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胰高血糖素樣肽-1受體激動劑制備治療肺動脈高壓藥物的應(yīng)用

文檔序號:10633779閱讀:1113來源:國知局
胰高血糖素樣肽-1受體激動劑制備治療肺動脈高壓藥物的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)胰高血糖素樣肽?1受體激動劑治療肺動脈高壓的新用途。本發(fā)明用多種實驗證實該類藥物能夠有效地降低細(xì)胞糖酵解水平,抑制肺血管細(xì)胞的異常增生,顯著減輕肺血管重構(gòu),從而降低肺血管阻力和肺動脈壓力,治療肺動脈高壓。
【專利說明】膜高血糖素樣化-1受體激動劑制備治療肺動脈高壓藥物的 應(yīng)用
[0001 ] 本申請針對申請?zhí)枮?01510428001.0申請日為2015年7月20日的中國專利申請?zhí)?出優(yōu)先權(quán)請求。
技術(shù)領(lǐng)域:
[0002] 本發(fā)明設(shè)及膜高血糖素樣膚-1受體激動劑的新用途,特別設(shè)及其在制備肺動脈高 壓治療藥物方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】:
[0003] 膜高血糖素樣膚-UW下亦簡稱化P-1)是小腸 k細(xì)胞在腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的刺激下 所分泌產(chǎn)生的內(nèi)源性激素。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中的報道中,GLP-1主要是對糖代謝的作用,包括刺激膜島素釋放,阻止 膜高血糖素分泌,減慢胃排空,W及增加飽腹感等,運些效應(yīng)的產(chǎn)生是通過化P-1受體實現(xiàn) 的?;疨-1受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,分布于膜島、腎臟、腦、屯、臟、胃腸道和肺血管等組織或 器官。內(nèi)源性化P-1作用時間有限,迅速被DDP-4酶降解。因此,人工合成的能夠抵抗DDP-4降 解的化P-1類似物先后被研發(fā)出來,作為化P-1受體激動劑用于2型糖尿病的治療,如:艾塞 那膚、利拉魯膚和利西拉來等。此外,利拉魯膚近期還被美國食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn) 用于肥胖癥治療。
[0005] 肺動脈高壓指由各種原因引起的肺血管床結(jié)構(gòu)和/或功能的改變,導(dǎo)致W肺血管 阻力進(jìn)行性升高為特點的臨床綜合征。在肺動脈高壓的形成和發(fā)展機(jī)制中,致死性、難治性 的進(jìn)行性肺血管重構(gòu)具有極為重要的作用。肺血管重構(gòu)W平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮細(xì)胞功能 障礙為主要特征,可W導(dǎo)致肺動脈血管閉塞,引起肺血管阻力和肺動脈壓力明顯增高,進(jìn)而 可誘發(fā)右屯、室功能不全。
[0006] 肺動脈高壓預(yù)后較差,平均存活時間僅為2.8年,其早期診斷和治療仍然是目前面 臨的臨床難題。肺動脈高壓藥物治療十分困難,目前臨床用藥,其治療機(jī)制主要是通過擴(kuò)張 肺血管來降低肺血管阻力和肺動脈壓力,如:巧通道阻滯劑、前列環(huán)素、憐酸二醋酶-5抑制 劑等,上述藥物僅緩解壓力,但對于抑制細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)沒有明確的作用。
[0007] 盡管已知利拉魯膚等GLP-1受體激動劑對糖代謝的調(diào)節(jié)作用可通過激活A(yù)MPK通路 實現(xiàn),而AMPK作為機(jī)體調(diào)節(jié)代謝的核屯、分子被激活可促進(jìn)分解代謝,下調(diào)合成代謝,恢復(fù)能 量代謝平衡,同時可降低HIF-la表達(dá),抑制糖酵解水平的異常升高。但目前并未見到化P-1 受體激動劑用于肺高壓治療的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的最終目的是提供一種肺動脈高壓治療藥物,直接目的是發(fā)現(xiàn)化P-1受體 激動劑的新的功能一-用于肺動脈高壓的治療,特別是在有效抑制異常的細(xì)胞增生,減輕 肺血管重構(gòu)方面的作用。
