一種植物單倍體加倍方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種植物單倍體加倍方法，包括將處理過的植物單倍體幼芽用質量百分比為0.02％?0.05％的秋水仙素配以2％的二甲基亞砜的混合液浸泡單倍體幼芽的胚根部分,處理時間為18?36h，溫度為14?18℃。本發(fā)明提供的單倍體加倍方法，解決了單倍體育種中加倍率低的技術難題，且操作簡單，對人和環(huán)境安全性更高，將有效地推進單倍體育種的規(guī)?；M程。
【專利說明】
-種植物單倍體加倍方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明設及生物技術領域，尤其設及一種植物單倍體加倍方法。
【背景技術】
[0002] 隨著人口的增加和經(jīng)濟的發(fā)展，玉米的需求量不斷上漲。耕地面積減少和環(huán)境的 惡化使人們對高產(chǎn)、優(yōu)質、抗逆性強的玉米新品種需求日益迫切。而目前用常規(guī)育種方法獲 得高配合力的純合自交系需耗費大量的人力和時間。常規(guī)的育種技術已經(jīng)越來越不能滿足 人們的育種需求。近年來，單倍體育種技術、基因工程育種、分子標記輔助育種等生物技術 手段的發(fā)展提高了育種效率，開辟了玉米育種的新途徑。
[0003] 單倍體技術在玉米育種上應用具有如下優(yōu)點：快速獲得純系；在單倍體中能簡化 基因互作，去掉超顯性效應，保留有利的加性和加性上位效應;還可淘汰有害的、致死和半 致死的隱性基因。但是，單倍體育種技術也存在缺點，那就是玉米單倍體育種中加倍率低， 而且操作往往比較復雜，無法實現(xiàn)玉米單倍體育種的規(guī)?；?br>
【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種能夠提高玉米單倍體 育種中加倍率的方法。
[0005] -種植物單倍體加倍方法，包括將處理過的植物單倍體幼芽用質量百分比為 0.02%-0.05%的秋水仙素配W2%的二甲基亞諷的混合液浸泡單倍體幼芽的胚根部分，處 理時間為18-3化，溫度為14-18 °C。
[0006] 進一步地，如上所述的方法，處理植物單倍體的方法包括
[0007] 1)將玉米單倍巧粒消毒后置于細沙中26-30°C保濕催芽；
[000引2)待胚根長度1-1.5cm時將幼芽取出，置于一定溫度下保濕暗培養(yǎng)8-12h;
[0009] 3)取出幼芽，先切除胚根尖端l-2mm，再沿胚根縱切一個l-2mm小口。
[0010] 進一步地，如上所述的方法，步驟2)中所述一定溫度為4°C。
[0011] 進一步地，如上所述的方法，在經(jīng)秋水仙素處理的幼芽后，包括：幼芽取出用流水 沖洗40-60min，移栽入培養(yǎng)皿中，進行智能溫室培養(yǎng)，待幼苗長至3葉一忍時移栽至大田。
[0012] 進一步地，如上所述的方法，所述智能溫室培養(yǎng)包括:培養(yǎng)溫度為26 °C，光培養(yǎng)化 或者暗培養(yǎng)16小時。
[0013] 進一步地，如上所述的方法，所述植物單倍體為蔬菜、花弁的單倍體。
[0014] 進一步地，如上所述的方法，所述植物單倍體為玉米的單倍體。
[0015] 有益效果：
[0016] 本發(fā)明提供的適用于玉米的單倍體加倍方法，此方法解決了玉米單倍體育種中加 倍率低的技術難題，且操作簡單，對人和環(huán)境安全性更高，將有效地推進玉米單倍體育種的 規(guī)模化進程。
【具體實施方式】
[0017]為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面本發(fā)明中的技術方案進行清 楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[001引實施例1:
[0019] 本實施例提供了一種玉米單倍體加倍方法，包括W下步驟：
[0020] 1)將玉米單倍巧粒消毒后置于細沙中26-30°C保濕催芽；
[0021] 2)待胚根長度1-1.5cm時將幼芽取出，置于4°C保濕暗培養(yǎng)8-12h;
[0022] 玉米根尖長度在1-1.5cm時其有絲分裂處于最活躍的時期，小于1cm或者大于 1.5cm的根也可W使用，但是效果次之。因此本實施例選擇胚根長度為1-1.5cm。
[0023] 該步驟的主要作用是降低玉米根尖細胞分裂速度，讓大部分細胞處于有絲分裂中 期，便于后面秋水仙素處理時能得到更多二倍體細胞，提高加倍率。
