4,圖6C所示），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化合物13為化合物12生成化合 物14過程的中間產(chǎn)物（圖6A)。
[0111]Fluostatins生物合成基因fls02在大腸桿菌中獲得了可溶性表達(dá)（圖她），經(jīng)過 生化反應(yīng)鑒定Fls02為結(jié)合黃素的聚酬加氧酶，能WNAD(P)H為輔因子，催化化合物12進(jìn) 行C-4a，1化脫徑基反應(yīng)及C-12位加徑基反應(yīng)，形成化合物13,化合物13再通過自發(fā)氧化， 最終形成dehy化or油elomycin(化合物14,圖6C)。
[0112] W下進(jìn)一步提供實(shí)施例，運(yùn)些實(shí)施實(shí)例有助于理解本發(fā)明，僅用作說明而不限制 本發(fā)明的應(yīng)用范圍。
[0113] 實(shí)施例1 :Fluostatins及其相關(guān)化合物產(chǎn)生菌小單抱菌SCSI0 N160基因組DNA 的提取
[0114] 將新鮮小單抱菌SCSI0N160的菌絲體按照5 %的接種量接種于50血的1#培養(yǎng) 基（淀粉lOg，酵母粉4g，細(xì)菌學(xué)蛋白腺2g，海鹽lOg，加水定容至1L，抑7. 2-7.4)中， 28-30°C，振蕩培養(yǎng)約2-3天，400化pm離屯、10分鐘收集菌絲體。菌絲體用STE溶液（化C1 75mM，邸TA25mM，Tris-Cl20mM)洗涂?jī)纱?，向洗涂后的菌絲體中加入30血STE溶液和終 濃度3mg/mL的溶菌酶，滿旋均勻，37°C溫浴3小時(shí)，加入至終濃度0. 1-0. 2mg/mL的蛋白 酶K，混勻，37°C溫浴10分鐘，加入至終濃度1-2%的SDS，混勻，放入55°C水浴約1小時(shí)， 期間顛倒數(shù)次。加入等體積的酪-氯仿-異戊醇（V/V/V= 25:24:1)，混合均勻，置于冰 上冷卻30分鐘。1200化pm，4°C離屯、10分鐘，然后用剪過的大口徑槍頭小屯、吸取上清到新 的離屯、管中，用同樣的方法反復(fù)處理3次，然后用等體積的氯仿洗涂?jī)纱危?2000rpm，4°C離 屯、10分鐘。用剪過的大口徑槍頭將水相吸出轉(zhuǎn)移至新的離屯、管，加入1/10體積3mol/L NaAc(P冊(cè).2)，混勻后再加入等體積的異丙醇，混勻后冰上放置，沉淀DM。小屯、地用玻璃棒 將DNA纖維團(tuán)轉(zhuǎn)移至新的離屯、管中，用70%乙醇洗涂?jī)纱?，將液體傾出，在37°C下略微烘 干，加5血TE溶解，并加入3-抓的RNA酶，由此得到小單抱菌SCSI0N160基因組DNA。
[0115] 實(shí)施例2 :Fluostatins生產(chǎn)菌小單抱菌SCSI0 N160基因組文庫(kù)的建立
[0116] 首先通過一系列的稀釋實(shí)驗(yàn)來確定限制性核酸內(nèi)切酶Sau3AI的用量，在20yL 體系中，含有17yL的小單抱菌SCSI0N160基因組DNA，2yL的10X反應(yīng)緩沖液和1yL不 同稀釋度的Sau3AI，其終止反應(yīng)為4iiL0. 5mol/L邸TA和合適的上樣緩沖液。通過摸索 確定了 0. 025-0. 0抓的酶活單位比較合適。在此基礎(chǔ)上通過大量部分酶切得到30~42化 的基因組DNA片段，用去憐酸化酶進(jìn)行去憐酸化處理。
[0117] 用于構(gòu)建文庫(kù)的載體SuperCos1質(zhì)粒先用限制性核酸內(nèi)切酶甜aI從兩個(gè)cos序 列中間切開，然后進(jìn)行去憐酸化處理，再?gòu)亩嗫寺∥稽c(diǎn)處用限制性核酸內(nèi)切酶BamHI切開， 獲得兩個(gè)臂。處理后的載體與之前制備的部分酶切的30~42化的基因組DM片段連接過 夜，連接體系為10yL含有1. 25yg制備的基因組DNA片段和0. 5yg處理后的SuperCos 1質(zhì)粒，1yL的10XBuffer, 0. 3U的連接酶。連接產(chǎn)物于65°C處理15分鐘，使連接酶失 活。從-80°C冰箱中取出一管包裝混合物（50iiL)置于冰上，將包裝混合物在指間迅速融 化，小屯、吸取一半包裝混合物（25iiL)至一個(gè)新的離屯、管中，加入10iiL熱處理后的連接產(chǎn) 物，其余包裝混合物于-80°C保存。小屯、混勻，30°C溫浴90分鐘，加入另外一半包裝混合物 (25yL)，30°C溫浴繼續(xù)90分鐘。加入500yL隧菌體稀釋緩沖液（lOOmmol/L化C1，lOmmol/ LMgCl2，10mm〇l/LpH8. 3Tris-HCl)，再加入 25yL氯仿，輕輕混勻，于 4°C保存。