[0009 ]發(fā)明人基于W下認(rèn)識和分析,設(shè)計了本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0010] 肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖與糖代謝異常有著密切的關(guān)系。對于肺動脈高壓患 者,由于缺氧誘導(dǎo)因子HIF-la的表達(dá)和活化異常增強(qiáng),會引起一系列與糖代謝有關(guān)的酶,如 葡萄糖轉(zhuǎn)運體、己糖激酶、乳酸脫氨酶A、丙酬酸脫氨酶激酶和丙酬酸脫氨酶等的改變,從而 導(dǎo)致肺血管細(xì)胞的葡萄糖代謝方式從正常的線粒體有氧氧化向異常的糖酵解轉(zhuǎn)化,糖酵解 不斷增強(qiáng),糖酵解的中間代謝產(chǎn)物可為細(xì)胞增殖合成DNA等提供大量底物,而且,細(xì)胞氧耗 與能量合成平衡被打破,能量代謝效率下降,線粒體功能障礙,從而破壞了肺血管平滑肌細(xì) 胞的增殖與調(diào)亡之間的動態(tài)平衡,導(dǎo)致或促進(jìn)肺血管重構(gòu)和肺動脈高壓的形成。
[0011] 本發(fā)明人認(rèn)為,如果能應(yīng)用化P-1受體激動劑,通過其對細(xì)胞糖代謝的調(diào)節(jié)作用, 抑制細(xì)胞糖酵解,促進(jìn)線粒體功能,恢復(fù)細(xì)胞代謝效率,就有可能控制或逆轉(zhuǎn)肺血管平滑肌 細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖,從而延緩甚至逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu),達(dá)到治療肺動脈高壓的目的。
[0012] 因此,推測運類藥物有可能用于肺動脈高壓的治療。
[0013] 本發(fā)明用動物實驗、體外分子生物學(xué)實驗等多方實驗驗證了上述設(shè)想,首次證實 GLP-1受體激動劑可W作為肺動脈高壓治療藥物,特別是能夠有效地抑制異常的細(xì)胞增生, 減輕肺血管重構(gòu)。
[0014] 所述實驗如下:
[001引動物實驗
[0016] 經(jīng)典大鼠肺高壓模型證明,與不用藥的對照組相比,GLP-1受體激動劑治療組可明 顯降低肺高壓動物模型的肺動脈壓力,并明顯降低肺血管阻力和右屯、肥厚程度;
[0017] 體外分子生物學(xué)實驗
[0018] 大鼠肺組織切片染色表明,與不用藥的對照組相比,GLP-1受體激動劑治療組可明 顯減輕肺血管肌化程度和炎性細(xì)胞浸潤程度,提示肺高壓典型病理表現(xiàn)肺血管重構(gòu)減輕; 大鼠肺組織碳酸酢酶免疫組化染色,治療組大鼠肺組織碳酸酢酶水平較不用藥對照組相比 顯著下降,提示組織缺氧程度減輕;
[0019] 大鼠肺組織蛋白印記檢測顯示,治療組較不用藥對照組葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白1 (Glut-1)表達(dá)下降,pAMPK/AMPK比例明顯升高;且表皮生長因子刺激人肺血管平滑肌細(xì)胞 模擬重構(gòu)肺血管細(xì)胞模型證明,GLP-1受體激動劑可顯著抑制人肺血管平滑肌細(xì)胞增生、降 低細(xì)胞葡萄糖攝取W及糖酵解終產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生,提示化P-1受體激動劑可有效干預(yù)細(xì)胞 代謝,抑制糖酵解。
[0020] 上述各項實驗均證實:GLP-1受體激動劑能夠通過對細(xì)胞糖代謝方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。其 藥理機(jī)制是:有效地降低細(xì)胞糖酵解水平,抑制肺血管細(xì)胞的異常增生,顯著減輕肺血管重 構(gòu),從而降低肺血管阻力和肺動脈壓力,能夠達(dá)到治療肺動脈高壓的目的。
[0021] 而現(xiàn)有技術(shù)中治療肺動脈高壓的藥物主要是通過擴(kuò)張肺血管來降低肺血管阻力 和肺動脈壓力,對于抑制細(xì)胞增殖和血管重構(gòu)沒有明確的作用。而本發(fā)明的藥物從根本上 解決了問題。
[0022] 本發(fā)明所述的化P-1受體激動劑包括但不限于艾塞那膚(exenatide)、利拉魯膚 (liraglutide)和利西拉來(lixisenatide),阿必魯膚(albiglutide),杜拉魯膚 (dulaglutide)。
[0023] 通過本發(fā)明給予的啟示,本領(lǐng)域技術(shù)人員可W預(yù)見:能夠?qū)?xì)胞糖代謝進(jìn)行調(diào)節(jié) 的GLP-1受體激動劑,都可W達(dá)到本發(fā)明的目的。
【附圖說明】
