一種玉米育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及玉米栽培領(lǐng)域，具體涉及一種玉米育種方法。
【背景技術(shù)】
[0002]玉米(Zea mays L.)，學(xué)名玉蜀黍，是重要的糧食作物，也是重要的飼料和工業(yè)原料，在國(guó)民生計(jì)和經(jīng)濟(jì)建設(shè)中起著至關(guān)重要的作用。世界范圍內(nèi)玉米蟲害約350種，其中以蛀莖性和食葉性的鱗翅目害蟲玉米螟分布最為廣泛，危害最重，是世界性的重要玉米蟲害，嚴(yán)重影響著玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。世界上每年因?yàn)橛衩酌：υ斐?0%以上的減產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)損失，大發(fā)生年甚至絕收。因此有效地防治蟲害對(duì)玉米生產(chǎn)具有重要的意義。玉米材料中缺乏有效的天然抗性基因，很難利用傳統(tǒng)的育種技術(shù)手段篩選得到具有優(yōu)良抗蟲性的玉米材料，傳統(tǒng)的害蟲防治措施主要為化學(xué)防治，但是化學(xué)農(nóng)藥具有成本高、環(huán)境污染、易殘留、會(huì)毒害有益昆蟲和害蟲天敵等弊端不適宜長(zhǎng)期使用。
[0003]植物基因工程的興起與發(fā)展，為玉米病蟲害的防治提供了一條嶄新的思路。利用基因工程手段培育抗蟲新品種具有不污染環(huán)境、對(duì)害蟲的殺蟲性具有專一性、育種周期短、育種和栽培成本低等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)在應(yīng)用基因工程手段培育的抗蟲材料數(shù)量直線上升，幾乎涵蓋了所有的重要農(nóng)作物。在眾多的抗蟲基因中，Bt殺蟲蛋白基因是一類作用機(jī)理研究比較清楚，市場(chǎng)應(yīng)用最廣泛和最有潛力的殺蟲蛋白。自從1993世界上第一例成功的轉(zhuǎn)crylAb基因抗蟲玉米出現(xiàn)，抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米發(fā)展迅速，直到1996年，表達(dá)cryIAb基因的轉(zhuǎn)Bt基因玉米被批準(zhǔn)商業(yè)應(yīng)用于控制歐洲玉米螟危害。隨后，攜帶來(lái)自于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米越來(lái)越多地被用來(lái)控制玉米生產(chǎn)中主要的鱗翅目害蟲。具有CrylAb蛋白表達(dá)的玉米種質(zhì)用來(lái)進(jìn)行玉米的雜交已經(jīng)被證明是一個(gè)可以減少農(nóng)藥使用，并減少對(duì)環(huán)境和人類潛在危害的有效管理措施。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種玉米育種方法，所得植株具有優(yōu)良的抗蟲性、抗草性、抗病性以及耐旱性能。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0006]一種玉米育種方法，包括如下步驟:
[0007]S1、準(zhǔn)確稱取1mg金粉微載體置于1.5ml離心管中，加入1.5ml乙醇，渦旋振蕩3_5min，靜置15min后，1000rmp離心lmin，棄掉上清液；
[0008]S2、往步驟SI所得的溶液中加入Iml無(wú)菌去離子水，充分渦旋振蕩3min ;靜置3min后，6000rmp離心30S，棄掉上清；
[0009]S3、重復(fù)步驟S23次后，加入0.25ml50%的滅菌甘油，并充分懸浮，得微載體甘油溶液；
[0010]S4、將步驟S3所得的微載體甘油溶液加入5ul質(zhì)粒，50ul的2.5mol/LCaCl2, 20ul的0.lmol/L亞精胺，持續(xù)震動(dòng)3min，然后離心2S，棄上清，在得到的沉淀中加入140ul70%乙醇，離心棄上清，在得到的沉淀中加入140ul 100%乙醇，離心棄上清，在得到的沉淀中加入500ul 100%乙醇，輕輕震蕩關(guān)閉后在低速渦旋振蕩器中渦旋3s，得微載體；
[0011]S5、將BT殺蟲毒蛋白基因DNA質(zhì)粒、bar基因DNA質(zhì)粒、玉米矮花葉病毒外殼蛋白基因MDMVCPDNA質(zhì)粒包被在步驟S4所得的微載體內(nèi)；
