一種金屬硫蛋白基因及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種基因，具體是從四膜蟲Tetr址ymenaelliotti中克隆的金屬硫蛋 白基因，含有該基因的重組工程菌在水體環(huán)境中重金屬污染治理方面具有重要應(yīng)用前景。
【背景技術(shù)】
[0002] 金屬對環(huán)境的嚴(yán)重威脅正逐漸成為全球性問題，重金屬在水體中積累到一定的 限度就會(huì)對水體-水生植物-水生動(dòng)物系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，并可能通過食物鏈直接或間接 地影響到人類的自身健康。如何科學(xué)有效地解決重金屬對水體的污染已經(jīng)成為研究的熱 點(diǎn)。目前用于治理水體重金屬污染的化學(xué)法、物理化學(xué)法都將產(chǎn)生污染轉(zhuǎn)移，易造成二次污 染，且對于大流域、低濃度的有害重金屬污染難W處理。
[0003] 而生物法具有效果好、投資少及運(yùn)作費(fèi)用低、易于管理和操作、不產(chǎn)生二次污染等 優(yōu)點(diǎn)，日益受到人們的關(guān)注。近年來，微生物和基因工程技術(shù)逐漸用于水環(huán)境重金屬污染的 治理，并在水體環(huán)境中重金屬污染的治理方面發(fā)揮著越來越重要的作用。如何提高重組工 程菌吸收重金屬離子的能力，是治理水環(huán)境重金屬污染所面臨的重要問題。
[0004] 四膜蟲MTs在金屬硫蛋白超家族分類系統(tǒng)中位于第7家族，四膜蟲金屬硫蛋白基 因中沒有內(nèi)含子，因此可W快速地響應(yīng)外界環(huán)境脅迫并加快蛋白表達(dá)。四膜蟲是一種單細(xì) 胞真核模式生物，無細(xì)胞壁，對于外源環(huán)境污染物脅迫敏感，具有快速的細(xì)胞響應(yīng)機(jī)制，因 此被認(rèn)為是毒理學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)研究良好的模式生物之一。 陽〇化]目前，國內(nèi)外已經(jīng)有將植物，動(dòng)物金屬硫蛋白轉(zhuǎn)入大腸桿菌中用于治理水環(huán)境 重金屬污染的報(bào)道，重組華溪蟹金屬硫蛋白的工程菌可吸收0. 467X10 4mol/g水體中的 CcT;重組黃瓜類金屬硫蛋白的工程菌可吸收1.25X10 4mol/g水體中的CcT。但本發(fā)明 將四膜蟲Tetr址ymenaelliotti中克隆得到的一種金屬硫蛋白基因構(gòu)建的工程菌化21/ pSUM0-Te-MTT2可吸收3. 89X10 4mol/g水體中的CcT，與之前報(bào)道相比，富集重金屬離子的 能力更強(qiáng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種新的金屬硫蛋白基因，提供一種含有金屬硫蛋白基因 可吸收重金屬離子的基因工程菌，W及它們在富集水體重金屬中的應(yīng)用。 陽007] 本發(fā)明提供的一種金屬硫蛋白基因，其核巧酸序列為SEQIDNO: 1。
[0008] 一種金屬硫蛋白突變基因燈e-MTT2)，其核巧酸序列為SEQIDN0:2。
[0009] 上述突變基因編碼的多膚，其氨基酸序列為SEQIDNO:3。
[0010] 一種重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2,含有所述的突變基因。
[0011] 一種重組基因工程菌，是將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌得到的重組菌。
[0012] 本發(fā)明含金屬硫蛋白基因（Te-MTT2)的工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟： 陽01引 （1)從四膜蟲Tetr址ymenaelliotti中克隆得到MTT2基因，分別在Te-MTT2的 5'端和3'端加上BamHI和化0I酶切位點(diǎn)；并通過PCR方法突變基因序列中的兩個(gè)大 腸桿菌終止密碼子；將突變后的Te-MTT2基因連接到表達(dá)載體pSUMO中，獲得重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2；
[0014] (2)將重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2轉(zhuǎn)入大腸桿菌化21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出目的蛋白 SUM0-Te-MTT2,并用Westernblot的方法檢測蛋白的表達(dá)；