[0024] 圖1大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和利拉魯膚治療組肺動脈壓力測定結(jié) 果的比較,顯示利拉魯膚治療組的肺動脈壓力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0025] 圖2大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和利拉魯膚治療組肺血管阻力測定結(jié) 果的比較,顯示利拉魯膚治療組的肺血管阻力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[00%]圖3大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和利拉魯膚治療組右屯、肥厚指數(shù)測定 結(jié)果的比較,顯示利拉魯膚治療組右屯、肥厚程度明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0027]圖4大鼠肺高壓模型組和利拉魯膚治療組分別進(jìn)行肺組織彈性纖維EVG染色,檢測 肺血管肌化程度。結(jié)果顯示:箭頭所指為重構(gòu)的彈性纖維層,利拉魯膚治療組肺血管肌化程 度較肺高壓模型組明顯減輕。
[00%]圖5大鼠肺高壓模型組和利拉魯膚治療組分別進(jìn)行肺組織CD68染色,檢測炎性細(xì) 胞浸潤程度。結(jié)果顯示:箭頭所指為CD68陽性的細(xì)胞,即浸潤在肺血管周圍的炎性細(xì)胞,利 拉魯膚治療組炎性細(xì)胞浸潤程度較肺高壓模型組明顯減輕。
[0029] 圖6 Glut-l、pAMPK/AMPK表達(dá)蛋白印記檢測,結(jié)果顯示:利拉魯膚治療組較肺高壓 組大鼠肺組織pAMPK/AMPK比例明顯升高,提示AMPK憐酸化程度增高,Glut-1表達(dá)顯著減少。
[0030] 圖7肺組織碳酸酢酶免疫組化染色,結(jié)果顯示:箭頭所指為碳酸酢酶免疫組化染色 陽性的肺血管組織,利拉魯膚治療組較肺高壓組大鼠肺組織碳酸酢酶水平顯著下降。
[0031] 圖8大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和艾塞那膚治療組肺動脈壓力測定結(jié) 果的比較,顯示艾塞那膚治療組的肺動脈壓力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0032] 圖9大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和艾塞那膚治療組肺血管阻力測定結(jié) 果的比較,顯示艾塞那膚治療組的肺血管阻力明顯低于肺高壓模型未用藥組。
[0033] 圖10大鼠健康對照組、肺高壓模型未用藥組和艾塞那膚治療組右屯、肥厚指數(shù)測定 結(jié)果的比較,顯示艾塞那膚治療組右屯、肥厚程度明顯低于肺高壓模型未用藥組。
【具體實施方式】
[0034] W下實施例所用的藥物僅用于舉例說明本發(fā)明,并不限定本發(fā)明所稱的化P-1受 體激動劑的范圍。
[0035] 實施例1 GLP-1受體激動劑利拉魯膚對肺高壓動物的治療作用
[0036] 1、實驗?zāi)康?br>[0037] 通過建立肺高壓動物模型,并利用化P-1受體激動劑利拉魯膚進(jìn)行治療,通過對大 鼠肺動脈血流動力學(xué)和右屯、肥厚指標(biāo)的檢測,觀察利拉魯膚的療效。
[0038] 2、實驗動物和實驗方法
[0039] 選擇體重為220-230g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為Ξ組,分別為健康對照組、肺動脈高 壓模型未用藥組和藥物治療組,每組6只。健康對照組僅皮下注射生理鹽水。未用藥組和藥 物治療組均皮下注射野百合堿(Sigma公司)誘導(dǎo)肺動脈高壓形成,野百合堿單次注射,注射 劑量為60mg/Kg。藥物治療組于野百合堿注射后7天開始,再連續(xù)14天每日腹腔注射利拉魯 膚(Novo Nordisk公司)治療,劑量為0.4mg/Kg。
[0040] 野百合堿單次注射后Ξ周,利用右屯、導(dǎo)管測量各組大鼠的右屯、和肺動脈血流動力 學(xué)指標(biāo)。大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酬/美托咪挫混合液2mL/Kg麻醉后,將預(yù)制導(dǎo)管連接壓力測量 儀,經(jīng)右頸外靜脈插管,經(jīng)上腔靜脈到達(dá)右房、右室、肺動脈,分別記錄右屯、房、右屯、室、肺動 脈壓力完畢后,將導(dǎo)管退入至右屯、室,固定。取左屯、導(dǎo)管經(jīng)頸動脈插管,測量體循環(huán)動脈壓, 進(jìn)入左屯、室,測量左屯、壓力,記錄完畢后撤出左屯、導(dǎo)管,再經(jīng)相同路徑插入溫度測量導(dǎo)管, 進(jìn)行熱稀釋法屯、輸出量測量。從右屯、導(dǎo)管注入固定體積冰鹽水Ξ次,記錄每次注入生理鹽 水的體積和溫度,并記錄左屯、室內(nèi)溫度變化。根據(jù)平均肺動脈壓、屯、輸出量計算肺血管阻 力。