[0012]S6、取按常規(guī)方法培養(yǎng)所得的胚性玉米愈傷組織，用基因槍對(duì)其進(jìn)行轟擊后，置于分化培養(yǎng)基上避光恢復(fù)培養(yǎng)一天，光照下培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)移至1/2MS+IBA4.8mg/L+NAA0.04mg/L培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；
[0013]S8、至抗性芽生長(zhǎng)至Icm以上后，將其移入生根培養(yǎng)基:
[0014]改良MS+0.04mg/L NAA+0.75mg/L6-BA+0.075mg/L IBA+35g/L 蔗糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，幼苗生長(zhǎng)至根系發(fā)達(dá)、莖葉健壯后將其移入溫室中培育，直至結(jié)種，所述改良MS包括營(yíng)養(yǎng)元素和有機(jī)物，所述營(yíng)養(yǎng)元素包括蛋氨酸錳10mg/L、，一水硫酸鋅5mg/L、一水硫酸亞鐵17mg/L、氨基酸螯合鎂5mg/L、砸蛋氨酸5.5mg/L、植酸酶0.75mg/L、堿式硫酸銅4.5mg/L、[!比啶酸絡(luò)0.065mg/L、碘酸|丐0.3mg/L、賴氨酸6mg/L、三氯化六氨合鈷0.065mg/L、蛋白鍺0.75mg/L、碘酵母6mg/L ;所述有機(jī)物包括鹽酸硫胺素10mg/L、鹽酸卩比卩多醇3mg/L、肌醇35mg/L、環(huán)己六醇 27mg/L ；
[0015]S9、將 0.1 份 MnS04 粉末、0.05 份 CuS04 粉末、0.1 份 ZnS04 粉末、0.2 份 NiS04 粉末、0.2份(NH4) 6Mo7024.4H20粉末和適量的EDTA (防止沉淀生成)，離子水300?400mL混合均勻，制備浸泡液，并用此浸泡液浸漬步驟S8所得的種子12h ;
[0016]S10、整地松土，將步驟S9所得的種子進(jìn)行播種，土壤質(zhì)地選擇滴管帶的滴頭流量；播種完成后，避開(kāi)天氣過(guò)程后統(tǒng)一滴出苗水，灌水量以兩條滴灌帶濕潤(rùn)鋒交匯為宜；
[0017]S11、出苗后，隨水滴罐抗旱營(yíng)養(yǎng)劑，所述抗旱營(yíng)養(yǎng)劑由以下重量百分比濃度的組分構(gòu)成:水楊酸12.21ppm，阿魏酸22.3ppm，香草酸21.7ppm，槲皮素12.0ppm,木犀草素12.0ppm，硅酸鉀184.8ppm，磷酸二氫鉀1.38%，尿素1.7%，硫酸鋅0.55%，余量水。
[0018]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0019]本發(fā)明通過(guò)基因槍法將BT殺蟲毒蛋白基因、bar基因、玉米矮花葉病毒外殼蛋白基因MDMVCPDNA導(dǎo)入胚性玉米愈傷組織中，從而獲得了具有優(yōu)良的抗蟲性、抗草性、抗病性以及耐旱性能的種子，通過(guò)浸種液的浸種處理，從而促進(jìn)了種子的萌發(fā)，提高了幼苗的呼吸速率及根活力，增強(qiáng)了種子及幼苗的抗逆能力，通過(guò)抗旱營(yíng)養(yǎng)劑的滴罐，利用酚酸類具有抗氧化性物質(zhì)，可以提高植物中保護(hù)酶的數(shù)量和活性，又提高了多酚物質(zhì)的含量，提高作物中抗氧化物質(zhì)含量，增強(qiáng)了作物的抗旱性；同時(shí)，植株中酚類抗氧化物質(zhì)含量的提高可以增加作物抗病、抗UV輻射等；在酚酸類物質(zhì)中添加了磷酸二氫鉀、氮素，增加了作物的營(yíng)養(yǎng)元素供應(yīng)，促進(jìn)了作物的生長(zhǎng)，提高了作物的抗逆性。
【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明實(shí)施例提供了一種玉米育種方法，包括如下步驟:
[0022]S1、準(zhǔn)確稱取1mg金粉微載體置于1.5ml離心管中，加入1.5ml乙醇，渦旋振蕩3min，靜置15min后，1000rmp離心lmin，棄掉上清液；
[0023]S2、往步驟SI所得的溶液中加入Iml無(wú)菌去離子水，充分渦旋振蕩3min ;靜置3min后，6000rmp離心30S，棄掉上清；
[0024]S3、重復(fù)步驟S23次后，加入0.25ml50%的滅菌甘油，并充分懸浮，得微載體甘油溶液；
[0025]S4、將步驟S3所得的微載體甘油溶液加入5ul質(zhì)粒，50ul的2.5mol/LCaCl2, 20ul的0.lmol/L亞精胺，持續(xù)震動(dòng)3min，然后離心2S，棄上清