[0118] 將凍存于-80°C的菌株E.coliLM392MP涂布在LB培養(yǎng)基上復(fù)蘇。包裝反應(yīng)前一 天，挑取單克隆接種于LB培養(yǎng)基中（添加0. 2%麥芽糖和lOmMM拆04)，37°C振蕩培養(yǎng)過夜， 包裝反應(yīng)當(dāng)天，取5mL過夜培養(yǎng)的菌液加入到50mL新鮮的LB培養(yǎng)基中（添加0. 2 %麥芽糖 和lOmMM拆〇4)，37°C，200巧m振蕩至培養(yǎng)物ODe。。達(dá)到0. 8-1時(shí)，4°C保存?zhèn)溆谩Ｈ?00yL 如上處理的宿主菌液和100yL適度稀釋的包裝液輕輕混勻，于37°C溫浴15分鐘，然后涂布 于含有100yg/mL氨節(jié)青霉素和50yg/mL卡那霉素的LB平板上，37 °C培養(yǎng)過夜。將長(zhǎng)出來 的單個(gè)克隆子，用無菌牙簽點(diǎn)種于30塊含W上所述抗生素的LB培養(yǎng)基的96孔板上，37°C 培養(yǎng)過夜，加入終濃度為20%的甘油，混合均勻，置于-80°C保存。由此得到Fluostatins生產(chǎn)菌小單抱菌SCSI0N160基因組文庫(kù)。
[0119] 實(shí)施例3 :從fluostatins生產(chǎn)菌小單抱菌SCSI0 N160基因組文庫(kù)中篩選含有 fluostatins合成的生物基因的陽性克隆子
[0120] 將小單抱菌SCSI0N160基因組DNA送國(guó)家人類基因組南方研究中屯、進(jìn)行全基因 組掃描和注釋，根據(jù)掃描和注釋的結(jié)果，通過生物信息學(xué)分析，W位于fluostatins主體基 因簇中間的f1sG單加氧酶基因的序列設(shè)計(jì)PCR篩選引物f1sG邸和f1sGER(引物序列如 表2所示），從小單抱菌SCSI0N160的基因組文庫(kù)3072個(gè)克隆中篩選，獲得了 13個(gè)陽性 克隆，后用位于主體基因簇的上、下游基因設(shè)計(jì)PCR篩選引物：flsF簇基轉(zhuǎn)移酶基因引物 fls抑TF和fls抑TR，flsS腺巧酸基班巧酸裂解酶基因引物flsSEF和flsS邸及邊界基因 orf2~3-憐莽草酸-1-簇乙締基轉(zhuǎn)移酶基因引物0RF沈F/0RF沈R(引物序列如表2所示） 對(duì)上述所篩陽性克隆進(jìn)行復(fù)篩并結(jié)合陽性克隆酶切分析及末端測(cè)序結(jié)果，確定了其中4個(gè) cosmids在基因簇中的相對(duì)位置，而且有1個(gè)cosmid(pCSG5003)包含了整個(gè)fluostatins 生物合成基因簇，其他3個(gè)cosmid(pCSG5000、PCSG5001、PCSG5002)包含部分基因簇（圖 1)。所述的cosmid(pCSG5003)包含的插入片段的核巧酸序列如SEQIDNO. 1所示，該片段 即為fluostatins的生物合成基因簇。
[0121] 實(shí)施例4 :Fluostatins產(chǎn)生菌小單抱菌SCSI0N160遺傳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立及基因 中斷突變菌株的獲得：
[0122] fls02-聚酬加氧酶基因敲除突變菌株（Fls03)的獲得