[0041] 血流動力學(xué)指標(biāo)測量完畢后,撤出導(dǎo)管,解剖大鼠,取材。仔細(xì)分離左右屯、室并稱 重,并計算右屯、肥厚指數(shù),右屯、肥厚指數(shù)=右屯、質(zhì)量/左屯、和室間隔質(zhì)量之和。
[0042] 3、實驗結(jié)果
[0043] 1)健康對照組大鼠平均肺動脈壓力為18.78 ± 3.60mmHg,未用藥組和藥物治療組 的平均肺動脈壓分別為44.90 ± 11.57mmHg和30.86 ± 4.85mmHg,未用藥組壓力較健康對照 組明顯升高,而藥物治療組明顯低于未用藥組,兩組間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇.001,圖 1);
[0044] 2)健康對照組大鼠肺血管阻力為0.19±0.09mmHg/mL/min,未用藥組和藥物治療 組的肺血管阻力分別為0.40 ±0.02mmHg/mL/min和0.31 ±0.03mmHg/mL/min,未用藥組阻力 較健康對照組明顯升高,藥物治療組明顯低于未用藥組,兩組間同樣有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.05,圖2)。
[0045] 3)健康對照組、未用藥組和藥物治療組的體循環(huán)動脈壓分別為113. 56 ± 26.38111111化、103.24±3.93111111化和109.16±9.15111恤旨,屯、輸出量分別為94.47±19.5311117 min、89.85 ±4.48mL/min和91.54 ± 10.77mL/min,Ξ組間均無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(均為P〉 0.05)。
[0046] 4)此外,健康對照組、未用藥組和藥物治療組的右屯、肥厚指數(shù)分別為0.26±0.01、 0.44 ± 0.10和0.34 ± 0.04,未用藥組右屯、明顯肥厚,而藥物治療組右屯、肥厚程度明顯低于 未用藥組,有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇.01,圖3)。
[0047] 4、實驗結(jié)論
[004引對比未用藥的肺高壓模型組,利拉魯膚能夠明顯降低平均肺動脈壓和肺血管阻 力,而體循環(huán)動脈壓、屯、輸出量未受到影響。且能夠明顯減輕右屯、肥厚程度。
[0049]表1各實驗組血流動力學(xué)指標(biāo)和右屯、肥厚指標(biāo)的比較
[(Κ)加 ]
[0052]實施例2 GLP-1受體激動劑艾塞那膚對肺高壓動物的治療作用 [0化3] 1、實驗?zāi)康?br>[0054] 通過建立肺高壓動物模型,并利用化P-1受體激動劑艾塞那膚進(jìn)行治療,通過對大 鼠肺動脈血流動力學(xué)和右屯、肥厚指標(biāo)的檢測,觀察艾塞那膚的療效。
[0055] 2、實驗動物和實驗方法
[0056] 選擇體重為220-230g的雄性SD大鼠隨機(jī)分為Ξ組,分別為健康對照組、肺動脈高 壓模型未用藥組和藥物治療組,每組6只。健康對照組僅皮下注射生理鹽水。未用藥組和藥 物治療組均皮下注射野百合堿(Sigma公司)誘導(dǎo)肺動脈高壓形成,野百合堿單次注射,注射 劑量為60mg/Kg。藥物治療組于野百合堿注射后7天開始,再連續(xù)14天每日腹腔注射艾塞那 膚(As traZeneca公司)治療,劑量為1 Oyg/Kg。
[0057] 野百合堿單次注射后Ξ周,利用右屯、導(dǎo)管測量各組大鼠的右屯、和肺動脈血流動力 學(xué)指標(biāo)。大鼠經(jīng)腹腔注射氯胺酬/美托咪挫混合液2mL/Kg麻醉后,將預(yù)制導(dǎo)管連接壓力測量 儀,經(jīng)右頸外靜脈插管,經(jīng)上腔靜脈到達(dá)右房、右室、肺動脈,分別記錄右屯、房、右屯、室、肺動 脈壓力完畢后,將導(dǎo)管退入至右屯、室,固定。取左屯、導(dǎo)管經(jīng)頸動脈插管,測量體循環(huán)動脈壓, 進(jìn)入左屯、室,測量左屯、壓力,記錄完畢后撤出左屯、導(dǎo)管,再經(jīng)相同路徑插入溫度測量導(dǎo)管, 進(jìn)行熱稀釋法屯、輸出量測量。從右屯、導(dǎo)管注入固定體積冰鹽水Ξ次,記錄每次注入生理鹽 水的體積和溫度,并記錄左屯、室內(nèi)溫度變化。根據(jù)平均肺動脈壓、屯、輸出量計算肺血管阻 力。
