雞pthlh基因5′調(diào)控區(qū)兩個(gè)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在雞育種中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雞PTHLH基因5′調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其在育種中的應(yīng)用，雞PTHLH 5′調(diào)控區(qū)存在2個(gè)突變位點(diǎn)，即?1827(A>G)和?165(C>T)位點(diǎn)，并用SHEsis在線軟件進(jìn)行了連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱性白洛克雞中這兩個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)完全連鎖狀態(tài)。兩個(gè)位點(diǎn)均與開產(chǎn)日齡及32周產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)，AC/GT基因型的開產(chǎn)日期極顯著早于GT/GT和AC/AC基因型，同時(shí)32周產(chǎn)蛋數(shù)也極顯著多于另外兩種基因型。本發(fā)明方法簡便快捷，并且有助于選育開產(chǎn)早、產(chǎn)蛋數(shù)多的雞品種，為標(biāo)記輔助育種工作提供有利的幫助。
【專利說明】
雞PTHLH基因5'調(diào)控區(qū)兩個(gè)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)巧方法及其在 雞育種中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及了一種雞PTOLH基因5/調(diào)控區(qū)的兩個(gè)突變 位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法及其育種中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲狀旁腺激素樣激素 （Parathyroid hormone-like hormone,PTHLH)也叫甲狀旁 腺相關(guān)蛋白（Parathyroid hormone-related hormone,PTHrP)，首次發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)80年代， 被認(rèn)為是引起惡性腫瘤伴發(fā)的體液高巧血癥的主要原因 （Moseley et al，1987) JTOLH廣 泛分布于骨骼、膜腺、乳腺、腎臟、胃、子宮等多種胎兒及成年組織中，通過旁分泌、自分泌、 細(xì)胞內(nèi)分泌等形式起作用，生物學(xué)功能設(shè)及巧轉(zhuǎn)運(yùn)(Weir et al,1996;Miao et al,2004; Ma;rtin et al,2005)、骨形成（Qithbe;rtson et al,1999;Zhao et al,2002;Pinhei;ro et al,2010;Klopocki et al,2010)、平滑肌收縮及妊娠的維持(Thiede et al, 1990;Feguson et al,1994;Guo et al,2012;E;rbach et al,2013)、細(xì)胞生長與分化的調(diào)控（化savada et al，1996;Wojc化 et al，1998;Aya et al，1999)等多個(gè)方面。
[0003] 分子標(biāo)記輔助選擇育種，是在分子水平上對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行選擇，可W不受環(huán)境影 響，通過遺傳背景選擇，減少連鎖累寶，從而加速育種過程及精準(zhǔn)度?；虮磉_(dá)是生命過程 中的細(xì)胞把儲(chǔ)存在DNA序列上的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)的過程。其中，轉(zhuǎn) 錄受5/調(diào)控區(qū)序列的調(diào)控，其堿基突變通常會(huì)影響轉(zhuǎn)錄的起始，從而影響基因的表達(dá)。因 此，研究雞PTOLH的5/調(diào)控區(qū)的SNPs，有助于找到有意義的分子標(biāo)記，為雞的標(biāo)記輔助選擇 育種提供有利的理論依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，具體設(shè)及了一種雞PTOLH基因5/調(diào)控區(qū)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法 及其在育種中的應(yīng)用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)雞PTOLH 5/調(diào)控區(qū)存在2個(gè)突變位點(diǎn)，即-1827(A〉G)和- 165(C〉T)位點(diǎn)，并用S皿sis在線軟件進(jìn)行了連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)兩個(gè)位點(diǎn)在隱性 白洛克雞中呈現(xiàn)完全連鎖狀態(tài)。