專利名稱：編碼新的前列腺素受體蛋白的核酸及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
廣義而言，本發(fā)明涉及編碼前列腺素類受體家族中一名前所未知之成員的核酸分子。
背景技術(shù)：
前列腺素類激素，包括前列腺素(PG)、前列環(huán)素和血栓烷(TX)，是中央及外周生理效應(yīng)的重要介質(zhì)。前列腺素D2(PGD2)形成于各種組織，包括腦、胰臟、肺、骨髓、胃和皮膚以及肥大細(xì)胞之中(Lewis等人，1982)。PGD2與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中的許多生理活動(dòng)有關(guān)。據(jù)察，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，PGD2對(duì)睡眠之誘導(dǎo)、體溫、嗅覺功能、激素釋放和傷害感受都有影響。在外周，PGD2是免疫刺激后肥大細(xì)胞產(chǎn)生的花生四烯酸的主要環(huán)加氧酶產(chǎn)物。當(dāng)過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘、過(guò)敏性結(jié)膜炎和異位性皮炎患者受到局部過(guò)敏原刺激時(shí)，患者鼻和支氣管灌洗液、淚液和皮膚腔室液中的PGD2水平猛增。活化的肥大細(xì)胞，即PGD2的主要來(lái)源，是在諸如哮喘、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、過(guò)敏性皮炎和其它疾病中驅(qū)動(dòng)過(guò)敏反應(yīng)的主要因素之一(Brightling等人，2003)。PGD2還具有多種致炎作用，諸如增加結(jié)膜和皮膚的血管通透性、增大鼻氣道的阻力、加劇氣道縮小和嗜曙紅細(xì)胞滲入結(jié)膜和氣管等。因此，PGD2是驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)的主因之一。
人們?cè)缙诘呐χ塾趯?duì)五種天然發(fā)生的生物活性前列腺素類激素(PGD2、PGE2、PGF2α、PGI2和TXA2)鑒定不同的受體，結(jié)果得出了前列腺素類受體的五種基本類型分別為DP、EP、FP、前列環(huán)素(IP)和血栓烷(TP)受體(Coleman等人，1994)。前列腺素D2的許多作用都是以其對(duì)D型前列腺素受體(DP，即一種G蛋白偶聯(lián)受體)的作用來(lái)介導(dǎo)的。人們最初認(rèn)為，各前列腺素類激素優(yōu)先作用于單獨(dú)的受體，然而前列腺素類激素生物學(xué)研究人員開始理解這些配體與不同受體家族之成員作用的混雜性。因此，人們?cè)桨l(fā)明了，若要理解前列腺素類激素的信號(hào)傳遞，就必須澄清前列腺素類受體活化所帶來(lái)的生物學(xué)結(jié)果。
DP受體是人們尤為關(guān)注的對(duì)象，因?yàn)樗嬖谟谥醒牒屯庵芗?xì)胞之中，提示與各種生物途徑介導(dǎo)的活動(dòng)有關(guān)，因此可能對(duì)許多病癥都具有治療重要性。已經(jīng)在大腦中鑒定了DP受體，且PGD2對(duì)睡眠之誘導(dǎo)、體溫、嗅覺功能和激素釋放均有影響(Negishi等人，1993；Wright等人，1999及所附之參考文獻(xiàn))。在脊髓的不同離散細(xì)胞群中也發(fā)現(xiàn)了DP受體。該觀察可以解釋PGD2所誘導(dǎo)的痛覺過(guò)敏和異常性疼痛(有害觸覺刺激所造成的不適感)之不調(diào)和效應(yīng)。DP受體還存在于胃腸道中且與胃腸道之收縮反應(yīng)有關(guān)(Wright等人，1999 Ito等人；1989)。研究還表明，DP受體的配體可誘導(dǎo)粘液分泌和腸細(xì)胞的細(xì)胞增生。肝臟的糖原生成也可能受DP受體的調(diào)節(jié)(Ito等人，1989)。DP受體存在于眼中，其激動(dòng)劑可降低眼內(nèi)壓，這提示它也許對(duì)治療青光眼有作用。據(jù)查，含有DP受體和PGD2之血小板可抑制血小板聚集，這為DP受體可用來(lái)調(diào)節(jié)血液病(諸如血栓)提供了支持(Armstrong，1996)。因此，DP受體在不同器官和組織中的不同表現(xiàn)向我們揭示，它也許是在不同的治療領(lǐng)域中的吸引人的靶標(biāo)。
尤其重要的是DP受體與多種炎癥，包括但不限于哮喘、過(guò)敏性鼻炎、氣道機(jī)能亢進(jìn)、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎和慢性阻塞性肺病有關(guān)。有關(guān)證據(jù)證明PGD2是受到免疫刺激后的肥大細(xì)胞所釋放的主要前列腺素類激素(Roberts等人，1980)。在哮喘病領(lǐng)域，人們長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)定呼吸道上皮是驅(qū)動(dòng)哮喘病發(fā)展的炎癥細(xì)胞因子和趨化因子之主要來(lái)源(Holgate等人，2000)。在哮喘病的實(shí)驗(yàn)鼠模型中，受到抗原攻擊時(shí)，氣道上皮組織上DP受體受到急劇上調(diào)(Matsuoka等人，2000)。而缺乏DP受體的基因剔除小鼠之氣道機(jī)能亢進(jìn)和慢性炎癥，即人類哮喘病的兩個(gè)主要特征(Matsuoka等人，2000)卻明顯降低。同樣，豚鼠實(shí)驗(yàn)性哮喘模型表明，DP受體拮抗劑可減輕氣道發(fā)炎(Arimura等人，2001)。據(jù)悉，DP受體還與人類過(guò)敏性鼻炎有關(guān)，過(guò)敏性鼻炎是一種常見的過(guò)敏性疾病，特征是打噴嚏、搔癢rhinorea、和鼻道阻塞的癥狀。對(duì)鼻子局部施用PGD2導(dǎo)致鼻道阻塞的依賴劑量的增加(Doyle等人，1990)。研究表明，DP拮抗劑可有效減輕多種物種的過(guò)敏性鼻炎癥狀，具體而言，可抑制抗原誘導(dǎo)的鼻道阻塞(即過(guò)敏性鼻炎最明顯的癥狀)。在過(guò)敏性結(jié)膜炎和過(guò)敏性皮炎的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校珼P拮抗劑也有效(Arimura等人，2001)。因此，DP拮抗劑可用于治療多種PGD2介導(dǎo)的疾病，這些疾病包含但不限于支氣管哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增生癥和局部缺血性再灌注損傷。
