新型人腫瘤壞死因子受體-Fc融合基因及其產(chǎn)物蛋白的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?01010268409. 3,申請日為2010. 09. 01，發(fā)明名稱為新型人腫 瘤壞死因子受體-Fc融合基因及其產(chǎn)物蛋白的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于基因工程制藥領(lǐng)域，具體設(shè)及一種新型TNFR-Fc融合基因及其表達(dá)產(chǎn) 物。
【背景技術(shù)】 陽003] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎煙leumatoid Art虹itis，RA)是人類最常見的自身免疫性疾病之 一，患病率約1%，與人類白細(xì)胞抗原DR4/DR1明顯相關(guān)，具有一定的遺傳傾向。RA的臨床 特征多為手、足、腕、膝、臀等的關(guān)節(jié)滑膜發(fā)炎，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷?；ぱ滓鸫罅苛芗杭?xì) 胞浸潤，主要包括巨隧細(xì)胞、T淋己細(xì)胞和漿細(xì)胞，同時血管增生。關(guān)節(jié)損傷主要發(fā)生于滑 膜與軟骨和骨郵鄰處。
[0004] RA是一種W累及關(guān)節(jié)為主的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。近年來研究表明，腫瘤 壞死因子-a燈NF-a)是RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因子（FeldmannM2001;RavinderN Maini，2001;RavinderNMaini，199),其可刺激機(jī)體產(chǎn)生一系列因子，如白細(xì)胞介素 (IU-1、比-6、IL-8和粒細(xì)胞集落刺激因子等的產(chǎn)生，并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，吸引 白細(xì)胞到受累關(guān)節(jié)。TNF-a還刺激滑膜巨隧細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生 基質(zhì)金屬蛋白酶，并抑制軟骨蛋白聚糖的合成，并可導(dǎo)致滑膜炎癥和關(guān)節(jié)軟骨的損傷。阻斷 TNF-a即可在RA發(fā)病機(jī)制的上游阻斷炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療RA的目的。
[0005] 腫瘤壞死因子a(Tumor化crosisI^actorA1地日，TNFa)和淋己毒素 化ymphotoxin，LT)是通過與其共同受體TNFR75和TNFR55結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)作用的。人腫 瘤壞死因子受體75燈NFR75)由461個氨基酸組成，其N-末端235個氨基酸殘基，是TNFR75 蛋白酶水解下來的細(xì)胞膜外區(qū)片段，也稱為可溶性TNFR75 (STNFR75)。
[0006] 大量實驗證據(jù)表明可溶性TNFR75和TNFR55 (即受體的膜外部分）可W通過 與TNFa和LT的有效結(jié)合而阻斷TNFa和LT在生物體內(nèi)的生物學(xué)作用化unns-Martin Lorenz, 2002 ;smith，C.A.等（1990)，science, 248 :1019-1023)，且TNFR75 分布更廣發(fā)，親 和能力更強(qiáng)。但TNFR半衰期較短。
[0007] 人IgG類免疫球蛋白半衰期可高達(dá)21天，它們是人類血液中最豐富的蛋白質(zhì)，分 為IgA、IgG、IgM、I姐和I曲，其中IgG有IgGl、IgG2、IgG3 和IgG4 四個亞型。IgGlFc段由 232個氨基酸殘基組成，包括較鏈區(qū)、C肥區(qū)和C冊區(qū)。已有報道說將IgG的Fc絞鏈區(qū)中的 半脫氨酸殘基與其他蛋白質(zhì)（如各種細(xì)胞因子和可溶性受體）結(jié)合而形成融合蛋白，使蛋 白質(zhì)類似于IgG分子但無CH1區(qū)域和輕鏈。由于結(jié)構(gòu)上的同源，F(xiàn)c融合蛋白表現(xiàn)出與類似 同種型的人IgG相當(dāng)?shù)捏w內(nèi)藥物動力學(xué)特性。
[0008] 國外已有人借助基因工程手段構(gòu)建了人TNFRII型受體部分與IgG的Fc片段的融 合蛋白，此蛋白在離體條件下對TNF有中和作用（美國專利5, 605, 590)。國內(nèi)也有構(gòu)建此 類融合蛋白，馬菁等在CN1417334A腫瘤壞死因子受體可溶部分的重組基因，及融合蛋白基 因與產(chǎn)物中構(gòu)建了一種含有l(wèi)inker的融合蛋白；劉昌間等在CN1502632A新型TNFR-Fc融 合蛋白中構(gòu)建了一種截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用雙順反子構(gòu)建了一種 人腫瘤壞死因子可溶性受體II-抗體FC段融合蛋白。
[0009] 運(yùn)類藥物人源化程度高，引起的免疫原性反應(yīng)低，治療效果很好，比單靠止痛藥和 抗炎藥更有效控制病情。但目前運(yùn)類治療藥物普遍存在制備方法復(fù)雜，表達(dá)量低，價格昂貴 等丞待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明解決的一個問題是提供了一種新型的重組人TNFR75-FC融合基因，及其表 達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0011] 本發(fā)明解決的第二個問題是構(gòu)建了一種含有重組人TNFR75-FC融合基因片段的 重組載體pCI-gs-TNFR75-Fc，轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后，其真核細(xì)胞的擴(kuò)增標(biāo)記，可大幅提高目 的基因在宿主細(xì)胞中的拷貝數(shù)，從而提高目的蛋白的表達(dá)量。
[0012] 本發(fā)明解決的第S個問題是，提供了一種含有重組載體pCI-gs-TNFR75-Fc的哺 乳動物細(xì)胞，可W穩(wěn)定表達(dá)TNFR75-FC。所述哺乳動物細(xì)胞可W是C冊細(xì)胞、NS0細(xì)胞等常 用哺乳動物細(xì)胞工程細(xì)胞株。
[0013] 本發(fā)明解決的第四個問題是通過硫氨甲硫氨酸（MS訝加壓擴(kuò)增篩選，使表達(dá)目的 蛋白細(xì)胞株表達(dá)量提高至少一個數(shù)量級，在進(jìn)行高效表達(dá)細(xì)胞株篩選時，最終將MSX濃度 提高到400~500 ym，篩選單克隆表達(dá)量達(dá)到20~30pg/cell?24虹。