因此對(duì)其進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)標(biāo)記分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位點(diǎn)均與 開產(chǎn)日齡及32周產(chǎn)蛋數(shù)相關(guān)，AC/GT基因型的開產(chǎn)日齡極顯著早于GT/GT和AC/AC基因型，同 時(shí)32周產(chǎn)蛋數(shù)也極顯著多于另外兩種基因型?？梢姍z測運(yùn)兩個(gè)與產(chǎn)蛋性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo) 記，不僅方法簡便快速，并且有助于選育高產(chǎn)蛋的雞種，為育種工作提供有利的幫助。
[0005] 本發(fā)明的具體標(biāo)記方法是：
[0006] 采用標(biāo)記引物P-PTHLH，包括
[0007] P-PTHLH-F，其序列如Seq ID No:l所示；
[000引 P-PTHLH-R，其序列如SeqIDNo:2所示；
[0009]擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到 的序列如Seq ID No:3所示，結(jié)果檢測到存在2個(gè)突變位點(diǎn)，即-1827(A〉G)和-165(Cパ)位 點(diǎn)。
[0010]在開產(chǎn)晚的群體中，選擇AC/AC純合基因型和GT/GT純合基因型的公母雞通過相互 交配得到AC/GT雜合基因型，由運(yùn)樣個(gè)體組成的群體具有開產(chǎn)早、產(chǎn)蛋數(shù)多的特點(diǎn)。
[0011 ]通過運(yùn)種標(biāo)記方法得到的AC/GT基因型種雞能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，在產(chǎn)蛋性 能低的地方品種中有意增加 AC/GT基因型的頻率對(duì)提高產(chǎn)蛋量是一個(gè)有效措施，而對(duì)于開 產(chǎn)較晚的群體，運(yùn)樣的措施會(huì)使其開產(chǎn)提前，從而實(shí)現(xiàn)早期選種。 (四）
【附圖說明】
[0012]圖1為P-PTHLH-F/R引物PCR擴(kuò)增的片段電泳圖，
[OOK] 圖2為雞PTHLH 5/調(diào)控區(qū)-1827(A〉GK正向）、-165(C〉T)(反向）位點(diǎn)的多態(tài)性測序 圖；
[0014]圖3為隱性白洛克雞中2個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的連鎖不平衡關(guān)系圖；
[0015]圖4為構(gòu)建點(diǎn)突變PGL3-載體后序列比對(duì)結(jié)果；
[0016] 圖5為Wt-PTHLH和mut-PirnH兩種基因型及FSH處理后雙巧光素酶報(bào)告基因啟動(dòng)活 性檢測示意圖； (五)
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例1雞PTHLH 5/調(diào)控區(qū)序列比對(duì)及多態(tài)性位點(diǎn)分析 [001引 1.試驗(yàn)材料
[0019] 48只隱性白洛克雞（山東紀(jì)華家禽育種有限公司），隨機(jī)采樣，翅靜脈采血，提取基 因組后，-20°C保存。
[0020] 2.試驗(yàn)方法
[0021] 2.1引物設(shè)計(jì)
[0022] 根據(jù)已發(fā)表紅色原雞序列(GenBank Accession NC_006088.4)設(shè)計(jì)引物P-PTHLH (其序列詳見表巧日SeqIDNo:l/SeqIDNo:2)，此引物是為研究雞PT化H5/調(diào)控區(qū)的突變 而根據(jù)數(shù)據(jù)庫中登錄的紅色原雞的序列特意設(shè)計(jì)的。
[0023] 2.2PCR 擴(kuò)增