迄今為止，已經(jīng)克隆了人DP受體(Boie等人，1995)、大鼠DP受體(Wright等人，1999)和小鼠DP受體(Hirata等人，1994)。人、大鼠和小鼠的這些DP受體在氨基酸水平上具有73-90％的同源性，在各個(gè)情況下，活化重組受體會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的累積。對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的一般觀察表明，化合物的功效因直向同源受體(orthologue receptor)不同而異。
本文首次公開的是豚鼠DP受體。相比本領(lǐng)域當(dāng)前已知的，本發(fā)明具有幾個(gè)優(yōu)勢(shì)。小鼠、大鼠、人類和豚鼠的物種差異現(xiàn)在可得到更全面的確定和表征。DP受體在天然組織中的低表達(dá)水平使得難以評(píng)價(jià)化合物作為該受體的調(diào)節(jié)劑、效應(yīng)物、激動(dòng)劑或拮抗劑的活性。本發(fā)明現(xiàn)在提供了檢查分離和純化條件下的受體，提供了測(cè)試化合物的能力然后將體外研究和相同物種體內(nèi)研究聯(lián)系起來(lái)的機(jī)會(huì)。豚鼠體格較大，因此是比較小的嚙齒動(dòng)物優(yōu)選的動(dòng)物模型，例如，它能夠提供更大的表面積供皮膚病學(xué)和胃腸道研究。更為重要的是，就一些過(guò)敏模型(諸如鼻充血模型)而言，豚鼠是最有用的小動(dòng)物模型，并且對(duì)氣道機(jī)能亢進(jìn)調(diào)節(jié)更有反應(yīng)。盡管豚鼠是評(píng)估多種疾病模型中DP受體調(diào)節(jié)劑的理想臨床前模型(如上所述)，但豚鼠DP受體的克隆還未曾報(bào)導(dǎo)，因此難以預(yù)測(cè)化合物對(duì)該直向同源物的親和性。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了本發(fā)明受體的核酸序列(SEQ ID NO1)。
圖2顯示了本發(fā)明受體的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3顯示了多個(gè)物種間DP受體的編碼序列的比對(duì)。涂陰影的殘基與豚鼠的完全匹配。Hs＝人；Rn＝大鼠；Mm＝小鼠；及Cp＝豚鼠。
圖4顯示了多個(gè)物種間DP受體的氨基酸序列的比對(duì)。涂陰影殘基與豚鼠的殘基完全匹配。Hs＝人；Rn＝大鼠；Mm＝小鼠；及Cp＝豚鼠。
圖5顯示了豚鼠(cavia procellus)DP受體的基因組DNA片斷的RNA印跡分析。泳道1Invitrogen 0.24-9.5Kb RNA梯；泳道2來(lái)自未受刺激的豚鼠的總肺RNA；泳道3來(lái)自卵白蛋白刺激的豚鼠的總肺RNA。
圖6顯示了與用小鼠DP受體產(chǎn)生的等同細(xì)胞系和親代細(xì)胞系相比，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293-Gα16細(xì)胞中表達(dá)的重組豚鼠DP受體的PGD2誘導(dǎo)的鈣動(dòng)員的實(shí)例。
圖7顯示了用SPA cAMP測(cè)定得出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK-293-Gα16細(xì)胞中表達(dá)的重組豚鼠DP受體的PGD2劑量反應(yīng)曲線的實(shí)例。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及代表但不限于前列腺素類受體家族的分離的核酸和蛋白質(zhì)形式。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該分離的核酸和蛋白質(zhì)代表豚鼠DP受體。本發(fā)明的各個(gè)方面在下面章節(jié)詳細(xì)敘述。
定義本文所用的“核酸分子”是指具有單鏈或雙鏈螺旋形式的核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷，“RNA”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧尿苷或脫氧胞苷，“DNA”)的磷酸酯聚合物形式或其任意磷酯類似物，如硫代磷酸酯和硫酯。核酸分子可包括脫氧核糖核酸分子(DNA)，諸如基因組DNA和互補(bǔ)DNA(cDNA)，其可以是編碼或非編碼的單鏈或雙鏈的、合成的DNA，還可以包括單鏈或雙鏈核糖核酸(RNA)分子和使用核苷酸類似物生成的DNA和RNA的類似物。也有可能是雙鏈DNA:DNA、DNA:RNA和RNA:RNA螺旋。
本文所用的“分離”或“純化”的核酸分子是指已與該核酸天然來(lái)源中的其它核酸分開的核酸分子。優(yōu)選地，該“分離”的核酸不帶在該核酸的來(lái)源生物的基因組DNA中天然地在該核酸側(cè)翼(即位于該核酸5’和3’端的序列)的序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)編碼序列)。在多種實(shí)施方案中，該分離的核酸分子可包含本發(fā)明核苷酸分子側(cè)翼的少于約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。例如，這些側(cè)翼核苷酸序列可以是與該核酸來(lái)源細(xì)胞的基因組DNA中該核苷酸分子天然側(cè)翼的序列。當(dāng)核酸基本從其內(nèi)源環(huán)境除去而可以由技術(shù)人員操作時(shí)，可以認(rèn)為該核酸是分離的，所述操作為諸如核苷酸測(cè)序、限制性切割、定點(diǎn)誘變和亞克隆到表達(dá)載體中。核酸可存在于全細(xì)胞或細(xì)胞裂解物中或以部分純化或基本純化的形式存在。從細(xì)胞中純化出來(lái)的核酸基本不帶其它細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基。化學(xué)合成的核酸當(dāng)基本上無(wú)化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)時(shí)是純化的。
