一種芳香聚酮類(lèi)非典型角環(huán)素fluostatins的生物合成基因簇及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種芳香聚酬類(lèi)非典型角環(huán)素 fluostatins的生物合成基因簇及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]Fluostatins是從一株南海稀有放線菌--小單抱菌（Micromonosporarosaria) SCSION160的培養(yǎng)物中分離到的芳香聚酬類(lèi)化合物。從該菌中能制備多種抗生素，該菌 已經(jīng)申請(qǐng)專(zhuān)利，名稱(chēng)為"一種小單抱菌及利用該菌制備多種抗生素的方法"，申請(qǐng)專(zhuān)利號(hào) 為：201210467946.X。已報(bào)道發(fā)現(xiàn)的fluostatins類(lèi)化合物主要來(lái)源于放線菌，例如最早 分離自鏈霉菌streptomycessp.TA-3391的fluostatinA,B;研究發(fā)現(xiàn)該2種化合物具 有酶抑制劑活性，其中fluostatinA還具有一定腫瘤細(xì)胞毒活性。隨后從Streptomyces StrainActa1383分到fluostatinC~E，最近的一個(gè)例子是從宏基因組文庫(kù)篩選的2個(gè) cosmids拼接成的基因簇在S.a化US中異源表達(dá)出fluostatinF~H，之后我們課題組從 MicromonosporarosariaSCSI0N160 中分到fluostatinI~K，及兩個(gè)結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物 r油elomycin,地enant虹oviridone，且地enant虹oviridone具有明顯的腫瘤細(xì)胞毒活性。 最近研究表明由fluostatins類(lèi)似物kinamycin的單體形成的二聚體化合物lomaiviticin 具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，其作用機(jī)制在于可W引起細(xì)胞中DM雙鍵斷裂。
[0003] 近十多年來(lái)發(fā)展起來(lái)的組合生物合成技術(shù)為改造復(fù)雜天然產(chǎn)物提供了新的思路 和方法。在闡明了自然界的生物合成途徑、克隆和鑒定微生物天然產(chǎn)物生物合成基因簇的 基礎(chǔ)上，采用組合生物合成技術(shù)對(duì)發(fā)現(xiàn)的生物合成基因、調(diào)控基因進(jìn)行體內(nèi)敲除、突變、置 換和重組等操作，不但能夠生產(chǎn)"非天然"的天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，而且還可W提高天然產(chǎn) 物的產(chǎn)量，或定向積累所需要的天然產(chǎn)物，為天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和藥物開(kāi)發(fā)提供分子和活性 多樣性。
[0004] 迄今為止，關(guān)于具體的fluostatins基因簇，及fluostatins類(lèi)化合物中設(shè)及到的 開(kāi)環(huán)重排機(jī)制，重氮原子的引入機(jī)制鮮有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種芳香聚酬類(lèi)非典型角環(huán)素fluostatins的生物 合成基因簇，其來(lái)源于南海稀有放線菌--小單抱菌（Micromonosporarosaria)SCSI0 N160〇
[0006] 本發(fā)明的fluostatins的生物合成基因簇，其特征在于，該生物合成基因簇的核 巧酸序列如SEQIDNO. 1的第1~40128位的堿基序列所示，包含36個(gè)基因，具體為：
[0007] (1)負(fù)責(zé)聚酬鏈骨架合成及合成過(guò)程中進(jìn)行修飾的基因，即flsD、flsE、flsC、 flsB、flsA、flsl共 6 個(gè)基因：
[0008]flsD位于基因簇核巧酸序列第6028-6978個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為951個(gè)堿基對(duì)，編碼芳 香化酶，316個(gè)氨基酸；
[0009]flsE位于基因簇核巧酸序列第7005-7787個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為783個(gè)堿基對(duì)，編碼酬 基還原酶，260個(gè)氨基酸；
[0010]flsC位于基因簇核巧酸序列第7801-8076個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為276個(gè)堿基對(duì)，編碼酷 基載體蛋白，91個(gè)氨基酸；
[0011]flsB位于基因簇核巧酸序列第8119-9357個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1239個(gè)堿基對(duì)，編碼 鏈延伸因子，412個(gè)氨基酸；
[0012] flsA位于基因簇核巧酸序列第9357-10625個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1269個(gè)堿基對(duì)，編碼 酬脂酷合成酶，422個(gè)氨基酸；
[0013]flsl位于基因簇核巧酸序列第10622-10951個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為330個(gè)堿基對(duì)，編碼 聚酬環(huán)化酶，109個(gè)氨基酸；
[0014] (2)氧化還原相關(guān)基因，即fls02、fls03、flsLflsOl、flsG、fls04、flsP、fls05 共8個(gè)基因：
[0015]fls02位于基因簇核巧酸序列第3059-4525個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1467個(gè)堿基對(duì)，編碼 聚酬加氧酶，488個(gè)氨基酸；
[0016]fls03位于基因簇核巧酸序列第4538-6031個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1494個(gè)堿基對(duì)，編碼 聚酬加氧酶，497個(gè)氨基酸；
[0017]flsL位于基因簇核巧酸序列第12350-12751個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為402個(gè)堿基對(duì)，編碼 FMN結(jié)合的氧化相關(guān)的酶，133個(gè)氨基酸；
[0018]flsOl位于基因簇核巧酸序列第12877-14370個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1494個(gè)堿基對(duì)，編 碼聚酬加氧酶，497個(gè)氨基酸；
[0019]flsG位于基因簇核巧酸序列第14412-15125個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為714個(gè)堿基對(duì)，編碼 單加氧酶，237個(gè)氨基酸；
[0020]fls04位于基因簇核巧酸序列第17957-19447個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1491個(gè)堿基對(duì)，編 碼聚酬加氧酶，496個(gè)氨基酸；
