活性的物質(zhì)或操作失誤，檢測(cè)結(jié)果不可信，需要重新進(jìn)行處理后檢測(cè)。
[0011]圖4:對(duì)應(yīng)實(shí)施例1的部分實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果。
[0012]圖1到圖4中，M: 250bp DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；陽:陽性對(duì)照；陰:陰性對(duì)照；1-13:對(duì)應(yīng)實(shí)施例I的部分實(shí)際樣品(圖中的編號(hào)是按順序排列，不同圖中的同一個(gè)數(shù)字編號(hào)可能并非同一份樣品)。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 實(shí)施例1
(1)樣品采集:根據(jù)符合規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)及采樣方法，從不同的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市等無菌采集蔬菜、水產(chǎn)品、肉及肉制品、乳及乳制品、蛋類及蛋制品等各種食品樣品；
(2)樣品的增菌培養(yǎng):將無菌采集的樣品無菌取樣25g，放入無菌研缽或者組織研磨器內(nèi)勾楽，或置于無菌均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2min，加入225ml無菌的含I %氯化鈉的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基于37°C條件培養(yǎng)8-12h，得到增菌液；
(3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勾后，取Iml于離心管中1000r/mim離心lmin，除去較大塊的碎片，取上清10000r/mim離心2min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，10000r/mim離心2min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，再采用商品化的試劑盒提取DNA或者采取反復(fù)凍融法提取DNA，即直接沸水浴，冰浴，離心，取上清液，得樣品模板DNA，用無菌蒸餾水調(diào)整至濃度約為1ng/μ?，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增或于-20°C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> (4)PCR反應(yīng)管制備:所有操作均需在冰上進(jìn)行;先將PCR反應(yīng)預(yù)混液置于冰上融化，吸取50μ1置于無菌PCR反應(yīng)管中，再加入Ιμ?樣品模板DNA，用手指輕彈制備好的PCR反應(yīng)管或用微量移液器吹打混勻，瞬時(shí)高速離心2s;按照陰性對(duì)照品、實(shí)際檢測(cè)樣品、陽性對(duì)照品的順序分別制備PCR反應(yīng)管；
(5)擴(kuò)增檢測(cè):將制備的陰性對(duì)照品、樣品模板DNA和陽性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;反應(yīng)程序?yàn)?95 °C預(yù)變性5min ； 95 °C變性40s，56.7 °C退火40s，72°C延伸70s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72°C延伸10min，4°C保存；
(6)檢測(cè)結(jié)果判定:將Ig瓊脂糖溶于10ml的0.5XTBE電泳緩沖液中，然后加入5μ1DNA染料，混勻煮沸，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，用微量移液器吸取PCR產(chǎn)物5μ1加入凝膠孔中進(jìn)行電泳；電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍照，判定結(jié)果:(a)陽性對(duì)照的凝膠孔有5條電泳條帶而陰性對(duì)照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應(yīng)檢測(cè)成功；(b)若陰性對(duì)照有條帶，說明PCR反應(yīng)管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進(jìn)行PCR檢測(cè)；(c)陽性對(duì)照有5條帶，陰性對(duì)照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500bp的電泳條帶與陽性對(duì)照的凝膠孔相應(yīng)位置的條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性；(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)2條或2條以上電泳條帶，且與陽性對(duì)照的凝膠孔中相應(yīng)位置的條帶大小一致，而陰性對(duì)照無條帶，則判定為與相應(yīng)條帶大小對(duì)應(yīng)的目的細(xì)菌呈陽性;副溶血弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的特異性條帶大小分別為1164bp、713bp、435bp、298bp;(e)陽性對(duì)照的凝膠孔有5條電泳條帶，陰性對(duì)照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在1500bp位置沒有電泳條帶，說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進(jìn)行樣品處理；(f)陽性對(duì)照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測(cè)結(jié)果無效。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157: H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是: 該試劑盒包含:無菌去離子水、PCR反應(yīng)預(yù)混液、對(duì)照品和DNA染料； 所述PCR反應(yīng)預(yù)混液含有PCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、Taq DNA聚合酶，檢測(cè)用引物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述PCR反應(yīng)緩沖液中含Mg2+的濃度為0.8 mM，所述脫氧核糖核苷三磷酸的濃度為0.12 mM，所述Taq DNA聚合酶的濃度為1.5 U/反應(yīng)管。