一種玉米單倍體幼胚加倍的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玉米單倍體幼胚加倍的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是一種利用雜種優(yōu)勢的模式作物，其中最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是純系選育。常規(guī)的 玉米自交系的選育需要經(jīng)過多代的自交選擇，因此選育一個品種往往需要數(shù)年的時間；而 且理論上講，即使自交n(n〇cTO)代，基因型也不能達(dá)到100%的完全純合狀態(tài)。利用孤雌 生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體并進(jìn)行人工加倍，只需兩代就可以得到100%純合的自交系，與 常規(guī)方法相比不僅大大縮短育種進(jìn)程，而且節(jié)約大量的人力、物力和財力。
[0003] 單倍體加倍常用的方法有自然加倍和化學(xué)加倍。自然加倍的頻率往往比較低，而 且易受環(huán)境和基因型的影響，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足單倍體育種技術(shù)規(guī)?；瘧?yīng)用的需求?；瘜W(xué)加倍 是目前最常用的單倍體加倍方法，加倍試劑一般是可以抑制細(xì)胞有絲分裂過程中紡錘絲的 形成，從而使復(fù)制的染色體不發(fā)生分離，形成染色體加倍的細(xì)胞。
[0004] 近年來，國內(nèi)外對加倍技術(shù)進(jìn)行了大量研究，取得了較大進(jìn)展。目前主要存在以下 缺點：（1)單倍體的加倍依然不夠高效，尤其是雄穗的加倍；（2)單倍體挑選依賴于誘導(dǎo)系 的顏色，由于顏色表達(dá)是逐步積累的過程，為了能夠準(zhǔn)確的挑選，需要在較晚的發(fā)育時期挑 選，但在發(fā)育晚期胚胎已處于較高的發(fā)育階段又不利于加倍，因此需高濃度的藥劑進(jìn)行加 倍，以保證加倍效率，藥劑的處理濃度高，不僅消耗的藥劑多，而且對幼苗、處理人員身體及 環(huán)境均有傷害。因此探索一種快速、高效、低毒的玉米單倍體加倍方法對玉米育種具有重要 意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種玉米單倍體幼胚加倍的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的玉米單倍體幼胚加倍的方法包括如下步驟：將玉米單倍體幼胚在含 有濃度為〇. 5-1. 0ymol/L的甲基胺草磷的體系中進(jìn)行加倍，實現(xiàn)玉米單倍體幼胚的加倍。
[0007] 上述方法中，所述甲基胺草磷在所述體系中的濃度為0. 5ymol/L或1. 0ymol/L。
[0008] 上述方法中，所述含有濃度為0. 5-1. 0ymol/L的甲基胺草磷的體系為含有甲基 胺草磷的MS培養(yǎng)基；
[0009] 所述含有甲基胺草磷的MS培養(yǎng)基按照如下方法制備：將甲基胺草磷、MS鹽、蔗糖、 吐溫80、二甲基亞砜和水混勻，得到含有甲基胺草磷的MS培養(yǎng)基；
[0010] 所述MS鹽在所述含有甲基胺草磷的MS培養(yǎng)基中的濃度為3.Og/L;
[0011] 所述蔗糖在所述含有甲基胺草磷的MS培養(yǎng)基中的濃度為30g/L;
[0012] 所述吐溫80在所述含有甲基胺草磷的MS培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1% ;
[0013] 所述二甲基亞砜在所述含有甲基胺草磷的MS培養(yǎng)基中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %。
[0014] 上述方法中，所述玉米幼胚的長為2. 0-3. 0mm。
[0015] 上述方法中，所述加倍的方式為將玉米單倍體幼胚放至甲基胺草磷的體系上培 養(yǎng)。
[0016] 上述方法中，所述培養(yǎng)的條件為28 °C黑暗培養(yǎng)72h。
[0017] 上述方法中，所述玉米單倍體幼胚按照如下方法獲得：
[0018] (1)用玉米單倍體誘導(dǎo)系作為父本和母本雜交，得到雜交子代；
[0019] (2)從所述雜交子代的幼胚中選取玉米單倍體幼胚。
[0020] 上述方法中，所述母本為鄭單958 ;所述父本為熒光誘導(dǎo)系CAUyfp。
[0021] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述方法的新用途。
