一種特異識別腫瘤細胞的受體蛋白、t淋巴細胞及nk細胞的制作方法
【技術領域】 [0001] 本發(fā)明涉及生物，尤其涉及一種特異識別腫瘤細胞的受體蛋 白、T淋巴細胞及NK細胞。
【背景技術】 [0002] 腫瘤的免疫細胞治療是腫瘤研究領域的前沿和熱點，從利用抗體為導 向的革G向治療到以活化免疫細胞為效應細胞的過繼免疫治療，在腫瘤的免疫治療上都取得 了一定的理論和實踐的積累。但從總體上看，迄今為止，免疫治療效果仍不能達到徹底清除 體內(nèi)腫瘤細胞的目的。導致免疫治療效果欠佳主要的原因之一就是免疫效應細胞缺乏特異 識別腫瘤細胞的靶向性。因此，將抗體的導向作用與免疫細胞的殺傷作用相結合，是腫瘤過 繼免疫治療的一個重要研究方向。
[0003] 近年來，一種稱為CAR-T(chimericantigenreceptorTcell,CAR-T)和 CAR-NK(chimericantigenreceptorNKcell,CAR-NK)的免疫治療正是這種研究所取得的 重要成果。以CAR-T為例，其機理就是從患者自身血液收集T細胞，對T細胞進行基因工程 處理，使T細胞表面表達出能夠識別特異性腫瘤抗原的特殊受體，這種受體被稱為嵌合抗 原受體（chimericantigenreceptor,CAR)，同時在受體的胞內(nèi)段加上引起T細胞活化的 信號傳遞區(qū)域。CAR是一種蛋白質受體，可使T細胞識別腫瘤細胞表面的特定蛋白質（抗 原），表達CAR的T細胞可識別并結合腫瘤抗原，進而攻擊腫瘤細胞。這種表達CAR的T細 胞被稱為CAR-T。經(jīng)過設計的CAR-T細胞可在實驗室培養(yǎng)生長，達到數(shù)十億之多將擴增后的 CAR-T細胞注入到患者體內(nèi)，注入之后的T細胞也會在患者體內(nèi)增殖，并殺死具有相應特異 性抗原的腫瘤細胞。
[0004] 以識別⑶19抗原受體為靶向的CAR-T治療在B淋巴細胞瘤治療中取得了顯著療 效，并且正在嘗試用于實體瘤。雖然CAR-T的這些初步結果令人鼓舞，但是CAR-T細胞的關 鍵在于其識別腫瘤的特異性受體。在實體瘤的CAR-T治療上能否取得突破性的進展將主要 取決于受體的特異性。
[0005] 本發(fā)明經(jīng)過大量的前期驗證和比較，篩選到了一種具有特異識別腫瘤細胞的受體 蛋白，該受體蛋白的發(fā)現(xiàn)有望可以為進一步拓寬CAR-T以及CAR-NK在實體腫瘤中的應用打 下堅實的基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種可提高CAR-T和 CAR-NK在實體瘤中的殺瘤活性的受體蛋白、T淋巴細胞及NK細胞。
[0007] 本發(fā)明的技術方案為：
[0008] -種特異識別腫瘤細胞的受體蛋白，編碼所述受體蛋白的核苷酸序列為：SEDID N0:l〇
[0009] 進一步，所述受體蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。
[0010] 進一步，本發(fā)明還公開了一種特異識別腫瘤細胞的T淋巴細胞，其表達氨基酸序 列為SEDIDN0:2的受體蛋白基因。
[0011] 進一步，本發(fā)明所述的一種特異識別腫瘤細胞的T淋巴細胞，其由氨基酸序列為 SEDIDN0:2的受體蛋白基因構建在CAR-T的表達載體上，通過慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病 毒顆粒，進行轉染即可。
[0012] 進一步，本發(fā)明還公開一種特異識別腫瘤細胞的NK細胞，其表達氨基酸序列為 SEDIDN0:2的受體蛋白基因。
[0013] 進一步，本發(fā)明所述的一種特異識別腫瘤細胞的NK細胞，其由氨基酸序列為SED IDN0:2的受體蛋白基因構建在CAR-NK的表達載體上，通過慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病毒 顆粒，進行轉染即可。
[0014] 本發(fā)明還公開了一種特異識別腫瘤細胞的受體蛋白的制備方法，所述制備方法包 括：
[0015] 先提取抗肝癌的單克隆雜交瘤細胞的RNA，然后用單克隆抗體的特異性引物進行 RT-PCR，將抗體重鏈和輕鏈的可變區(qū)DNA片段克隆到T載體上，測序，獲得特異性識別腫瘤 細胞的受體蛋白。
[0016] 更進一步，本發(fā)明還公開一種抗肝癌的單克隆雜交瘤細胞的制備方法，所述制備 方法包括以下步驟：