[0024] 隨機(jī)選取48只隱性白洛克雞基因組，用引物P-PTHLH進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物見表1，反 應(yīng)體系20化，其中包括化L基因組DNA(50-100ng)，10M12XPrimeSTARGCBuffer，l.化L dNTPs(2.5mM each，TaKaRa)，上下游引物各0.5化（lOiiM)，0. liiLPrimeSTAR HSDNA 口〇17111日^3日（51]/化，了日1(日1?日），(1加2〇補(bǔ)足至20化。擴(kuò)增程序：94°(：預(yù)變性5111111;98°(：變性 10sec，60°C退火15sec，72°C延伸2min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);循環(huán)結(jié)束72°C解育5min。
[0025] 將48只個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物隨機(jī)混合分為6組，每組8個(gè)個(gè)體，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電 泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(A巧Prep DNA Gel Extraction Kit,AXYGEN)進(jìn)行回收，送濟(jì) 南銷尚生物技術(shù)公司測序。
[0026] 表1引物的序列、位置和退火溫度
[0027]
[002引3.結(jié)果與分析
[00巧]PCR產(chǎn)物電泳見附圖1，目的片段2144bp。
[0030] 使用DMMAN version 7.0比對(duì)序列同源性和完成突變核巧酸的檢索，用 C虹omasPro軟件對(duì)測序結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的隱性白洛克雞PTHL冊(cè)/調(diào)控區(qū)-1827(A〉G)和- 165(C〉T)位點(diǎn)存在SNP(見附圖2)。
[0031] 實(shí)施例2雞PTHL冊(cè)/調(diào)控區(qū)多態(tài)性與開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋量的關(guān)聯(lián)分析
[0032] 1試驗(yàn)材料
[0033] 隨機(jī)選取50只濟(jì)寧百日雞(濟(jì)寧大唐百日雞保種場）、50只新楊褐雞(上海家禽育 種有限公司）、50只議上蘆花雞（山東省濟(jì)寧市議上縣）、45只海蘭褐雞（山東泰安海蘭褐育 種公司）和有產(chǎn)蛋記錄的隱性白洛克雞550只（山東紀(jì)華家禽育種有限公司）。^上均為隨機(jī) 采樣，翅靜脈采血，提取基因組后，-20°C保存。
[0034] 2試驗(yàn)方法
[0035] 2.1PCR 擴(kuò)增
[0036] W基因組為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物見表1，反應(yīng)體系40化，其中包括化L基因組 DNA( 50-100ng)，20化2 X PrimeSTARGCBuf f er，3.化L dNTPs (2.5mM each，hKaRa)，上下游 引物各化L(1 OyM)，0.化LPrimeSTAR HSDNA po 1 ymerase(抓/化，hKaRa)，d地2〇補(bǔ)足至40y L。擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性5min; 98°C變性lOsec，60°C退火15sec，72°C延伸2min，進(jìn)行35個(gè)循 環(huán);循環(huán)結(jié)束72°C解育5min。
[0037] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(AxyPrep DM Gel Extraction Kit,AXYGEN)進(jìn)行回收，送濟(jì)南銷尚生物技術(shù)公司測序。
[0038] 2.2單倍型構(gòu)建及關(guān)聯(lián)分析
[0039] 利用DNAMAN version 7.0和化romasPro對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，R軟件統(tǒng)計(jì)基 因型和基因型頻率，S肥S is軟件構(gòu)建單倍型。
[0040] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件包的化M程序進(jìn)行基因型與性狀(產(chǎn)蛋數(shù)、開產(chǎn)日 齡)的關(guān)聯(lián)分析。不同基因型間的比較分析用最小二乘法，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn) 誤表示化SM±SE)，顯著水平設(shè)定P<0.05。
[0041] 3結(jié)果與分析
[0042] 3.1PTHLH 5/調(diào)控區(qū)2個(gè)突變位點(diǎn)在不同品種中基因型和等位基因頻率的分布