[0021]flsP位于基因簇核巧酸序列第19664-20896個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1233個(gè)堿基對(duì)，編 碼FAD依賴(lài)的氧化還原酶，410個(gè)氨基酸；
[0022] fls05位于基因簇核巧酸序列第24357-25847個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1491個(gè)堿基對(duì)，編 碼聚酬加氧酶，496個(gè)氨基酸；
[0023] (3)編碼調(diào)控子和轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因，即flsRl、flsR2、flsR3共3個(gè)基因：
[0024]flsRl位于基因簇核巧酸序列第11354-11980個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為627個(gè)堿基對(duì)，編 碼反應(yīng)調(diào)控蛋白，208個(gè)氨基酸；
[00巧]flsR2位于基因簇核巧酸序列第25894-26919個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1026個(gè)堿基對(duì)，編 碼StrR家族調(diào)控蛋白，341個(gè)氨基酸；
[0026]flsR3位于基因簇核巧酸序列第36470-37159個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為690個(gè)堿基對(duì)，編 碼反應(yīng)調(diào)控蛋白re姑3, 229個(gè)氨基酸；
[0027] (4)與氮原子引入相關(guān)的基因，即flsNl、flsN2、flsT、flsS、flsN3、flsM、flsV、 flsU2共8個(gè)基因：
[0028]flsNl位于基因簇核巧酸序列第27274-28485個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1212個(gè)堿基對(duì)，編 碼NO合酶氧化酶，403個(gè)氨基酸；
[0029]flsN2位于基因簇核巧酸序列第28492-29313個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為822個(gè)堿基對(duì)，編 碼碳氮水解酶，273個(gè)氨基酸；
[0030] f 1st位于基因簇核巧酸序列第29303-29704個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為402個(gè)堿基對(duì)，編碼 乙酷基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白，133個(gè)氨基酸；
[0031]flsS位于基因簇核巧酸序列第29701-30975個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1275個(gè)堿基對(duì)，編 碼腺巧酸基班巧酸裂解酶，424個(gè)氨基酸；
[0032]flsN3位于基因簇核巧酸序列第31223-32602個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1380個(gè)堿基對(duì)，編 碼谷氨酷胺氨基轉(zhuǎn)移酶亞基A，459個(gè)氨基酸；
[0033]flsM位于基因簇核巧酸序列第32610-34133個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1524個(gè)堿基對(duì)，編 碼谷氨酷胺合成酶，507個(gè)氨基酸；
[0034]flsV位于基因簇核巧酸序列第34196-34582個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為387個(gè)堿基對(duì)，編碼 4Fe-4S結(jié)合的鐵氧還蛋白，128個(gè)氨基酸；
[0035]flsU2位于基因簇核巧酸序列第34579-36447個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1869個(gè)堿基對(duì)，編 碼未知功能蛋白，622個(gè)氨基酸；
[0036] (5)其他后修飾基因及功能未知基因，即flsF、flsK、flsUl、flsQl、flsM、flsH、 flsQ2共7個(gè)基因：
[0037]flsF位于基因簇核巧酸序列第1498-3057個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1560個(gè)堿基對(duì)，編碼 簇基轉(zhuǎn)移酶，519個(gè)氨基酸；
[0038]flsK位于基因簇核巧酸序列第15183-15734個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為552個(gè)堿基對(duì)，編碼 未知功能蛋白，183個(gè)氨基酸；
[0039]flsUl位于基因簇核巧酸序列第15934-17037個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1104個(gè)堿基對(duì)，編 碼未知功能蛋白，367個(gè)氨基酸；
[0040]flsQl位于基因簇核巧酸序列第17119-17889個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為771個(gè)堿基對(duì)，編 碼短鏈脫氨酶家族蛋白，256個(gè)氨基酸；
[0041]flsM位于基因簇核巧酸序列第20943-21950個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1008個(gè)堿基對(duì)，編 碼氧甲基轉(zhuǎn)移酶，335個(gè)氨基酸；
[0042]flsH位于基因簇核巧酸序列第22223-23002個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為780個(gè)堿基對(duì)，編碼 水解酶，259個(gè)氨基酸；
[0043]flsQ2位于基因簇核巧酸序列第23599-24354個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為756個(gè)堿基對(duì)，編 碼短鏈脫氨酶家族蛋白，251個(gè)氨基酸；
[0044](6)在fluostatins生物合成基因簇的上下游基因，即orf(-2)、orf(-1)、orfl、 orf2共4個(gè)基因：
[0045] 0計(jì)(-2)位于基因簇核巧酸序列第1-1161個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1161個(gè)堿基對(duì)，編碼 輔酶A轉(zhuǎn)移酶III家族蛋白，386個(gè)氨基酸；
[0046] 0計(jì)(-1)位于基因簇核巧酸序列第1307-1501個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為195個(gè)堿基對(duì)，編 碼未知功能蛋白，64個(gè)氨基酸；
[0047]orfl位于基因簇核巧酸序列第37835-38107個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為273個(gè)堿基對(duì)，編碼 未知功能蛋白，90個(gè)氨基酸；
[0048] orf2位于基因簇核巧酸序列第38869-40128個(gè)堿基處，長(zhǎng)度為1260個(gè)堿基對(duì)，編 碼3-憐莽草酸-1-簇乙締基轉(zhuǎn)移酶，419個(gè)氨基酸；
[0049]SE