術(shù)語(yǔ)“重組的”，當(dāng)與多肽相關(guān)使用時(shí)，是指由重組多核苷酸(即分離或純化(如上定義)或不在其天然狀態(tài)的多核苷酸)翻譯的多肽。該術(shù)語(yǔ)包括例如被含克隆載體或表達(dá)載體的細(xì)胞表達(dá)或含于所述細(xì)胞中的多肽，以及合成多肽。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)劑”是指調(diào)節(jié)本發(fā)明受體蛋白的活性的部分，例如但不限于配體和候選化合物。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑可以是激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、拮抗劑或逆向激動(dòng)劑。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”是指與受體結(jié)合時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)或加強(qiáng)GTP與膜的結(jié)合的部分(例如但不限于配體和候選化合物)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“部分激動(dòng)劑”是指與受體結(jié)合時(shí)激活細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)但激活程度小于激動(dòng)劑；或加強(qiáng)GTP與膜的結(jié)合但程度低于激動(dòng)劑的部分(例如但不限于配體和候選化合物)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“拮抗劑”是指與激動(dòng)劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合受體同一部位的部分(例如但不限于配體和候選化合物)。但是拮抗劑并不激活受體的活性形式所引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，從而可以抑制激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑所引起的細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。在相關(guān)方面，拮抗劑并不減弱激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑不存在時(shí)的基線細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“逆向激動(dòng)劑”是指與組成性活化受體結(jié)合并抑制基線細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的部分(例如但不限于配體和候選化合物)。所述基線反應(yīng)由活化形式的受體引起，它低于不存在激動(dòng)劑或部分激動(dòng)劑，或者GTP與膜的結(jié)合減弱時(shí)觀察到的正?；A(chǔ)水平。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“候選化合物”是可用于篩選技術(shù)的部分(例如但不限于化合物)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語(yǔ)不包括公眾已知的選自激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、逆向激動(dòng)劑或拮抗劑的化合物。候選化合物通過(guò)常規(guī)的藥物發(fā)現(xiàn)方法鑒定，所述方法包括鑒定受體特異的內(nèi)源配體，和/或針對(duì)受體來(lái)篩選候選化合物，其中這種篩選競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定來(lái)評(píng)估功效。
本文所用的“組成性活化受體”或“自主性活化受體”在本文中可互相換用，該術(shù)語(yǔ)是指不存在配體時(shí)活化的受體。此類組成性活化受體可以是內(nèi)源的或非內(nèi)源的(即通過(guò)重組方法修飾GPCR以產(chǎn)生野生型GPCR的突變的組成性形式。例如見EP1071701、WO00/22129、WO00/22131和美國(guó)專利號(hào)6,150,393和6,140,509，這些文獻(xiàn)的全文特此作為參考納入本文)。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“組成性受體的活化”是指用受體與內(nèi)源配體或其化學(xué)等同物結(jié)合之外的方法穩(wěn)定活化狀態(tài)的受體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“配體”是指可與另一分子結(jié)合的部分，其中所述部分包括但當(dāng)然不限于激素或神經(jīng)遞質(zhì)，更進(jìn)一步而言，該部分立體選擇性結(jié)合受體。
本文所用的術(shù)語(yǔ)“家族”，當(dāng)涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)或核酸分子時(shí)，是指具有表面上共同的結(jié)構(gòu)域并且具有如本文定義的足夠氨基酸或核苷酸序列同一性的兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)或核酸分子。此類家族成員可以是天然發(fā)生的并且可以來(lái)自同種或異種。例如，家族可包含源于人類的第一種蛋白質(zhì)和源于鼠的該蛋白質(zhì)的同源物，以及，源于人類的第二種、不同的蛋白質(zhì)和該第二種蛋白質(zhì)的鼠同源物。家族的成員還可以具有相同的功能特性。