[0043] 用S皿sis在線軟件分析PTOLH 5/調(diào)控區(qū)2個(gè)突變位點(diǎn)在隱性白洛克雞中的連鎖不 平衡關(guān)系，結(jié)果表明：兩個(gè)呈現(xiàn)完全連鎖狀態(tài)（附圖3)。統(tǒng)計(jì)了白洛克、文昌雞、濟(jì)寧百日雞 和議上蘆花雞品種的基因型和等位基因頻率。分析結(jié)果見表2。
[0044] 由表2到表3可知，隱性白洛克550個(gè)個(gè)體中，-1827(4〉6)、-165(01')位點(diǎn)的優(yōu)勢等 位基因分別為A、C;野生純合基因型和雜合基因型的頻率均高于突變純合基因型。不同品種
[0046] 中基因型頻率及等位基因頻率存在差異。[0045] 表2-1827多態(tài)位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率在不同品種中的分布
[0047]
[004引
[0049] 3.2PTHLH 5/調(diào)控區(qū)-1827(4〉6)、-165(01')位點(diǎn)多態(tài)性分析及其與生產(chǎn)性能的關(guān) 聯(lián)分析
[00加]3.2.1隱性白洛克中口1^口15/調(diào)控區(qū)-1827(4〉6)、-165(01)位點(diǎn)多態(tài)性與生產(chǎn)性 能的關(guān)聯(lián)分析
[0化。在550只隱性白洛克群體，分析PTOLH 5/調(diào)控區(qū)-1827、-165位點(diǎn)對(duì)開產(chǎn)日齡 (AFE)、32周產(chǎn)蛋數(shù)化32)及48周產(chǎn)蛋數(shù)化48)的效應(yīng)，結(jié)果48周產(chǎn)蛋數(shù)未達(dá)到顯著水平(P〉 0.05)，但是開產(chǎn)日齡與32周產(chǎn)蛋數(shù)均達(dá)到P<0.01的統(tǒng)計(jì)極顯著水平，分別為AG型和CT型的 個(gè)體開產(chǎn)較早。表明兩個(gè)突變位點(diǎn)雜合基因型均與開產(chǎn)早、32周產(chǎn)蛋高的性狀有關(guān)聯(lián)。 [0052]表4白洛克中不同基因型與開產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋數(shù)的關(guān)聯(lián)分析
[0化3]
[0054] 注:表中數(shù)值為AFE(開產(chǎn)日齡)和E32(32周產(chǎn)蛋量）的最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不 含相同字母最小二乘均值間差異極顯著(P<〇.01)。
[0055] 3.3PTHLH 5/調(diào)控區(qū)-1827和-165位點(diǎn)單倍型分析及其與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián)分析
[0056] 3.3. IPTHLH 調(diào)控區(qū)單倍型在不同品種中的分布
[0化7] 用PHASE軟件對(duì)雞PTOLH基因5/調(diào)控區(qū)-1827和-165突變位點(diǎn)構(gòu)建單倍型，只有S 種單倍型:GT、GC和AC。由表5看出，雞PWLH基因5/調(diào)控區(qū)-1827和-165突變位點(diǎn)構(gòu)建的單倍 型，其頻率在5個(gè)品種中存在差別，隱性白洛克雞、議上蘆花雞均WAC單倍型占優(yōu)勢，海蘭 褐、新楊褐和濟(jì)寧白日雞WGT單倍型占優(yōu)勢。
[005引表5PTHLH 5/調(diào)控區(qū)單倍型在不同品種中的分布
[0059:
[00側(cè) 3.3.2白洛克中PimH 5/調(diào)控區(qū)雙倍型與開產(chǎn)日齡(AFE)、產(chǎn)蛋數(shù)化32)的關(guān)聯(lián)分 析
[0061 ] 統(tǒng)計(jì)了550個(gè)有生產(chǎn)記錄的白洛克個(gè)體，對(duì)-1827和-165兩位點(diǎn)基因型構(gòu)建雙倍型 進(jìn)行聯(lián)合分析，結(jié)果(表6)顯示基因型與開產(chǎn)日齡(P = 0.0008)及32周產(chǎn)蛋數(shù)(P = 0.0002) 關(guān)系達(dá)到了極顯著水平，AC/GT對(duì)應(yīng)較小的開產(chǎn)日齡（176.46d)及較多的32周產(chǎn)蛋數(shù)(35.8 個(gè)），GT/GT和AC/AC對(duì)應(yīng)較大的開產(chǎn)日齡(約179d)及較少的32周產(chǎn)蛋數(shù)(33個(gè)）。
[0062] 表6雙倍巧與開產(chǎn)日齡及產(chǎn)蛋數(shù)的最小二乘均値及標(biāo)準(zhǔn)誤
[0063]