[005引血流動力學(xué)指標(biāo)測量完畢后,撤出導(dǎo)管,解剖大鼠,取材。仔細(xì)分離左右屯、室并稱 重,并計算右屯、肥厚指數(shù),右屯、肥厚指數(shù)=右屯、質(zhì)量/左屯、和室間隔質(zhì)量之和。
[0化9] 3、實驗結(jié)果
[0060] 1)健康對照組大鼠平均肺動脈壓力為14.83 ± 3.27mmHg,未用藥組和藥物治療組 的平均肺動脈壓分別為36.37 ± 5.61mmHg和30.11 ± 2.17mmHg,未用藥組壓力較健康對照組 明顯升高,而藥物治療組明顯低于未用藥組,兩組間有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇.01,圖8); [0061 ] 2)健康對照組大鼠肺血管阻力為0.16 ± 0.03mmHg/mL/min,未用藥組和藥物治療 組的肺血管阻力分別為ο. 39 ±0.05mmHg/mL/min和ο. 31 ±0.0 lmmHg/mL/min,未用藥組阻力 較健康對照組明顯升高,藥物治療組明顯低于未用藥組,兩組間同樣有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.001,圖9)。
[0062] 3)健康對照組、未用藥組和藥物治療組的體循環(huán)動脈壓分別為102.33 ± 9.02111111化、98.31±10.76111111化和98.60±9.91111111化,屯、輸出量分別為95.20±4.5611117111111、 92.20 ± 7.49mL/min和96.08 ±8.12mL/min,Ξ組間均無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(均為P〉0.05)。
[0063] 4)此外,健康對照組、未用藥組和藥物治療組的右屯、肥厚指數(shù)分別為0.27±0.03、 0.43 ± 0.07和0.33 ± 0.04,未用藥組右屯、明顯肥厚,而藥物治療組右屯、肥厚程度明顯低于 未用藥組,有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<〇.01,圖10)。
[0064] 4、實驗結(jié)論
[0065] 對比未用藥的肺高壓模型組,艾塞那膚能夠明顯降低平均肺動脈壓和肺血管阻 力,而體循環(huán)動脈壓、屯、輸出量未受到影響。且能夠明顯減輕右屯、肥厚程度。
[0066] 表2各實驗組血流動力學(xué)指標(biāo)和右屯、肥厚指標(biāo)的比較
[0067]
[006引實施例3 GLP-1受體激動劑對肺血管重構(gòu)的影響
[0069] 1、實驗?zāi)康?br>[0070] 體外組織檢測評價利拉魯膚治療對肺血管重構(gòu)的影響。
[0071] 2、實驗方法
[0072] 上述各組大鼠處死后,取出新鮮肺組織浸泡在10%福爾馬林溶液中過夜,然后換 70%乙醇保存,石蠟包埋切片,進(jìn)行彈性纖維EVG染色測量肺血管肌化程度和CD68染色測量 炎性細(xì)胞浸潤程度。
[0073] 3、實驗結(jié)果
[0074] 肺高壓模型未用藥組和藥物治療組的肺血管肌化程度分別為66.96±6.28%和 49.78±4.83%,利拉魯膚治療后肺血管肌化程度明顯減低,兩組有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P< 0.001,圖4);未用藥組和藥物治療組的CD68陽性細(xì)胞數(shù)分別為20.01 ±2.51個/mm哺9.28 ±5.93個/mm2,利拉魯膚治療后,炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕,有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05,圖 5)。
[00巧]4、實驗結(jié)論
[0076] 對比肺高壓模型組,利拉魯膚治療后肺血管肌化和炎性細(xì)胞浸潤等肺血管重構(gòu)病 理變化明顯減輕。
[0077] 實施例4 GLP-1受體激動劑對細(xì)胞增生的影響 [007引1、實驗?zāi)康?br>[0079] 通過進(jìn)行體外細(xì)胞增殖實驗(BrdU染色)評價利拉魯膚對肺血管平滑肌細(xì)胞增生 的影響。
[0080] 2、實驗方法
[0081 ]平底透明96孔板培養(yǎng)人肺血管平滑肌細(xì)胞(第Ξ至五代)(L0NZA公司),細(xì)胞密度 約5000個/mL,每孔體積10化1,普通10%牛血清培養(yǎng)液,37攝氏度、5%C02培養(yǎng)過夜。第二 日,移除陳舊培養(yǎng)液,換成0.05 %牛血清細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)24小時,使其生長速率均一化。