術(shù)語(yǔ)“活性”、“生物活性”和“功能活性”在本文中可相互換用，它們是指由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體外或活體內(nèi)確定的本發(fā)明蛋白質(zhì)、核苷酸或核酸分子對(duì)效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮的活性?；钚钥梢允侵苯踊钚?諸如與第二種蛋白質(zhì)的結(jié)合或?qū)Φ诙N蛋白質(zhì)的酶促催化)或間接活性(諸如以本發(fā)明蛋白質(zhì)與另一蛋白質(zhì)相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳遞活性)。在某一具體實(shí)施方案中，活性包含但不限于下述活性至少一種或多種(i)在信號(hào)途徑中與蛋白質(zhì)相互作用的能力；(ii)與配體相互作用的能力；及(iii)與細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的能力。
此外，根據(jù)本發(fā)明，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)、微生物學(xué)和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中詳細(xì)說(shuō)明，見Sambrook，F(xiàn)ritsch& Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(在此稱作“Sambrook等人，1989”)；DNA CloningA Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins，eds.(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，ed.(1986)]；Immobilized CellsAnd Enzymes[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel et al.(eds.)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1994)。
“載體”是復(fù)制子，諸如質(zhì)粒、噬菌體或黏粒，在此僅列舉幾例，可以向載體連接另一DNA片段從而引起該連接的片段復(fù)制。“復(fù)制子”是作為體內(nèi)DNA復(fù)制的自主單位(即能夠進(jìn)行自控復(fù)制)的遺傳元件(例如質(zhì)粒、染色體、病毒)。載體的具體實(shí)例將在后文中說(shuō)明。
“盒”是指可插入載體中特定限制性位點(diǎn)的DNA片段。該DNA片段編碼目的多肽，并且涉及該盒和限制性位點(diǎn)用于確保該盒插入正確的讀框以供轉(zhuǎn)錄和翻譯。
當(dāng)外源或異源DNA被導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，該細(xì)胞即受到“轉(zhuǎn)染”。當(dāng)被轉(zhuǎn)染的DNA產(chǎn)生表型改變時(shí)，該細(xì)胞已經(jīng)受到外源或異源DNA的“轉(zhuǎn)化”。優(yōu)選地，將轉(zhuǎn)化的DNA整合到(通過(guò)共價(jià)鍵)組成細(xì)胞基因組的染色體DNA。
“異源”DNA是指非天然存在于細(xì)胞或細(xì)胞染色體位點(diǎn)中的DNA。優(yōu)選地，異源DNA包括細(xì)胞外來(lái)的基因。
“同源重組”是將載體的外來(lái)DNA序列插入染色體。具體而言，該載體靶定特定的染色體位點(diǎn)以進(jìn)行同源重組。對(duì)于特定的同源重組，載體將含有與染色體序列同源的足夠長(zhǎng)的區(qū)域供互補(bǔ)結(jié)合和載體向染色體的摻入。同源區(qū)越長(zhǎng)且序列相似性程度越大，同源重組的效率就越高。
分離的核酸分子本發(fā)明的一方面涉及編碼本發(fā)明的受體蛋白質(zhì)或者其部分的分離的或經(jīng)純化的核酸分子?？砂幢景l(fā)明所提供的序列信息，采用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物技術(shù)來(lái)分離本發(fā)明的核酸分子或該核酸序列的互補(bǔ)序列。以SEQ NO1的核酸的全部或部分作為雜交探針，采用標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技術(shù)，即可分離本發(fā)明的核酸分子(Sambrook等人，1989)。相應(yīng)于SEQ ID NO1的寡核苷酸或其片段可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)(諸如采用DNA自動(dòng)合成儀)合成。本發(fā)明的核酸分子或其部分的擴(kuò)增可以采用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)，以cDNA、mRNA、或基因組DNA為模板并利用適當(dāng)?shù)墓押塑账嵋飦?lái)進(jìn)行。
本發(fā)明的核酸分子可包含SEQ ID NO1的一部分。該核酸片段可用作探針或引物或該片段可以編碼蛋白質(zhì)片段，其可以是或不是受體的生物活性部分，諸如配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，第七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中的精氨酸據(jù)悉是前列腺素類分子羧基的結(jié)合位點(diǎn)(Narumiya等人，1993)，小鼠第二個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的Lys-75和Leu-83賦予配體結(jié)合特異性(Kobayashi等人，2000)。這兩段序列據(jù)前人報(bào)導(dǎo)在列腺素類家族中特征性地保守(Hirata等人，1994)并且也存在于豚鼠DP蛋白質(zhì)中第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)中的QYCPGTWCR和第七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中RFLSVISIVDPWIFI在所有DP直向同源物中都是相同的。