[0123] 利用PCR-targeting的方法獲得體外敲除突變株。根據(jù)獲得的fluostatins的生 物合成基因簇序列，參照文獻(xiàn)報(bào)道的PCR-targeting系統(tǒng)，設(shè)計(jì)一對(duì)fls02基因的敲除引 物，引物序列見于表2中的fls02敲除引物fls02DF和fls02DR。然后參照PCR-targeting 的方法構(gòu)建體外敲除質(zhì)粒，之后轉(zhuǎn)入到接合轉(zhuǎn)移的供體菌中。具體步驟如下：（1)將含 有fluostatins的生物合成基因簇基因的cosmid質(zhì)粒PCSG5003轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli BW25113/pIJ790 中獲得E.coliBW25113/pIJ790/pCSG5003,用lOmmol/L的k阿拉伯糖誘 導(dǎo)A/red重組系統(tǒng)表達(dá)，并將其制備成為電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞待用。（2)用內(nèi)切酶EcoRI和 HindIII酶切質(zhì)粒PIJ773,回收其中約1. 4化含有轉(zhuǎn)移原點(diǎn)和阿泊拉霉素抗性基因的DNA 片段，W此作為PCR模板，用f1S02DTF和f1S02DTR引物通過PCR擴(kuò)增出1. 4化的PCR產(chǎn) 物，50yL的PCR反應(yīng)體系：高保真DNA聚合酶抓，lOXBufferSyLdNTPs0. 5mmol/l， DMSO2. 5yL，引物各0. 5ymol/L，DM模板約Ing，加水補(bǔ)至50yL。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變 性94°C5min;擴(kuò)增循環(huán)為94°C變性45s，60°C退火45s，72°C延伸90s，30個(gè)循環(huán)；最后72°C 延伸lOmin。將1. 4化的PCR產(chǎn)物回收純化待用。（3)將回收的1. 4化的PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)入 (1)步驟中制備的感受態(tài)細(xì)胞使其發(fā)生重組，涂布于LB篩選平板（含100yg/mL氨節(jié)青霉 素，50yg/血卡那霉素，50yg/血阿泊拉霉素）上，37°C過夜培養(yǎng)。從平板上挑出陽性單克 隆，抽提質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為PCSG5006,該質(zhì)粒中的fls02基因的部分片段被轉(zhuǎn)移原點(diǎn)和 阿泊拉霉素抗性基因取代。（4)將構(gòu)建好的重組突變質(zhì)粒PCSG5006轉(zhuǎn)化到E.COUET12567/ PUZ8002中，構(gòu)建成E.coliET12567/pUZ8002/pCSG5006,作為接合轉(zhuǎn)移的供體菌。
[0124] 野生型小單抱菌SCSI0N160菌株在改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基（淀粉20g，K2HP〇4〇. 5邑， M拆04 ? 7&0 0. 5g，F(xiàn)eS04 ? 7&0 0.Olg，KNOslg，海鹽lOg，瓊脂 18g，加水至 1L，pH7. 2)平 板中劃線培養(yǎng)10-20天，長(zhǎng)出的抱子用無菌竹簽切下IcmX2cm瓊脂塊娠碎于含1 %海鹽的 1#培養(yǎng)基（實(shí)施例1所述）中，28°C搖床，200巧m培養(yǎng)1~2天后，將含菌絲體的上清液按 5%~10%的比例再次轉(zhuǎn)接至1%海鹽的1#培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2~3天后，于4000巧m，離 屯、lOmin收集菌絲體，菌絲體用1 %海鹽的1#培養(yǎng)基洗涂2次后作為接合轉(zhuǎn)移的受體菌。 供體菌E.ColiET12567/pUZ8002/pCSG5006 在 50血含 50yg/mL卡那霉素，25yg/mL氯霉素 和50yg/mL阿泊拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37°C生長(zhǎng)至ODe。。值約為0. 8時(shí)，離屯、收集菌 體（400化pm，lOmin)，用LB清洗菌體3遍，懸浮于1mlLB培養(yǎng)基中，作為接合轉(zhuǎn)移的供體 菌。取上述受體菌400yL和供體菌200yL混合均勻