[0082] 24小時后,用含10%牛血清無生長因子的培養(yǎng)液配制濃度為50ng/ml的表皮生長 因子(PDGF)溶液、PDGF (50ng/ml) +利拉魯膚(20μΜ)溶液和 PDGF (50ng/ml) +利拉魯膚(50μΜ) 溶液分別作為培養(yǎng)液,將人肺血管平滑肌細(xì)胞分成對照組、PDGF組和利拉魯膚治療組(PDGF +利拉魯膚),每組η = 6,37攝氏度、5 % C〇2培養(yǎng)。48小時后向各組加入化加繼續(xù)培養(yǎng)24小時 至實驗終點72小時。移除培養(yǎng)液,加入細(xì)胞固定液固定細(xì)胞30分鐘后,移除固定液加入抗體 室溫解育1小時,洗一次,加入二抗室溫解育30分鐘后洗兩次,加入10化1反應(yīng)底物,暗室室 溫解育30分鐘后加入反應(yīng)終止溶液10化1,使用多功能微孔板檢測儀(Promega公司),450皿 吸收峰讀數(shù)。
[0083] 3、實驗結(jié)果
[0084] PDGF組細(xì)胞增生速率為對照組細(xì)胞1.5倍,而20μΜ和50μΜ利拉魯膚治療組細(xì)胞增 生速率僅分別是對照組細(xì)胞1.27倍和1.26倍,利拉魯膚治療組較PDGF組細(xì)胞增生速率顯著 下降,其差異均有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.05)。
[0085] 另外,為了研究利拉魯膚治療在正常條件下對健康細(xì)胞增生有無影響,在相同細(xì) 胞條件下,無 PDGF刺激,進(jìn)行細(xì)胞增生化加染色,20ιχΜ和SOiiM利拉魯膚治療72小時,和對照 組細(xì)胞相比,細(xì)胞增生速率差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P〉〇.05)。
[00化]4、實驗結(jié)論
[0087] 利拉魯膚能夠顯著降低PDGF誘導(dǎo)的肺血管平滑肌細(xì)胞增生,而對正常條件下的健 康細(xì)胞無明顯的影響。
[0088] 實施例5 GLP-1受體激動劑對體外細(xì)胞葡萄糖攝取的作用
[0089] 1、實驗?zāi)康?br>[0090] 通過巧光標(biāo)記2-N-[7-硝基苯-2-乙二酸-3,4-二徑氨基]-2-脫氧葡萄糖(2-NBDG) 攝取實驗測定GLP-1受體激動劑對肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取的影響
[0091] 2、實驗方法
[0092] 平底黑色96孔板培養(yǎng)人肺血管平滑肌細(xì)胞(第Ξ至五代KL0NZA公司),細(xì)胞密度 約5000個/mL,每孔10化1,普通10 %牛血清培養(yǎng)液,37攝氏度,5 % C〇2培養(yǎng)過夜。移除陳舊培 養(yǎng)液,用含10 %牛血清無生長因子的培養(yǎng)液配置PDGF(5化g/ml)和PDGF(5化g/ml)+利拉魯 膚(50μΜ)溶液分別作為培養(yǎng)液,
[0093] 將細(xì)胞分成對照組、表皮生長因子(PDGF)組及治療組(PDGF+利拉魯膚),每組η = 6,37攝氏度、5%C02培養(yǎng)。72小時實驗終點前3小時,向各組加入100μl2-NBDG(Cayman 化emical公司),最終濃度l(K)μg/ml,解育3小時后離屯、96孔板(400xg,室溫5分鐘),小屯、吸 去上清,憐酸鹽緩沖液洗Ξ次后,加入100μΙ分析緩沖液,使用多功能微孔板檢測儀 (Promega公司),激發(fā)波長485nm,發(fā)射波長535nm,巧光讀數(shù)獲取巧光強(qiáng)度。用細(xì)胞質(zhì)量校正 結(jié)果。
[0094] 3、實驗結(jié)果
[00M]對照組、PDGF組、利拉魯膚治療組人肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取水平校正巧光 強(qiáng)度分別為 3225.86 ± 787.93、6190.32 ± 980.76 和 3868.20 ± 14:34.26。72 小時 PDGF 刺激誘 導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取增加,而利拉魯膚顯著減少了人肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖 攝取(P<〇.〇5)
[0096] 4、實驗結(jié)論