SEQ ID NO1的核苷酸序列允許產(chǎn)生探針和引物來(lái)鑒定和/或克隆本發(fā)明的受體或細(xì)胞、組織和器官中的同源物。寡核苷酸通常包含一個(gè)核苷酸序列區(qū)，該核苷酸序列區(qū)在嚴(yán)格條件下與SEQ IDNO1的有義或反義序列或SEQ ID NO1的天然或人工突變的至少10個(gè)、優(yōu)選約12個(gè)，更優(yōu)選25、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。該探針可包含附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如放射性同位素、熒光化合物、酶或酶輔因子。該探針可以是試劑盒的部分，用來(lái)鑒定編碼所述核酸的細(xì)胞或組織、檢測(cè)mRNA水平或確定基因組基因是否已經(jīng)突變或缺失。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及與SEQ ID NO1具有90％同源性的分離的核酸分子?？衫眯蛄袛?shù)據(jù)庫(kù)所提供的標(biāo)準(zhǔn)軟件，采用默認(rèn)參數(shù)通過(guò)比較序列，或在DNA雜交中在為特定系統(tǒng)確定的嚴(yán)格條件下可以鑒定基本同源的序列。確定適當(dāng)?shù)碾s交條件在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。見例如Maniatis等人，上文；DNA Cloning，Vols.I & II，上文；Nucleic Acid Hybridization，上文。
由于天然等位基因變異，種群內(nèi)可以存在DNA序列多態(tài)性。等位基因是在給定基因座上備選發(fā)生的一組基因。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因”和“重組基因”是指包含編碼本發(fā)明的受體蛋白質(zhì)，優(yōu)選豚鼠受體蛋白質(zhì)的可讀框的核酸分子。本文所用的短語(yǔ)“等位基因變體”是指在基因座上發(fā)生的核苷酸序列或是指該核苷酸序列編碼的多肽。通過(guò)測(cè)序許多不同個(gè)體中的目標(biāo)基因可鑒定備選等位基因。任何和所有這些核苷酸變異及由此而來(lái)的氨基酸多態(tài)性，或因自然等位基因變異所導(dǎo)致的變異及不改變本發(fā)明受體的功能活性的變異均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
通過(guò)分離編碼具有本發(fā)明受體的生物活性的多肽的SEQ ID NO1的一部分可以制備編碼“生物活性”或“生物相關(guān)的”的部分的核酸片段。例如，表達(dá)配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的受體蛋白質(zhì)的編碼部分(例如通過(guò)體外重組表達(dá))，然后評(píng)估該受體編碼部分的活性。本發(fā)明還包含鑒于遺傳密碼簡(jiǎn)并性雖不同于SEQ ID NO1所表示的核苷酸序列但卻編碼同一蛋白質(zhì)的核酸分子。例如，發(fā)明人鑒定出兩個(gè)可能的N糖基化位點(diǎn)，即氨基末端的Asn-7和第一個(gè)胞外環(huán)中的Asn-86。另外，還鑒定出兩個(gè)可能的蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點(diǎn)，即分別位于第一和第三胞質(zhì)環(huán)中的Ser-46和Thr-140。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，除了天然的等位基因變體之外，編碼特定氨基酸的各密碼子還具有大量的冗余性。因此，本發(fā)明涉及編碼包括備選密碼子的RNA的那些DNA序列或者編碼備選密碼子的RNA序列，所述序列編碼與SEQ NO2所表示的相同氨基酸序列或者其部分的最終翻譯。本領(lǐng)域眾所周知，以下密碼子可互換使用以編碼特定氨基酸苯丙氨酸(Phe或F) UUU或UUC亮氨酸(Leu或L)UUA或UUG或CUU或CUC或CUA或CUG異亮氨酸(Ile或I) AUU或AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M) AUG纈氨酸(Val或V)GUU或GUC或GUA或GUG絲氨酸(Ser或S)UCU或UCC或UCA或UCG或AGU或AGC脯氨酸(Pro或P)CCU或CCC或CCA或CCG蘇氨酸(Thr或T)ACU或ACC或ACA或ACG丙氨酸(Ala或A)GCU或GCG或GCA或GCG酪氨酸(Tyr或Y)UAU或UAC組氨酸(His或H)CAU或CAC谷氨酰胺(Gln或Q) CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC賴氨酸(Lys或K)AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC谷氨酸(Glu或E)GAA或GAG半胱氨酸(Cys或C) UGU或UGC精氨酸(Arg或R)CGU或CGC或CGA或CGG或AGA或AGG甘氨酸(Gly或G)GGU或GGC或GGA或GGG
色氨酸(Trp或W) UGG終止密碼子 UAA或UAG或UGA在此需要明確指出，以上所列為RNA序列的密碼子，相應(yīng)于DNA的密碼子中用T代替U。
本領(lǐng)域技術(shù)人員還理解可通過(guò)突變向SEQ ID NO1中引入改變而不改變編碼蛋白質(zhì)的生物活性?！胺潜匦琛卑被釟埢遣煌谝吧托蛄?例如SEQ ID NO2所表示的序列)卻不造成生物活性改變的殘基，而“必需”氨基酸殘基是生物活性所必需的殘基。因此，在一些物種間不保守或半保守的氨基酸殘基可以是非必需的并且可能是作為變異的目標(biāo)。因此，本發(fā)明的另一方面涉及編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸分子，其含有不是活性必需的氨基酸殘基改變。此類蛋白質(zhì)的氨基酸序列雖不同于SEQ ID NO1，但其保持生物活性。欲制備編碼具有不同于SEQ ID NO2的序列的蛋白質(zhì)的核酸，可將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、加入或缺失引入SEQ ID NO1的核苷酸序列。