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述檢測(cè)用引物為如下10條引物的混合物，其序列分別為: 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引物，27F 序列:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492R 序列:TACGGYTACCTTTGTTACGACTT； 副溶血弧菌特征引物，aadSF序列:GGAATTCGCAGTGATCGCCGCTTGAG，aadSR序列:CGCGTCGACAGCATCGCGGTTATAGG； 大腸桿菌特征引物，0157: H7rf bEF序列:CTACTGTAAGTAATGGAACGGTTGC，rf bER序列:TGCGGTCCTAGTTAGAATTGAGACC； 沙門氏菌特征引物，invAF序列:GGAACGAACTAATTCAGCGATA，invAR序列:AGATGTCATTAACCTTGTGGAG； 志賀氏菌特征引物，ipaHF序列:GAATTTACGGACTGGTTCTCCCTCTGG，ipaHR序列:GTGATTATGAATGGTGCAGTCGTGAGC。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述檢測(cè)用引物的濃度分別為: 擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)27?和14921?濃度均為0.1 μΜ，副溶血弧菌特征引物aadSF和aadSR濃度均為0.16 μΜ，大腸桿菌0157:H7特征引物rfbEF和rfbER濃度均為0.1 μΜ，沙門氏菌特征引物invAF和invAR濃度均為0.1 μΜ，志賀氏菌特征引物ipaHF和ipaHR濃度均為0.04 μΜ。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:Η7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:所述對(duì)照品分為陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，陰性對(duì)照品模板為無菌去離子水，陽性對(duì)照品模板為各對(duì)引物相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物連接至T載體后獲得的質(zhì)?；蚪M混合物。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:Η7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是: 使用本試劑盒同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:Η7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的方法是: (1)樣品采集:無菌采集可疑乳及乳制品樣品； (2)增菌培養(yǎng):將采集的可疑乳及乳制品樣品混合均勻后無菌取樣，液體乳及乳制品直接無菌量取，固體奶制品放入無菌研缽、組織研磨器或均質(zhì)袋內(nèi)均質(zhì)2?5 min，加入預(yù)熱至450C的無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ± 1°C振蕩培養(yǎng)6?8 h，得到增菌液； (3)DNA提取:取培養(yǎng)后的增菌液，振蕩混勻，取Iml于離心管中1000?1500 r/mim離心I?2 min，除去較大塊的碎片，取上清8000?12000 r/mim離心I?2 min，傾去上清液，倒置于吸水紙上不同的位置，吸干殘留液體，再用無菌去離子水重懸、洗滌沉淀，8000?12000r/mim離心I?2 min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴5?10 min，冰浴5?10min，1000?5000 r/mim離心5?10 min，上清液即為樣品模板DNA，調(diào)整濃度至約為10?30ng/μ I備用，或-20 °C保存； (4)PCR反應(yīng)管制備:所有操作均需在冰上進(jìn)行；先將PCR反應(yīng)預(yù)混液置于冰上融化，吸取50 μ?置于無菌PCR反應(yīng)管中，再加入I μ?樣品模板DNA，用手指輕彈制備好的PCR反應(yīng)管或用微量移液器吹打混勻，瞬時(shí)高速離心2 s ；按照陰性對(duì)照品、實(shí)際檢測(cè)樣品、陽性對(duì)照品的順序分別制備PCR反應(yīng)管； (5)擴(kuò)增檢測(cè):將制備的陰性對(duì)照品、實(shí)際檢測(cè)樣品和陽性對(duì)照品的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (6)檢測(cè)結(jié)果判定:將Ig瓊脂糖溶于100 ml的0.5XTBE電泳緩沖液中，然后加入5 μ?DNA染料，混勻煮沸，傾倒凝膠板;凝膠冷卻凝固后，用微量移液器吸取PCR產(chǎn)物5 μ?加入凝膠孔中進(jìn)行電泳;電泳結(jié)束后取出凝膠置于紫外燈下觀察、拍照，判定結(jié)果:(a)陽性對(duì)照的凝膠孔有5條電泳條帶而陰性對(duì)照的凝膠孔無任何條帶，則PCR反應(yīng)檢測(cè)成功；(b)若陰性對(duì)照有條帶，說明PCR反應(yīng)管制備過程中有交叉污染，結(jié)果不可靠，建議重新進(jìn)行PCR檢測(cè)；(c)陽性對(duì)照有5條帶，陰性對(duì)照沒有條帶，被檢樣品的凝膠孔只出現(xiàn)I條約1500 bp的電泳條帶與陽性對(duì)照的凝膠孔相應(yīng)位置的條帶大小一致，則結(jié)果判斷為陰性;(d)被檢樣品的凝膠孔出現(xiàn)2條或2條以上電泳條帶，且與陽性對(duì)照的凝膠孔中相應(yīng)位置的條帶大小一致，而陰性對(duì)照無條帶，則判定為與相應(yīng)條帶大小對(duì)應(yīng)的目的細(xì)菌呈陽性;副溶血性弧菌、大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌4種細(xì)菌相對(duì)應(yīng)的特異性條帶大小分別為1164 bp,713 bp,435 bp,298bp; (e)陽性對(duì)照的凝膠孔有5條電泳條帶，陰性對(duì)照的凝膠孔無任何條帶，而被檢樣品的凝膠孔在1500 bp位置沒有電泳條帶，說明樣品處理過程中存在酶抑制劑，建議換其他方法進(jìn)行樣品處理;(f)陽性對(duì)照沒有條帶，說明試劑盒失效，本次檢測(cè)結(jié)果無效。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:樣品的增菌培養(yǎng)基胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基含有1%氯化鈉，以保證能夠使副溶血弧菌正常生長(zhǎng)，同時(shí)又不抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種同時(shí)檢測(cè)副溶血性弧菌、大腸桿菌0157:H7、沙門氏菌、志賀氏菌4種常見食源性致病菌的試劑盒，其特征是:擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)的反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性5min;95°C變性40 s，56.7°C退火40 s，72°C延伸70 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min,4 °C保存。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105821133SQ201610279017
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】勵(lì)建榮, 張德福, 張明, 李春, 李婷婷, 徐永霞, 儀淑敏, 劉雪飛, 張麗華, 白鳳翎, 趙禹宗
【申請(qǐng)人】渤海大學(xué)