[0017] 采用肝癌組織作為免疫原對小鼠進行免疫，然后取免疫處理后的小鼠脾臟，獲得B 淋巴細胞，再選取骨髓瘤細胞，B淋巴細胞與骨髓瘤細胞通過促溶劑實現(xiàn)融合，通過HAT培 養(yǎng)基進行初步篩選完成融合的異核體雜交瘤，并通過ELISA抗體分析篩選獲得單克隆雜交 瘤細胞。
[0018] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明經(jīng)過大量的實驗數(shù)據(jù)，篩選到一種特異性識別腫瘤 細胞的受體蛋白，該受體蛋白構建在CAR-T或CAR-NK的表達載體上，得到T淋巴細胞和NK 細胞。在CAR-T和CAR-NK的細胞免疫治療中，可以顯著提高T淋巴細胞殺傷腫瘤活性（~ 40% )以及NK細胞殺傷腫瘤活性（~50% )。
【具體實施方式】 [0019] 下面結合對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
[0020] 為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明了，下面結合【具體實施方式】，對本 發(fā)明進一步詳細說明。應該理解，這些描述只是示例性的，而并非要限制本發(fā)明的范圍。此 外，在以下說明中，省略了對公知技術的描述，以避免不必要地混淆本發(fā)明的概念。
[0021] 本發(fā)明提供一種特異識別腫瘤細胞的受體蛋白，編碼所述受體蛋白的核苷酸序列 為：SEDIDN0:1。
[0022] 進一步，所述受體蛋白的氨基酸序列是：SEDIDNO:2。
[0023] 進一步，本發(fā)明還公開了一種特異識別腫瘤細胞的T淋巴細胞，其表達氨基酸序 列為SEDIDN0:2的受體蛋白基因。
[0024] 實施例1
[0025] 本發(fā)明所述的一種特異識別腫瘤細胞的T淋巴細胞，其由氨基酸序列為SEDID N0:2的受體蛋白基因構建在CAR-T的表達載體上，通過慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病毒顆粒， 進行轉染即可。
[0026] 本實施例構建在CAR-T的表達載體上的T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷活性的體外實 驗如下：
[0027] 利用常規(guī)的慢病毒包裝系統(tǒng)，包裝出含CAR_MH(氨基酸序列為SEDIDN0:2的受 體蛋白基因）-T的假病毒顆粒。
[0028] 通過流式細胞分選，獲得健康人⑶8+T細胞。
[0029] 將包裝好的CAR-MH-T假病毒顆粒對⑶8+T細胞進行轉染，獲得表達CAR-MH-T的T 淋巴細胞（識別腫瘤的靶向T細胞）。
[0030] 取96孔培養(yǎng)板，設置2組，分別為CAR-MH-T細胞孔和CD8+T細胞孔，每組12孔。 每孔分別加入20萬個表達CAR-MH-T的T淋巴細胞（效應細胞）或⑶8+T細胞（效應細 胞）后，再分別加入2萬個肝癌細胞HEPG2 (靶細胞），并控制每孔終體積為200yL。同時設 置三個對照孔，分別為只含有20萬個效應細胞和2萬個靶細胞的對照孔，每孔體積同樣為 200yL。37°CC02培養(yǎng)箱4h，每孔加入20yLMTT細胞活性檢測試劑，37°CC0 2培養(yǎng)箱2h， 550nm波長測定吸光值，計算殺傷率。殺傷率（％ ) =〔1一（0De+t-0De)/0Dt〕X100%;其 中，0隊為：單純效應細胞孔的0D值；0Dt:單純靶細胞孔孔的0D值；0D 效應細胞加靶細 胞孔的0D值；0D值為opticaldensity(光密度）的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度， 又稱吸光度。
[0031] 采用類似上述的方法分別檢測對結腸癌細胞Caco-2、胃癌細胞MGC-803的殺傷 率。檢測數(shù)據(jù)見表1。
[0032] 表1表達CAR-MH-T的T淋巴細胞對腫瘤細胞的體外殺傷活性
[0033]
[0034] 根據(jù)表1的檢測數(shù)據(jù)，通過顯著性分析可以看出，表達CAR-MH-T的T淋巴細胞對 三種腫瘤細胞的殺傷活性均明顯高于對照組⑶8+T的殺傷活性，且均提高30%以上。
[0035] 本實施例構建在CAR-T的表達載體上的T淋巴細胞對腫瘤細胞殺傷活性的小鼠實 驗如下：