可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)引入突變，所述技術(shù)為諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變。優(yōu)選地，在一個(gè)或更多預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基進(jìn)行保守氨基酸替代?！氨Ｊ匕被崽娲笔侵笇被釟埢镁哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基替代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中是確定的。例如，所述家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β分枝的側(cè)鏈氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)以及芳香族側(cè)鏈氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。下文例3提供了豚鼠受體的序列分析，其對(duì)豚鼠、人類、大鼠和小鼠的序列進(jìn)行了比較，為選擇非必需氨基酸提供了指導(dǎo)。因此，預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基將優(yōu)選為來(lái)自同一側(cè)鏈家族的另一氨基酸所替代。備選地，還可通過(guò)諸如飽和誘變沿著編碼區(qū)或其部分隨機(jī)引入突變，然后對(duì)所得突變體篩選生物活性以鑒定保留了活性的突變體。誘變后，編碼蛋白質(zhì)可重組表達(dá)，并測(cè)定蛋白質(zhì)的活性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以對(duì)突變蛋白質(zhì)測(cè)定形成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的能力(諸如與前列腺素類信號(hào)途徑中的蛋白質(zhì)相互作用)；結(jié)合配體(諸如結(jié)合前列腺素類受體的配體)的能力；或結(jié)合細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白質(zhì)的能力。本發(fā)明還涉及具有診斷、治療或預(yù)防用途并且將用于篩選受體功能的激動(dòng)劑、拮抗劑或調(diào)節(jié)劑的天然或突變的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段。
可以改變編碼肽的核苷酸序列以編碼具有與天然發(fā)生的肽的不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)，諸如改變配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和性或調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1的核酸序列或者其部分的改變，所述改變修飾所述蛋白質(zhì)的生物活性。
分離的核酸分子的雜交在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度下，單鏈形式的核酸分子可與另一核酸分子退火時(shí)，該核酸分子與所述另一核酸分子，諸如cDNA、基因組DNA或RNA是“可雜交的”(見Sambrook等人，上文)。溫度和離子強(qiáng)度條件決定了雜交的“嚴(yán)格性”。低嚴(yán)格性雜交條件相應(yīng)于55℃的Tm(例如，5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.1％的十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.25％奶且不含甲酰胺；或30％甲酰胺、5×SSC，0.5％的SDS)。中度嚴(yán)格雜交條件相應(yīng)于較高的Tm(例如，40％甲酰胺，與5倍或6倍的SSC等)。高度嚴(yán)格雜交條件相應(yīng)于最高的Tm(例如，50％的甲酰胺，5倍或6倍的SSC等)。雜交需要兩個(gè)核酸含有互補(bǔ)序列，盡管取決于雜交的嚴(yán)格性，但是堿基之間的錯(cuò)配是可能的。雜交核酸的適當(dāng)嚴(yán)格性取決于核酸的長(zhǎng)度和互補(bǔ)程度(本領(lǐng)域公知的變量)。兩個(gè)核苷酸序列之間的相似性或同源性程度越大，具有這些序列的核酸雜合分子的Tm值越大。核酸雜交的相對(duì)穩(wěn)定性(相應(yīng)于較高的Tm)按以下順序減小RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。對(duì)于長(zhǎng)于100個(gè)核苷酸的雜合分子，已經(jīng)推導(dǎo)了計(jì)算Tm的方程(見上述Sambrook等人，9.50-9.51。對(duì)于較短核酸(即寡核苷酸)的雜交，錯(cuò)配的位置則愈加重要，且寡核苷酸的長(zhǎng)度決定了其特異性(見上述Sambrook等人，11.7-11.8)。可雜交的核酸分子的最小長(zhǎng)度至少約20個(gè)核苷酸，特別地至少約30個(gè)核苷酸，更特別地至少約40個(gè)核苷酸，更特別地至少約50個(gè)核苷酸，更特別地至少約60個(gè)核苷酸。
在特定實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”是指Tm為55℃和利用上文所述條件。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tm為60℃；在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，Tm為65℃。