[0022] 本發(fā)明提供了上述方法在培育玉米單倍體加倍植株中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明還提供了上述方法在提高玉米單倍體加倍植株的雄穗散粉率中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明將單倍體誘導(dǎo)系授粉12天后得到的玉米幼胚轉(zhuǎn)移至含有加倍藥劑（甲 基胺草磷）的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行加倍處理，培養(yǎng)，得到單倍體植株。通過實驗證明：濃度為 0. 5-1. 0ymol/L的甲基胺草磷處理單倍體幼胚，可以顯著地提高玉米單倍體的加倍效率， 雄穗散粉率近30 %，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于本實驗中作為對照的處理方法或自然恢復(fù)的雄穗散粉率（一 般為5%以下），實現(xiàn)了不依賴于顏色挑選的玉米單倍體的早期加倍。由于早期胚胎分化處 于較早的階段，結(jié)合莖尖分生組織分化發(fā)育的一般規(guī)律，相比于晚期加倍，在早期每加倍一 個單倍體細(xì)胞，則可能分化為更大的二倍體組織，有助于開發(fā)低濃度的加倍處理方法，不僅 可節(jié)約藥品，減少環(huán)境污染，而且大大節(jié)約時間，有助于實現(xiàn)周年多輪生產(chǎn)，另外本發(fā)明的 方法對環(huán)境污染及幼苗傷害都較小，植株生長較好，為解決單倍體育種過程中自然加倍效 率低、秋水仙素加倍毒性大等技術(shù)難題提供了一個可行的方案，使單倍體育種技術(shù)的大規(guī) 模應(yīng)用途徑更加多樣化。
【具體實施方式】
[0025] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0026] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0027] 1、玉米材料的準(zhǔn)備
[0028] 2013年5月中旬于北京上莊中國農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗基地種植鄭單958(共十行）， 作為母本材料；種植焚光誘導(dǎo)系CAUYFP兩行，作為父本材料。其中，玉米（Zeamays L.)雜交種鄭單958是北京思農(nóng)種業(yè)有限公司的產(chǎn)品，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：GB4404. 1-2008 ; 焚光誘導(dǎo)系CAUYFP在文獻(xiàn)"ZhaoX，XuX，etal.Fertilizationanduniparental chromosomeeliminationduringcrosseswithmaizehaploidinducers[J].Plant physiology, 2013, 163(2) : 721-731. "中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。
[0029] 2、組織培養(yǎng)材料的準(zhǔn)備
[0030] MS培養(yǎng)基的制備方法：每升MS培養(yǎng)基中含有MS鹽（MS鹽是上海宇涵生物科技有 限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號140225) 3. 0g，蔗糖30g，待溶解后定容至1L，調(diào)節(jié)pH值至5. 8， 倒入三角瓶中，加7. 5g瓊脂。
[0031] 含加倍藥劑的MS培養(yǎng)基的制備方法：向MS培養(yǎng)基中添加適量的加倍藥劑及助劑 (吐溫和二甲基亞砜），混勻，得到含加倍藥劑的MS培養(yǎng)基。其中，加倍藥劑：甲基胺草磷 (APM)是sigma公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為Sigma03992 ;吐溫80 :單獨滅菌后加入或直接加 入培養(yǎng)基滅菌均可；二甲基亞砜（DMS0):過濾除菌后加入。
[0032] 實施例1、玉米單倍體幼胚加倍的方法
[0033] ( -）從成苗率篩選玉米單倍體幼胚加倍的最佳加倍試劑濃度
[0034] 一、雜交子代幼胚的獲得
[0035] 1、雜交
[0036] (1)雜交親本
[0037] 以鄭單958為母本，熒光誘導(dǎo)系CAUYFP為父本，雜交，得到雜交子代。
[0038] (2)雜交具體方法