[0097] 人肺血管平滑肌細(xì)胞葡萄糖攝取經(jīng)治療后顯著減低,表示利拉魯膚可調(diào)節(jié)細(xì)胞葡 萄糖代謝,進(jìn)而有可能抑制肺血管增生、改善肺血管重構(gòu)。
[0098] 實施例6GLP-1受體激動劑對細(xì)胞糖酵解水平的作用
[0099] 1、實驗?zāi)康?br>[0100] 通過測量細(xì)胞外環(huán)境乳酸水平,檢測對細(xì)胞糖酵解水平的影響。
[0101] 說明:乳酸為細(xì)胞糖酵解過程終產(chǎn)物,并被釋放至細(xì)胞外環(huán)境,被分泌至細(xì)胞外環(huán) 境的乳酸水平與細(xì)胞糖酵解水平呈正相關(guān),因此,采用對利拉魯膚治療后的人肺血管平滑 肌細(xì)胞外環(huán)境乳酸水平的檢測,可W研究利拉魯膚對細(xì)胞糖酵解過程W及肺血管重構(gòu)的影 響。
[0102] 2、實驗方法
[0103] 平底透明96孔板培養(yǎng)人肺血管平滑肌細(xì)胞(第Ξ至五代)(L0NZA公司),細(xì)胞密度 約5000個/mL,每孔10化1,普通10%牛血清培養(yǎng)液,37攝氏度、5%C02培養(yǎng)過夜。移除陳舊培 養(yǎng)液,用含10%牛血清無生長因子的培養(yǎng)液配置PDGF(50ng/ml),PDGF(50ng/ml)+利拉魯膚 (50μΜ)溶液分別作為培養(yǎng)液,細(xì)胞分成對照組、表皮生長因子(PDGF)組及治療組(PDGF+利 拉魯膚),每組η = 6,37攝氏度、5 % C〇2培養(yǎng)72小時。實驗終點離屯、96孔板(100化pm,室溫5分 鐘),每孔分別取扣1上清測量各組細(xì)胞乳酸水平。依照廠家提供試劑及實驗方法步驟,另取 一空96孔板,分別放入不同濃度梯度的乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(Cayman化emical公司)及相對應(yīng)組 別每孔扣1細(xì)胞上清液,向所有各孔加入100μΙ反應(yīng)液后,將96孔板置于搖床室溫緩慢反應(yīng) 30分鐘。反應(yīng)30分鐘結(jié)束后,使用多功能微孔板檢測儀(Promega公司),49化m吸收峰讀數(shù)。 根據(jù)乳酸脫氨酶催化氧化乳酸反應(yīng)生成丙酬酸過程中形成NADH還原底物,利用乳酸標(biāo)準(zhǔn)樣 品,測量吸收峰490nm強(qiáng)度計算相應(yīng)乳酸水平。
[0104] 3、實驗結(jié)果
[0105] 經(jīng)利拉魯膚治療后的人肺血管平滑肌細(xì)胞外環(huán)境的乳酸水平為2.47±0.32mM,較 PDGF刺激增生的人肺血管平滑肌細(xì)胞外乳酸水平(3.12±0.54mM)顯著降低(P<0.05)。
[0106] 4、實驗結(jié)論
[0107] 利拉魯膚降低人肺血管平滑肌細(xì)胞糖酵解水平,表示利拉魯膚可調(diào)節(jié)肺血管的糖 代謝失衡,促進(jìn)葡萄糖代謝效率,進(jìn)而改善肺血管重構(gòu)。
[010引實施例7 GLP-1受體激動劑分子生物學(xué)實驗檢測
[0109] 1、實驗?zāi)康暮头椒?br>[0110] 為驗證上述利拉魯膚對肺動脈高壓的療效,W及對細(xì)胞增生W及葡萄糖代謝的影 響是否與AMPK通路激活并影響下游缺氧誘導(dǎo)因子及葡萄糖轉(zhuǎn)運體有關(guān),分別應(yīng)用蛋白質(zhì)印 記和免疫組織化學(xué)染色實驗檢測AMP時溝酸化水平、缺氧誘導(dǎo)因子直接相關(guān)的細(xì)胞缺氧標(biāo)記 物碳酸酢酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白1(W下亦簡稱Glut-1)。
[0111] (1 )Glut-l、pAMPK/AMPK 表達(dá)蛋白印記檢測
[0112] 新鮮肺組織取出后立即放入液氮保存,利用憐酸鹽裂解液(含lOOmM憐酸根,其中 憐酸氨二鐘:憐酸二氨鐘=3:1,ImM邸TA,ImM二硫蘇糖醇,蛋白酶抑制劑),電動低溫勻漿, 12000xg,4攝氏度離屯、20分鐘后保留上清液,并進(jìn)行蛋白定量后,可根據(jù)蛋白印記基本實驗 步驟進(jìn)行目的蛋白表達(dá)檢測。其中,一抗憐酸化AMPK及AMPK抗體(Cell Signalling公司)稀 釋濃度為1:1000,一抗葡萄糖轉(zhuǎn)運體蛋白1抗體(Abeam公司)稀釋濃度為1:1000,一抗均于4 攝氏度解育過夜;二抗為辣根過氧化氨酶標(biāo)記抗兔抗體(sigma公司),稀釋濃度為1:2000, 室溫解育1小時。抗體解育結(jié)束漂洗后,利用辣根過氧化氨酶化學(xué)發(fā)光法,采用高靈敏度化 學(xué)發(fā)光成像儀顯影(化emidoc,Bi〇-Rad公司),經(jīng)過Image J軟件分析圖像獲得數(shù)據(jù)。