在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的可雜交的核酸分子長(zhǎng)為至少300、325、350、375、400、425、450、500、550、600、650、700、800、900或1000個(gè)核苷酸，該核酸分子在嚴(yán)格條件下與包含核苷酸序列，優(yōu)選SEQ ID NO1的編碼序列、其互補(bǔ)序列或其片段的核酸分子雜交。術(shù)語(yǔ)“在嚴(yán)格條件下雜交”意在描述雜交和清洗條件，在所述條件下，相互至少55％、60％、65％、70％和優(yōu)選75％或更高互補(bǔ)性的核苷酸通常保持雜交。這些嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以見“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選的非限制性實(shí)例是在約45℃6X SSC下雜交，然后于50-65℃下以0.2X SSC、0.1％SDS清洗一次或多次。優(yōu)選地，在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1的序列或其互補(bǔ)序列雜交的本發(fā)明的的分離的核酸分子對(duì)應(yīng)于天然發(fā)生的核酸分子。本文所用的“天然發(fā)生的”核酸分子是指具有天然發(fā)生的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如編碼天然蛋白質(zhì))。技術(shù)人員將理解可以關(guān)于序列特異性變量(例如，長(zhǎng)度、G-C豐度等)修改所述條件。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1所表示序列的部分雜交的本發(fā)明的分離的核酸分子可用作探針或引物。探針/引物通常包含基本上純化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含核苷酸序列區(qū)，該序列區(qū)在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的天然發(fā)生的突變體的有義或反義序列的至少約12個(gè)、優(yōu)選約25個(gè)、更優(yōu)選約50、75、100、125、150、175、200、250、300、350或400個(gè)相鄰核苷酸雜交。
反義核酸分子本發(fā)明包含反義核酸分子，即與編碼蛋白質(zhì)的有義核酸互補(bǔ)(例如，與雙鏈cDNA分子的編碼鏈互補(bǔ)或與mRNA序列互補(bǔ))的分子。反義核酸可通過(guò)氫鍵與有義核酸結(jié)合。該反義核酸可與SEQ ID NO1所表示的整個(gè)核酸序列或其部分互補(bǔ)。根據(jù)本文公開的編碼鏈序列(例如SEQ ID NO1)，本發(fā)明的反義核酸可根據(jù)Watson & Crick堿基配對(duì)原則設(shè)計(jì)。反義寡核苷酸可以長(zhǎng)為例如約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的反義核酸可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法以化學(xué)合成和酶促連接來(lái)構(gòu)建。例如，反義核酸(如反義寡核苷酸)可以化學(xué)合成的方式采用天然發(fā)生的核苷酸或各種經(jīng)化學(xué)修飾(以期增加分子的生物穩(wěn)定性或提高反義和有義核酸分子之間形成的雙鏈體的物理穩(wěn)定性)的核苷酸來(lái)制備，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物、磷酸酯衍生物及吖啶取代的核苷酸。
用于制備反義核酸的修飾核苷酸的實(shí)例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷(queosine)、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-乙醇酸、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-乙醇酸甲基酯、尿嘧啶-5-乙醇酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。另外，反義核酸還可以生物方式，利用表達(dá)載體來(lái)制備，所述表達(dá)載體中已經(jīng)以反義方向亞克隆了核酸(即從插入的核酸轉(zhuǎn)錄的RNA將是目的靶核酸的反義方向)。
通常將本發(fā)明的反義核酸分子施于受試者或原位產(chǎn)生，以便與編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞mRNA和/或基因組DNA雜交或結(jié)合以抑制轉(zhuǎn)錄和/或翻譯，從而抑制蛋白質(zhì)的表達(dá)。雜交可通過(guò)常規(guī)的核苷酸互補(bǔ)形成穩(wěn)定的雙鏈體，或例如，對(duì)與DNA雙鏈體結(jié)合的反義核酸分子而言，雜交是通過(guò)DNA雙螺旋大溝內(nèi)的特異性作用或與調(diào)控區(qū)的作用。
本發(fā)明的反義核酸分子的施用途徑的實(shí)例包括在組織部位直接注射。另外，還可以修飾反義核酸分子以靶定選定的細(xì)胞，然后進(jìn)行全身施用。例如，對(duì)于全身施用，可修飾反義核酸分子使之特異結(jié)合表達(dá)于選定細(xì)胞表面的受體或抗原，例如通過(guò)反義核酸分子與結(jié)合細(xì)胞表面受體或抗原的肽或抗體連接。反義核酸分子還可以通過(guò)本文所述的載體遞送到細(xì)胞。為了使反義核酸分子在細(xì)胞內(nèi)達(dá)到足夠的濃度，優(yōu)選的載體構(gòu)建體中反義核酸分子被置于強(qiáng)Pol II或Pol III啟動(dòng)子的控制下。
本發(fā)明的反義核酸分子可以是α-異頭核酸分子。α-異頭核酸分子與相互平行的鏈中的互補(bǔ)RNA形成特異雙鏈雜合分子(Gaultier等人，NucleicAcids Res(1987)156625-6641)。反義核酸分子還可以包含甲基核糖核苷酸(Inoue等人，Nucleic Acids Res(1987)156131-6148)或嵌合的RNA-DNA類似物(Inoue等人，F(xiàn)EBS Lett(1987)215327-330)。