[0024] 4°C對玉米胚根生長、分生區(qū)有絲分裂屬于臨界溫度。低于4度，根尖產(chǎn)生嚴重冷 害，出現(xiàn)嚴重老化、發(fā)黃、死亡;高于4°C，根尖分生區(qū)細胞分裂仍會正常進行，很難達到多數(shù) 細胞處于同一分裂時期的狀態(tài)。顯微觀察結果表明，4°C處理8-12小時后，處于同一分裂相 (有絲分裂中期）的細胞比例在25%-38%，溫度高于4°C，處于有絲分裂中期的細胞比例最 多在11%，因此，本實施例選擇處理的條件為4°C保濕暗培養(yǎng)8-12h。
[0025] 3)取出幼芽，先切除胚根尖端l-2mm，再沿胚根縱切一個l-2mm小口；
[0026] 4)將上述處理好的單倍體幼芽放入1.5ml離屯、管中，用質量百分比為0.02%- 0.05%的秋水仙素配W2%的二甲基亞諷的混合液浸泡單倍體幼芽的胚根部分，處理時間 為18-3化，溫度為14-18 °C;
[0027] 1.5ml離屯、管大小正好能放入一粒玉米種子，其底端為圓錐形，去掉底部可讓發(fā)芽 的玉米種子根伸出離屯、管，便于將離屯、管固定后藥劑只浸泡根部而不會影響種子。
[0028] 本發(fā)明首先考慮的是怎樣在低濃度秋水仙素的處理下提高玉米單倍體加倍率。在 低于前人處理濃度(0.06 %)下，通過延長浸泡處理時間、降低浸泡時溫度，一方面降低秋水 仙素對人體、單倍體苗及環(huán)境的危害，另一方面讓加倍率與自然加倍比有顯著提高。運是一 個有機的整體，低處理濃度、長時間處理、偏低的處理溫度缺一不可。
[0029] 秋水仙素濃度:前人研究絕大部分秋水仙素使用濃度(質量百分比）均在0.06%- 0.08%，對單倍體種子(或苗、根、莖尖)傷害、對人和環(huán)境的潛在威脅較大。秋水仙素濃度低 于0.02%時，對玉米胚根無損傷，但加倍率最多也只有12%，與自然加倍效果無顯著差異； 秋水仙素大于0.05%時，對胚根的影響主要集中在后期生長上，大量出現(xiàn)根腫、褐化、生長 緩慢等情況，導致死苗、崎形苗、弱苗比例上升。
[0030] 浸泡處理時間：運里的時間是在秋水先素濃度在0.02%-0.05%濃度下的。低于18 小時，加倍效率與自然加倍差異不顯著；高于36小時，對玉米根系生長影響顯著，降低移栽 成活率。
[0031] 浸泡溫度:溫度低于14度，根尖細胞分裂活動緩慢，加倍率與自然加倍無顯著差 異；14-18度之間的溫度，玉米根尖細胞分裂穩(wěn)定，在處理18-36小時的時間內移栽成活率最 高，苗子崎形率最低;溫度高于18度，根尖細胞分裂速度較快，處理時間短加倍效果不顯著， 如果處理時間長，后移栽后容易產(chǎn)生崎形苗。
[0032] 5)將經(jīng)秋水仙素處理的幼芽取出用流水沖洗40-60min，移栽入專用營養(yǎng)杯中 優(yōu)質生物有機質和礦物質等組成的材料為栽培介質，通過腐熟殺蟲殺菌等前期處理，添加 賠石等輔助材料），置于智能溫室培養(yǎng)（1化暗培養(yǎng)，她光照培養(yǎng)），注意保持營養(yǎng)盤濕度，待 幼苗長至3葉一忍時移栽至大田。
[0033] 本發(fā)明不僅可用于單倍體苗的栽培，還用于園藝、蔬菜、花弁領域。
[0034] 實施例2:
[0035] 1)玉米單倍體種子發(fā)芽:將單倍體種子消毒后置于蒸饋水中浸泡10小時;將浸泡 后的種子均勻地插入濕度75%左右的裝滿沙子的發(fā)芽盤中（沙盤厚度lOcmW上），鋪上濕毛 巾，放置在26 Γ的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2天，并及時補充水分。
[0036] 胚根頂端切除：待玉米單倍體胚根長至1.5cm左右時，切除玉米單倍體幼芽胚根頂 端1 -2mm,再沿胚根方向縱切1 -2mm。
[0037] 2)秋水仙素溶液配制：分別配制3種不同濃度（質量百分比）的秋水仙素溶液： 0.02 %秋水仙素巧％二甲基亞諷;0.04 %秋水仙素+2 %二甲基亞諷;0.049 %秋水仙素+2 % 二甲基亞諷;0.05%秋水仙素+2%二甲基亞諷；
[0038] 3)幼芽浸泡:步驟1)處理的幼芽胚根向下放入加入300ul步驟2所述不同濃度秋水 仙素溶液的1.5m 1離屯、管中，使幼芽的胚根部分浸泡在溶液中，而種子不接觸秋水仙素溶 液。整個操作過程在10-24°C進行，浸泡時間在12-3化。
[0039] 4)將幼芽從離屯、管中取出，放進發(fā)芽盒，并立即用清水沖洗，隨后將廢棄的秋水仙 素溶液倒進固定的廢液桶中并處理。清水沖洗時間40-60min。
[0040] 5)將幼芽移栽在入裝有營養(yǎng)±的營養(yǎng)杯中，放置在智能溫室中培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為 26°C，光培養(yǎng)化，暗培養(yǎng)16小時。注意保持營養(yǎng)±濕度。待幼苗長至2-3葉時候，移栽入大田。 田間管理水平略高于普通大田。