[00巧]檢測實(shí)驗(yàn)：使用不同濃度的CcT處理經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌化21/pSUM0-Te-MTT2,檢測ODe。。的數(shù)據(jù)，并構(gòu)建劑量構(gòu)效關(guān)系，對照為相同條件下處理的大腸桿 菌化21/pSUMO,每組實(shí)驗(yàn)S個(gè)平行。
[0016] 用X射線巧光光譜儀檢測大腸桿菌化21/pSUMO和大腸桿菌化21/pSUM0-Te-MTT2 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后馨合CcT的能力，每組S個(gè)平行。
[0017] 實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明所提供的含有Te-MTT2基因的基因工程菌具有馨合水環(huán)境中金 屬離子的能力，反應(yīng)快速，高效，可在處理重金屬（儒、銅、鉛或隸）污水中應(yīng)用。所述的突 變基因及其編碼的多膚也可在重金屬污染修復(fù)中應(yīng)用。
【附圖說明】 陽0化]圖1重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2的鑒定。（Mr為Trans2KDNAMarker;泳道1為重 組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2;泳道2為Te-MTT2的PCR產(chǎn)物；泳道3為重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2 的BamHI和化0I的雙酶切鑒定）
[0019] 圖2重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2的構(gòu)建示意圖。
[0020] 圖 3 目的蛋白SUM〇-Te-MTT2 表達(dá)情況的檢測。（Mr為PremixedProteinMarker; 泳道1為化21/SUM0-Te-MTT2在0. 05mMIPTG誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)的全菌蛋白；泳道2為化21/ SUM0-Te-MTT2未誘導(dǎo)表達(dá)的全菌蛋白；泳道3為化21/SUM0-Te-MTT2在0. 05mMIPTG誘導(dǎo) 時(shí)表達(dá)的可溶蛋白）
[0021] 圖4Westernblot檢測目的蛋白SUM0-Te-MTT2的表達(dá)。（泳道1為化21/SUM0 全菌，泳道2為化21/SUM0上清；泳道3為化21/SUM0-Te-MTT2未誘導(dǎo)的全菌蛋白；泳道4 為化21/SUM0-Te-MTT2未誘導(dǎo)的上清蛋白；泳道5為化21/SUM0-Te-MTT2在IPTG誘導(dǎo)下全 菌蛋白；泳道4為化21/SUM0-Te-MTT2在IPTG誘導(dǎo)下的上清蛋白）
[0022] 圖 5Cd2+處理大腸桿菌BL21/祀-SUMO和BL21/pSUM0-Te-MTT2 后，0D6。。一C(T濃 度關(guān)系圖。
[0023]圖 6 大腸桿菌BL21/pSUM0 和BL21/pSUM0-Te-MTT2 富集Cd2+比較。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1金屬硫蛋白Te-MTT2基因的擴(kuò)增、突變和重組質(zhì)粒pSUM0-Te-MTT2的構(gòu) 建及鑒定 陽0對設(shè)計(jì)引物：
[0026] (1)克隆基因Te-MTT2設(shè)計(jì)的引物：
[0027]Te-MTT2-F：GGATCCATGGACCCTCAAACTCAAAATA
[0028]Te-MTT2-R：CTCGAGTCAGCATTTGCATTCTGAGCA
[0029] (2)基因Te-MTT2突變終止密碼子設(shè)計(jì)的引物：
[0030] 突變第一個(gè)終止密碼子的引物
[0031] l'ubian-Te-MTT2-F-l :GCAACTGTCAACCTTGTGAAAACTG
[0032] l'ubian-Te-MTT2-R-l :CAGTTTTCACAAGGTTGACAGTTGC
[0033] 突變第二個(gè)終止密碼子的引物
[0034] l'ubian-Te-MTT2-F-2 :CTGAAAATTGCCAATGCAACCCTTG
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