[0113] (2)碳酸酢酶免疫組化染色(CA9)
[0114] 取出各組大鼠新鮮肺組織,浸泡在10%福爾馬林溶液中過夜,然后換70%乙醇保 存,石蠟包埋切片,根據(jù)免疫組織化學(xué)染色基本方法進(jìn)行碳酸酢酶肺組織切片染色。碳酸酢 酶一抗(Novus公司)稀釋濃度為1:100,4攝氏度解育過夜;二抗為辣根過氧化氨酶標(biāo)記抗兔 抗體(Sigma公司),稀釋濃度為1:200,室溫解育1小時??贵w解育結(jié)束后,經(jīng)辣根過氧化氨 酶-二氨基聯(lián)苯胺顯色,蘇木精伊紅染色后,酒精二甲苯脫水固定后封片。
[0115] 2、實驗結(jié)果和結(jié)論
[0116] 蛋白印記實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):利拉魯膚治療組較肺高壓組大鼠肺組織Glut-1表達(dá)有顯 著減少,pAMPK/AMPK比例明顯升高,提示AMPK憐酸化程度增高,AMPK通路被激活,且下游葡 萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)下降。
[0117] 免疫組化實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):碳酸酢酶在利拉魯膚治療組有顯著下降,提示利拉魯膚 治療后,AMPK通路下游缺氧誘導(dǎo)因子下調(diào),組織缺氧程度減輕(圖6,圖7)。
[0118] W上實驗結(jié)論表明,利拉魯膚能夠激活機(jī)體能量代謝核屯、通路AMPK,平衡肺血管 葡萄糖代謝,減輕細(xì)胞組織缺氧,從而改善肺高壓肺血管重構(gòu)病變,治療肺動脈高壓。
【主權(quán)項】
1. 胰高血糖素樣肽-1受體激動劑在制備治療肺動脈高壓藥物中的應(yīng)用。2. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,所述治療肺動脈高壓,是減輕肺血管重構(gòu)。3. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,所述治療肺動脈高壓,是抑制異常的細(xì)胞增生。4. 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,所述抑制異常的細(xì)胞增生是抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增生。5. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,所述治療肺動脈高壓,是降低細(xì)胞糖酵解水平。6. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,所述胰高血糖素樣肽-1受體激動劑,是具有對肺動脈細(xì)胞糖 代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)功能的胰高血糖素樣肽-1受體激動劑。7. 權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,所述胰高血糖素樣肽-1受體激動劑選自艾塞那肽 (exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、利西拉來(lixisenatide),阿必魯肽 (albiglutide),或杜拉魯肽(dulaglutide)。8. -種治療肺動脈高壓的藥物,其特征是,其活性成分是胰高血糖素樣肽-1受體激動 劑。9. 權(quán)利要求8所述的藥物,所述治療肺動脈高壓,是抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增生并減輕 肺血管重構(gòu)。10. 權(quán)利要求8所述的藥物,所述胰高血糖素樣肽-1受體激動劑選自艾塞那肽 (exenatide)、利拉魯肽(liraglutide)、利西拉來(lixisenatide),阿必魯肽 (albiglutide),或杜拉魯肽(dulaglutide)。
【文檔編號】A61P9/12GK105999272SQ201610526144
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月5日
【發(fā)明人】汪蕾, 方緯
【申請人】汪蕾, 方緯
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