[0041 ] 實施例3:
[0042] 該方法為目前最常見的方法一一萌動種子處理法
[0043] 秋水仙素濃度:0.06%、0.08%、0.1%
[0044] 單倍體種子發(fā)芽:將單倍體種子消毒后于蒸饋水中浸泡lOh;將種子均勻地擺放在 鋪有濕毛巾的發(fā)芽盤中，放置在26°C的適宜環(huán)境中暗光培養(yǎng)24h左右，待胚根破口后取出。
[0045] 處理:將露白（胚根破口）的種子胚面向下置于發(fā)芽盤中，再加入適量上述不同濃 度的秋水仙素溶液，W剛好淹沒種子胚面為準。處理時間分別為4h、8小時、12小時。處理溫 度為常溫(22度左右）。
[0046] 處理后的種子用流水沖洗40min左右，播于營養(yǎng)鉢中，待3葉時期移入大田。管理上 略高于普通水平。
[0047] 對照組試驗2:(自然加倍法）
[004引將單倍體種子催芽后直接播于營養(yǎng)鉢中，待3葉時期移入大田。管理上略高于普通 水平。
[0049] 結果如下表；
[0050] 表1不同秋水仙素濃度處理后單倍體苗崎形率(每處理W50苗統(tǒng)計，無死亡株）
[0化1 ]
L0056J 根據(jù)表1-表3發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明所提供的玉米單倍體加倍技術能顯著降低秋水仙素對 玉米幼芽的毒害，致崎率平均在15%左右(對照平均50%);顯著地提高玉米單倍體的加倍 率，雄穗散粉率最高可達34%，遠高于對照（自然加倍，平均在5-10%)，且降低了秋水仙素 使用濃度一半。此方法解決了玉米單倍體育種中加倍率低的技術難題，且操作簡單，對人和 環(huán)境安全性更高，將有效地推進玉米單倍體育種的規(guī)模化進程。
[0057]最后應說明的是：W上實施例僅用W說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制;盡管 參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可 W對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換； 而運些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的精神和 范圍。
【主權項】
1. 一種植物單倍體加倍方法，其特征在于，包括將處理過的植物單倍體幼芽用質量百 分比為O . 02 % -0.05 %的秋水仙素配以2 %的二甲基亞砜的混合液浸泡單倍體幼芽的胚根 部分，處理時間為18-36h，溫度為14-18°C。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，處理植物單倍體的方法包括 1) 將玉米單倍籽粒消毒后置于細沙中26-30°C保濕催芽； 2) 待胚根長度1-1.5cm時將幼芽取出，置于一定溫度下保濕暗培養(yǎng)8-12h; 3) 取出幼芽，先切除胚根尖端l_2mm，再沿胚根縱切一個l-2mm小口。3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述一定溫度為4°C。4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，在經(jīng)秋水仙素處理的幼芽后，包括:幼芽取 出用流水沖洗40-60min，移栽入培養(yǎng)皿中，進行智能溫室培養(yǎng)，待幼苗長至3葉一芯時移栽 至大田。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述智能溫室培養(yǎng)包括:培養(yǎng)溫度為26°C， 光培養(yǎng)8h、暗培養(yǎng)16小時交替進行。6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物單倍體為蔬菜、花卉的單倍體。7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物單倍體為玉米的單倍體。
【文檔編號】A01H1/08GK105918116SQ201610327715
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】宋軍, 杜文平, 余桂容, 陳謙, 徐利遠, 林楊
【申請人】四川省農業(yè)科學院生物技術核技術研究所