[0064] 注:表中數(shù)值為AFE(開產(chǎn)日齡)和E32(32W產(chǎn)蛋量）的最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不含 相同字母最小二乘均值間差異極顯著(P<〇.01)。
[0065] 實(shí)施例3雞PTHLH 5/調(diào)控區(qū)多態(tài)位點(diǎn)對(duì)基因表達(dá)的影響
[0066] 1試驗(yàn)材料
[0067] 隨機(jī)采樣泰安市臨溪村養(yǎng)殖場的高峰產(chǎn)蛋期的健康海蘭褐雞(3-5只），
[0068] 2試驗(yàn)方法
[0069] 2.1PTHLH 5/調(diào)控區(qū)多態(tài)位點(diǎn)突變型巧光素酶表達(dá)載體的構(gòu)建
[0070] 1)在隱性白洛克群體中選PTHLH 5/調(diào)控區(qū)-1827和-165位點(diǎn)分別為野生型和突變 型的個(gè)體兩只，W其DNA為模板來獲得wt-PWLH和mut-PTHLH序列，擴(kuò)增片段長度為2144bp， 引物序列同Seq ID N0.I和2。
[0071] 2)PCR 擴(kuò)增
[0072] 擴(kuò)增反應(yīng)采用高保真酶Pr imeSTAR，反應(yīng)體系（20ul)包括：2 X PrimeSTARGC Buffer lOuia.化L dNTPs(2.5mM eachJaKaRa)，加 Miel和Kpnl酶切位點(diǎn)的上下游引物各 0.5化（10山〇，化LPrimeSTA畑Spolymerase(511/化，TaKaRa)，1化基因組DNA，d地2〇補(bǔ)足至20 化。擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性4min;98°C變性10sec，60°C退火15sec，72°C延伸2min，進(jìn)行35個(gè) 循環(huán);循環(huán)結(jié)束72°C，解育5min。
[0073] PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(AxyPrep DM Gel Extraction Kit,AXYGEN)進(jìn)行回收，然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒后，酶切驗(yàn)證，選擇 陽性克隆菌液送濟(jì)南銷尚生物技術(shù)公司測序，分析突變位點(diǎn)是否分別是野生型和突變型。
[0074] 3)去內(nèi)毒素質(zhì)粒的制備
[0075] 用TIANGEN公司的化doFree Maxi Plasmid Kit去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒，按照說 明書進(jìn)行操作。
[0076] 將構(gòu)建好的wt-PWLH和mut-PTHLH載體質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌 落，進(jìn)行搖菌，用TIANGEN公司的去內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒提取雙巧光素酶表達(dá)載體質(zhì)粒， 用于原代細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。
[0077] 2.2雞卵泡膜細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0078] 1)高峰期產(chǎn)蛋海蘭褐母雞，手術(shù)刀劃開頸脈，放血處死后用滅菌剪刀創(chuàng)開腹腔，剪 下整個(gè)卵巢(注意不要將卵泡弄破），然后迅速投放至盛有3%雙抗的憐酸緩沖液的燒杯中， 封上錫錐紙后，帶入無菌間進(jìn)行分離操作。
[0079] 2)分離方法依據(jù)Gi化ert(1997)及康麗(2009)等的文獻(xiàn)進(jìn)行。
[0080] 在超凈臺(tái)上，將各級(jí)卵泡分為等級(jí)前卵泡(<12mm)和等級(jí)卵泡(〉12mm)，用眼科剪 刀從卵泡蒂處剪開取下，放至盛有3%雙抗的憐酸緩沖溶液的滅菌的平皿中，左手用眼科綴 子夾住卵泡蒂處，右手用眼科綴子順著卵泡將膜細(xì)胞層剝離下來，放入憐酸緩沖溶液中，并 沖洗兩=次，W盡量洗去膜層上殘留的血管，從而分離到純度較高的膜細(xì)胞。
[0081] 3)分離完成后，在滅菌的小燒杯中用眼科剪刀將膜細(xì)胞層充分剪碎，之后加入適 量已預(yù)熱的0.1 % II型膠原酶，放入38°C、5%C〇2培養(yǎng)箱中消化25min，每5min晃動(dòng)一次燒杯 W充分消化組織，消化后加入含有血清的M199培養(yǎng)基W終止消化。
[0082] 4)在超凈臺(tái)上用200目銅網(wǎng)將消化完畢的細(xì)胞混合液，過濾至lOOmL滅菌的燒杯 中，然后分裝到15mL離屯、管中，4000rpm離屯、8min，收集細(xì)胞沉淀，棄去濾液;每管再加適量 M199培養(yǎng)基輕輕吹打，重懸細(xì)胞沉淀，離屯、棄濾液，共=次。