[0014] 為解決上述問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案來實施：
[0015] 抽提化-60細(xì)胞株的總RNA，RT-PCR擴(kuò)增人STNFR75基因片段；PCR擴(kuò)增人IgGlFc 基因片段。采用OverlapextentionPCR技術(shù)將兩基因片段進(jìn)行拼接得到編碼riiTNFR:化 融合蛋白的全長cDNA序列。將獲得的該cDNA序列插入克隆中間載體Teasy,經(jīng)序列測定 證實正確后進(jìn)行真核表達(dá)載體的構(gòu)建。
[0016] rhTNFR:Fc融合蛋白cDNA片段克隆于表達(dá)載體，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，將無菌抽 提的重組質(zhì)粒riiTNFR:Fc/pCI-gs導(dǎo)入CH0細(xì)胞中，經(jīng)MSX加壓篩選，得到了高表達(dá)量的 rhTNFR:Fc融合蛋白的基因工程單克隆細(xì)胞株，在將MSX濃度提高到400~500ym時，篩選 單克隆表達(dá)量達(dá)到20~30pg/cell? 24虹。
[0017] 本發(fā)明通過OVERLAPPCR的方法合成了 一種人腫瘤壞死因子受體融合基因 TNFR75-FC，采用含有GS系統(tǒng)的真核細(xì)胞高效表達(dá)載體，在哺乳動物細(xì)胞中經(jīng)過MSX加壓篩 選使得該融合蛋白的表達(dá)量提高了 20個百分點，融合蛋白活性提高了 8個百分點。
【具體實施方式】
[0018] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明并不限于下述實施 例。
[0019] 實施例1人可溶性TNFR75CDNA的制備
[0020]1、PCR擴(kuò)增TNFR75CDNA
[0021] 設(shè)計引物A:5，TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3，引物B:5，GTCACA AGATTTGGGCTCGTCGCCAGTGCTCCCTTCAGC3'， 陽0巧設(shè)計另外一組引物，在引物B中將引入linker序列，該序列（Gly4Ser)3,為一編 碼15個氨基酸的疏水性多膚，它們的活動度較好，不影響TNFR和Fc的天然立維結(jié)構(gòu)，其 linker的DNA序列為 5'_GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGCGGC AGC- 3'。
[0023] 設(shè)計引入linker序列的引物B。引物L(fēng)inker-B:5'GCTGCCGCCACCGCCGCT TCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCGTC。
[0024]W人早幼粒白血病細(xì)胞總RNA為模板，分別W引物A和B為模板、WA和Linker-B 為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，94°C變性 5min開始循環(huán)，94°C30sec，58°C30sec，72°CImin，共 32個循環(huán)，最后72°C延伸8min。得到編碼STNFR75和對照sTNFR75-linker的基因片段。 陽02引 2、PCR產(chǎn)物的鑒定和凝膠回收
[0026] 將上述條件進(jìn)行PCR，在瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物中目的蛋白分子量 大約8(K)bp的帶，將該片段回收。
[0027] 實施例2人IgGl重鏈恒定區(qū)Fc段基因片段的克隆
[0028]設(shè)計引物C:5，GAGCCCAAATCTTGTGACGAGCCCAAATCTTGTGACAAA3，，弓I 物D:5,AGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA3,；
[0029]設(shè)計引物linker-C:GGTGGCGGTGGAAGCGGCGGTGGCGGAAGCGGCGGTGGC GGCAGCGAG。
[0030] WIgGlFc/Teasy載體質(zhì)粒為模板，分別WC和D為引物、WLinker-C和D為引 物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，94°C變性 5min開始循環(huán)，94°C20sec，62°C30sec，72°C2min，共 35 個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。擴(kuò)增得到編碼人IgGl化和對照linker-IgGl化的基因片段。 陽〇3U實施例3TNFR75-FC融合基因的獲得
[0032] 1、PCR擴(kuò)增編碼riiTNFR-Fc融合蛋白/riiTNFR-linker-Fc的全長基因片段 陽03引WSTNFR75PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和人IgGlFc段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，WA:5'TCAAGCTT ATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3,和D:5,AGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGA3'為引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
[0034] 同時WsTNFR75-linkerPCR擴(kuò)增產(chǎn)物和人linker-IgGlFc段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模 板，A:5,TCAAGCTTATGGCTCCCGTCGCCGTCTGG3,和D:5,AGTGAATTCTCATTT ACCCGGAGACAGGGA3' 為引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
[0035]RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟：94°C變性 5min開始循環(huán)，94°C40sec，62°C30sec， 70°CImin，共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
[0036] 擴(kuò)增得到riiTNFR-Fc和riiTNFR-linker-Fc融合蛋白的全長cDNA片段，其基因片 段長分別為1470b