[0036] 小鼠實驗采用聯(lián)合免疫缺陷的小鼠一"SCID小鼠"作為動物模型。SCID小鼠分為 3個組（肝癌細胞+CAR-MH-T細胞組、肝癌細胞+⑶8+T細胞組以及空白對照組），每組4只。 每只小鼠左大腿背側皮下分別接種3X106個HEPG2細胞。HEPG2細胞接種后第3天，每只 小鼠尾靜脈注射1X107的MH-T細胞或⑶8 +T細胞，空白對照組注射等體積的生理鹽水。每 間隔4天，每只小鼠尾部靜脈注射對應的免疫細胞1X107。20天后測量瘤體體積，比較各 組瘤體體積的差別。
[0037] 在SCID小鼠模型中測定免疫細胞對結腸癌細胞Caco-2、胃癌細胞MGC-803的殺傷 活性與上述方法相同。詳細結果見表2。
[0038] 表2表達CAR-MH-T的T淋巴細胞對腫瘤細胞的在小鼠體內(nèi)殺傷活性（n= 4,x±s,mm3)
[0039]
[0040] 從表2可以看出，表達CAR-MH的T淋巴細胞抑制小鼠體內(nèi)瘤體生長的活性明顯高 于普通的⑶8+T淋巴細胞。
[0041] 實施例2
[0042] 本實施例公開一種特異識別腫瘤細胞的NK細胞，其表達氨基酸序列為SEDID NO:2的受體蛋白基因。
[0043] 具體的，所述一種特異識別腫瘤細胞的NK細胞，其由氨基酸序列為SEDIDN0:2 的受體蛋白基因構建在CAR-NK的表達載體上，通過慢病毒包裝系統(tǒng)，制備假病毒顆粒，進 行轉染即可。
[0044] 其中，所述慢病毒轉染包括以下步驟：
[0045] 1)、取1. 5mL滅菌EP管，加入混合質粒以及250yL的無血清培養(yǎng)基；輕柔混勻，室 溫孵育5min。
[0046] 2)、取1. 5mL滅菌EP管，取9yL脂質體溶于250yL無血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻， 室溫孵育5min。
[0047] 3)、將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勾，室溫孵育20min。
[0048] 4)、DNA-脂質體復合物加入293T細胞中，細胞數(shù)量為1X106個，37°CC0J?箱中 孵育過夜。
[0049] 5)、移除含有DNA-脂質體復合物的培養(yǎng)基，代之以2mL慢病毒培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h，觀 察細胞融合狀況。
[0050] 6)、48-72h收獲含病毒的上清。3000rpm離心20min，去除沉淀，用0. 45ym的微孔 濾膜過濾。
[0051] 7)、將待轉染的NK細胞培養(yǎng)于不含抗生素的培養(yǎng)基中，細胞密度約為30% ;
[0052] 8)、轉染細胞：在2X105/mLNK細胞中加入終濃度為6yg/mL的聚凝胺和適量病 毒，充分混勻。
[0053] 9、繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。
[0054] 本實施例構建在CAR-NK的表達載體上的NK細胞對腫瘤細胞殺傷活性的體外實驗 如下：
[0055] 利用常規(guī)的慢病毒包裝系統(tǒng)，包裝出含CAR-MH(氨基酸序列為SEDIDN0:2的受 體蛋白基因）-NK的假病毒顆粒。
[0056] 通過流式細胞分選，獲得健康人⑶56+NK細胞。
[0057] 將包裝好的CAR-MH-NK假病毒顆粒對CD56+NK細胞進行轉染，獲得表達CAR-MH-NK 的NK細胞（識別腫瘤的靶向NK細胞）。
[0058] 取96孔培養(yǎng)板，設置2組，分別為CAR-MH-T細胞孔和CD8+T細胞孔，每組12孔。 每孔分別加入20萬個表達CAR-MH-NK的NK淋巴細胞（效應細胞）或⑶56+T細胞（效應 細胞）后，再分別加入2萬個肝癌細胞HEPG2 (靶細胞），并控制每孔終體積為200y L。同 時設置三個對照孔，分別為只含有20萬個效應細胞和2萬個靶細胞的對照孔，每孔體積同 樣為200y L。37°CC02培養(yǎng)箱4h，每孔加入20y L MTT細胞活性檢測試劑，37°CCO2培養(yǎng)箱 2h，550nm波長測定吸光值，計算殺傷率。殺傷率（％ ) =〔1一（ODe+t - 0De)/0Dt〕X100%; 其中，0隊:單純效應細胞孔的OD值；ODt:單純靶細胞孔孔的OD值；OD