[0083] 5)離屯、洗涂完后，吹勻細(xì)胞，取少量細(xì)胞懸液放入等體積的0.1 %臺(tái)吩藍(lán)，用血球 計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率應(yīng)在90% W上;按所需的細(xì)胞量接種在12孔培養(yǎng)板，每孔 細(xì)胞數(shù)1~2 X 106為宜，38.5 °C靜置培養(yǎng)，C〇2濃度為5 %。
[0084] 6)接種的細(xì)胞在12小時(shí)后進(jìn)行部分換液，24小時(shí)后可進(jìn)行全部換液。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng) 至80 % W上匯合率時(shí)，方可進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0085] 2.3質(zhì)粒0臟轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
[0086] 1)轉(zhuǎn)染前兩小時(shí)換液，更換新鮮的完全培養(yǎng)基。
[0087] 2)制備化nofection/DNA混合液（12孔板)a.每孔化曲NA質(zhì)粒+100uL無血清高糖 DMEM與1.5mL離屯、管中，輕輕混勻;b.按照每孔化LNanofection加入量，輕輕蝸旋(移液槍輕 輕吹打5~10s);C.室溫解育15min，使形成Nanofection/DNA復(fù)合體。
[0088] 3)每孔加入lOOuLNanofection/DNA復(fù)合體，輕晃培養(yǎng)板使其均勻分布。
[0089] 4)38.5°C5%(X)2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后換液，實(shí)驗(yàn)組用lOng/ml F細(xì)處理 2地，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后檢測轉(zhuǎn)染效率。
[0090] 5)陰性對(duì)照pGL3-Basic載體W相同的條件作為對(duì)照組共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞。相同的 轉(zhuǎn)染共做2次，膜細(xì)胞來自于不同的雞個(gè)體，即做了兩個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
[0091] 2.4雙巧光素酶活性測定
[0092] 用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System雙巧光素酶報(bào)告基 因檢測試劑盒，來檢測報(bào)告基因的表達(dá)水平，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行如下操作：
[0093] 1)細(xì)胞的裂解：用PBS緩沖液洗涂細(xì)胞2~3次，加入10化1 1 X化B細(xì)胞裂解液，充 分混勻，于37°C搖床15minW保證PLB裂解液充分將細(xì)胞裂解；
[0094] 2)充分裂解后，10,000~15,000 Xg離屯、3~5min，取上清用于測定；
[00M] 3)融解蛋火蟲巧光素酶和Renilla巧光素酶檢測試劑，并達(dá)到室溫。按照每個(gè)樣品 需10化1的量加入LARII試劑，反復(fù)吸打2~3次混勻。開啟巧光測定儀，開始讀數(shù)，記錄下蛋 火蟲巧光素酶的活性值Ml。
[0096] 4)然后加入lOOjil的Stop&Glo Reagent，將樣品管重新放入luminometer中，開始 讀數(shù)。記錄下Reni 1 la巧光素酶值M2。
[0097] 5)在內(nèi)參為Renilla巧光素酶的情況下，用測定得到的蛋火蟲巧光素酶化U值除W 巧憶得到的Renilla巧光素酶RLU值。根據(jù)所得的M1/M2值即為報(bào)告基因的相對(duì)表達(dá)水平。 [009引 2.5統(tǒng)計(jì)分析
[0099] 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用t檢驗(yàn)，進(jìn)行兩兩比較，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異 顯著，P<0.01為差異極顯著。
[0100] 3結(jié)果與分析
[0101] 3.1多態(tài)位點(diǎn)突變測序
[0102] 點(diǎn)突變過程的PCR擴(kuò)增使用高保真酶，有力的保證了不同等位基因間除突變位點(diǎn) 外其他序列的一致性，突變結(jié)果如圖4。