[0039] 待母本花絲吐出之前，對其進(jìn)行去雄、雌穗套袋處理；花絲吐出后，同一時間剪花 絲，第二天統(tǒng)一授粉，授粉后12天左右，得到胚長為2. 0-3. 0_的雜交子代；
[0040] 同時將鄭單958自交1代作為熒光觀察的對照子代。
[0041] 2、擬單倍體幼胚的獲得
[0042] 取胚長為2. 0-3. 0_的雜交子代和對照子代的幼穗，第二天剝胚（幼穗取回后可 暫放于4°C，但不宜太久）。具體步驟如下：將干凈無蟲害的幼穗去除苞葉，摘去花絲，75% 酒精短暫消毒后放入超凈工作臺。置于事先準(zhǔn)備好的次氯酸鈉溶液（利用滅菌去離子水配 制2 %次氯酸鈉溶液，滴加兩滴吐溫80)中進(jìn)行表面消毒20min。期間將玉米攪動2-3次， 消毒更徹底。消毒完成后拿出，放置片刻，控水后即可開始剝胚，得到雜交子代幼胚和對照 子代幼胚，所剝?nèi)〉挠衩子着?，具有一片較大的子葉，即盾片，呈弧形隆起；近軸側(cè)，面平，有 較小的胚體，由胚芽、胚軸、胚根組成。
[0043] 雜交子代中有雜合二倍體形式也有單倍體形式。
[0044] 將雜交子代幼胚和對照子代幼胚整齊擺放于MS培養(yǎng)基上，注意胚面朝下，緊貼MS 培養(yǎng)基。每個培養(yǎng)皿放7x7或者8x8方陣，便于逐個進(jìn)行熒光觀察，選取擬單倍體幼胚，并 做標(biāo)記。
[0045] 擬單倍體幼胚的篩選方法如下：利用體式熒光顯微鏡（OLYMPUSDP72)(目鏡1. 0 倍，分辨率1360x1024,ISO(相機感光度）定為200,曝光時間100ms;曝光和ISO參數(shù)可根 據(jù)實際情況調(diào)高，以能夠明顯區(qū)分對照和雜合二倍體為準(zhǔn)）觀察幼胚熒光信號強弱并參考 對照子代幼胚的熒光值，將二者區(qū)分：雜合二倍體幼胚的熒光強度明顯高于對照子代的幼 胚的熒光強度，而單倍體幼胚和對照子代的幼胚的熒光強度相近，均明顯低于雜合二倍體 幼胚的熒光強度。
[0046] 二、不同濃度的加倍藥劑（APM)處理
[0047] 將雜合二倍體幼胚和挑選出的擬單倍體幼胚分別轉(zhuǎn)移至含有加倍藥劑的MS培養(yǎng) 基上，胚面朝下緊貼培養(yǎng)基，28°C黑暗處理72h，得到處理后的幼胚。不同處理組的培養(yǎng)基成 分如下所示：
[0048] (1)處理組1的含有加倍藥劑的MS培養(yǎng)基：3.Og/LMS鹽、30g/L蔗糖、7. 5g/L瓊 脂、0.2ymol/L加倍藥劑（APM)、2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲基亞砜、0? 1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）吐溫80 ;
[0049] (2)處理組2的含有加倍藥劑的MS培養(yǎng)基：3. 0g/LMS鹽、30g/L蔗糖、7. 5g/L瓊 脂、0.5ymol/L加倍藥劑（APM)、2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲基亞砜、0? 1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）吐溫80 ;
[0050] (3)處理組3的含有加倍藥劑的MS培養(yǎng)基：3. 0g/LMS鹽、30g/L蔗糖、7. 5g/L瓊 脂、1.0ymol/L加倍藥劑（APM)、2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲基亞砜、0? 1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）吐溫80 ;
[0051] (4)處理組4的含有加倍藥劑的MS培養(yǎng)基：3. 0g/L MS鹽、30g/L蔗糖、7. 5g/L瓊 脂、2.5ymol/L加倍藥劑（APM)、2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲基亞砜、0? 1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）吐溫80 ;
[0052] (5)處理組5的含有加倍藥劑的MS培養(yǎng)基：3.Og/LMS鹽、30g/L蔗糖、7. 5g/L瓊 脂、5.0ymol/L加倍藥劑（APM)、2% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）二甲基亞砜、0? 1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）吐溫80 ;
[0053] (6)對照組的培養(yǎng)基：3.Og/LMS鹽、30