[0103] 3.2野生型和突變型報(bào)告基因的啟動(dòng)活性
[0104] 雙巧光素酶報(bào)告基因檢測結(jié)果如圖5和表7所示，F(xiàn)甜能顯著提高wt-PTHLH(AC/AC) 野生型和mut-PTHLH(GT/GT)突變型的啟動(dòng)效率(P<0.05)，mut-PTHLH(GT/GT)突變型的啟動(dòng) 效率極顯著高于wt-PTHLH(AC/AC)野生型（P<0.0001)，且mut-PTHLH(GT/GT)突變型對(duì)F甜的 應(yīng)答也極顯著高于wt-PTHLH(AC/AC)野生型(P<0.0001)。
[0105] 表7PTHL冊(cè)' 調(diào)控區(qū)不同基因型對(duì)PTHLH基因啟動(dòng)活性的影響
[0106]
[0107]綜合W上結(jié)果：
[010引通過W上5個(gè)雞品種比較，表明PTHLH基因在-1827和-165位點(diǎn)存在堿基突變，且在 不同品種中存在不同的連鎖不平衡關(guān)系，其中，隱性白洛克雞中該兩個(gè)位點(diǎn)是完全連鎖。在 白洛克雞中該兩個(gè)位點(diǎn)基因型與繁殖性狀相關(guān)，AC/GT基因型個(gè)體開產(chǎn)日齡極顯著早于GT/ GT和AC/AC基因型個(gè)體(P<0.001)，且32周產(chǎn)蛋數(shù)也極顯著多于另外兩種基因型(P<0.001)。 雙巧光素酶檢測結(jié)果表明FSH能顯著增加 GT/GT突變型和AC/AC野生型的啟動(dòng)效率（P< 0.05)，GT/GT型的啟動(dòng)效率極顯著高于AC/AC型(P<0.0001)，對(duì)F甜的應(yīng)答也極顯著高于AC/ AC型（P<0.0001)。
[0109] 由此，通過運(yùn)種標(biāo)記方法得到的AC/GT型種雞能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，在產(chǎn)蛋性 能低的地方品種中有意增加 AC/GT的頻率對(duì)提高產(chǎn)蛋量是一個(gè)有效措施，而對(duì)于開產(chǎn)較晚 的群體，運(yùn)樣的措施會(huì)使其開產(chǎn)適當(dāng)提前，從而實(shí)現(xiàn)早期選種。具體示例如下：
[0110] 白洛克雞原屬兼用型，于1937年美國著手向肉用型改良，后經(jīng)不斷改良，雞的體型 外貌與生產(chǎn)性能均有很大改變，現(xiàn)主要作肉雞配套雜交母系使用。開產(chǎn)日齡(60% W上產(chǎn)蛋 率）164~208天，其年產(chǎn)蛋數(shù)在150~160枚。表6白洛克群體的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示:GT/GT與 AC/AC型個(gè)體的平均開產(chǎn)日齡約179天，32周齡平均產(chǎn)蛋數(shù)均為33枚;AC/GT型個(gè)體的開產(chǎn)日 齡平均為176天，32周齡產(chǎn)蛋數(shù)平均為35.8枚。所W，應(yīng)選育AC/GT型雞。
[0111] 通過W上育種得到的AC/GT型能兼顧開產(chǎn)日齡和產(chǎn)蛋數(shù)，可W進(jìn)一步提高整個(gè)群 體的產(chǎn)蛋性能。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 雞PTHLH基因5'調(diào)控區(qū)兩個(gè)突變位點(diǎn)的分子標(biāo)記方法，具體標(biāo)記方法是： 采用標(biāo)記引物P-PTHLH，包括 P-PTHLH-F，其序列如Seq ID No:l所示； ?-卩1'1!1-1?，其序列如569 10吣:2所示； 擴(kuò)增雞育種材料的基因組DNA，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳并回收，經(jīng)測序得到的序 列如Seq ID如:3所示，結(jié)果檢測到存在2個(gè)突變位點(diǎn)，8卩-1827以>6)、-165(01')位點(diǎn)。2. 如權(quán)利1要求所述的標(biāo)記方法，其特征在雞育種中的應(yīng)用方法是：在開產(chǎn)晚的群體 中，選擇AC/AC純合基因型和GT/GT純合基因型的公母雞通過相互交配得到AC/GT雜合基因 型，即可以得到開產(chǎn)早、產(chǎn)蛋高的群體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106048043SQ201610544176
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月11日
【發(fā)明人】姜運(yùn)良, 郭曉莉, 張彤彤, 欒雅童, 李培釗, 辛倩, 康麗
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)