核酶本發(fā)明還包含核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能夠切斷單鏈核酸，諸如與核酶雜交的mRNA。因此，核酶(例如錘頭核酶(見Haselhoff等人，Nature(1988)334585-591))可用來(lái)催化切割核酸轉(zhuǎn)錄物，因此而抑制相應(yīng)于SEQ ID NO1的mRNA的翻譯?？筛鶕?jù)SEQID NO1所表示的核苷酸序列來(lái)設(shè)計(jì)對(duì)SEQ ID NO1的核酸特異的核酶。例如，可根據(jù)已知的SEQ ID NO1序列來(lái)構(gòu)建Tetrahymena L-19 IVSRNA的衍生物，使活性位置的核苷酸序列與待切之核苷酸序列互補(bǔ)(美國(guó)專利號(hào)4,987,071和5,116,742，其內(nèi)容特此作為參考引入本文)。另外，SEQ ID NO1所表示的核酸序列還可用來(lái)從RNA分子群中選擇具有特異核糖核酸酶活性的催化性RNA。(Bartel等人，Science(1993)2611411-1418。
三螺旋核酸分子和肽核酸本發(fā)明還包含形成三螺旋結(jié)構(gòu)的核酸分子。例如，為了抑制基因的表達(dá)，可以靶定與SEQ ID NO1調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子區(qū)域)互補(bǔ)的核酸序列，使其形成三螺旋結(jié)構(gòu)，從而防止目標(biāo)細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄，一般見Helene，Anticancer Drug Des(1991)6(6)569；Helene Ann NY Acad Sci(1992)66027和Maher，Bioassays(1992)14(12)807。
在特定實(shí)施方案中，本發(fā)明核酸分子可以在堿基部分、糖部分或磷酸酯主鏈?zhǔn)艿叫揎椧蕴岣呃绶肿拥姆€(wěn)定性、雜交或溶解性。例如，可修飾核酸的脫氧核糖磷酸酯主鏈來(lái)生成肽核酸(見Hyrup等人，Bioorganic &Medicinal Chemistry(1996)45)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽核酸”或“PNA”是核酸模擬物，例如DNA模擬物，其中脫氧核糖磷酸酯主鏈被換成假肽主鏈且僅有四種天然核堿基被保留下來(lái)。據(jù)察，PNA的中性主鏈可允許DNA和RNA的特異雜交在低離子強(qiáng)度下進(jìn)行。PNA寡聚物的合成可根據(jù)上述Hyrup等人(1996)；Perry-O’Keefe等人，Proc Natl Acad Sci USA(1996)9314670中所述的標(biāo)準(zhǔn)固相肽合成法進(jìn)行。
PNA可用于治療和診斷應(yīng)用。例如，PNA可作為基因表達(dá)的序列特異性調(diào)節(jié)的反義或抗基因試劑，用來(lái)例如誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制或抑制復(fù)制。還可以使用本發(fā)明的PNA。PNA可用來(lái)例如通過(guò)PNA引導(dǎo)的PCR鎖止(clamping)分析基因中單個(gè)堿基對(duì)突變；當(dāng)與其它酶(例如S1核酸酶(上述Hyrup等人(1996))聯(lián)用時(shí)，PNA還可作為人工限制酶，或作為DNA序列和雜交的探針或引物(上述Hyrup等人(1996))；上述Perry-O’Keefe等人(1996)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的PNA通過(guò)結(jié)合親脂性或其它輔助基團(tuán)、形成PNA-DNA嵌合體，或使用脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其它藥物遞送技術(shù)而受到修飾，例如增強(qiáng)穩(wěn)定性、特異性或細(xì)胞攝入。PNA-DNA嵌合體的合成如上述Hyrup等人(1996)；Finn等人，Nucleic Acids Res(1996)24(17)3357-63；Mag等人，Nucleic Acids Res(1989)175973；和Peterser等人，Bioorganic Med Chem Lett(1975)51119描述。
RNA/核酸干擾RNA干擾(RNAi)或核酸干擾(NAi)是以短干擾RNA(siRNA)或短干擾核酸(siNA)介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過(guò)程。認(rèn)為該過(guò)程是進(jìn)化保守的防御機(jī)制，通過(guò)該機(jī)制，例如，由于病毒感染產(chǎn)生的雙鏈RNA(dsRNA)或雙鏈核酸(dsNA)刺激稱作切酶的核糖核酸酶III的活性(Berstein等人，2001，Nature 409363)。例如，切酶將dsRNA處理成siRNA。切酶可以參與切割涉及翻譯控制的21-和22-核苷酸的小時(shí)序RNA(stRNA)。RNAi反應(yīng)還涉及內(nèi)切核酸酶復(fù)合體(即RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC))，該復(fù)合體切割具有與siRNA反義鏈互補(bǔ)的序列的目標(biāo)單鏈RNA。(Elbashir等人，2001，GenesDev.，15188)。為取得有效的RNAi或NAi，基于長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成和序列對(duì)siRNA、dsRNA、siNA或dsNA的最佳設(shè)計(jì)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見例如Chiu and Rana等人，2003，RNA 91034-48；Elbashir等人，2001；Parish等人，2000；PCT公開號(hào)WO 03/070744，WO01/75164，WO 01/68836，WO 01/49844，WO 01/36646，WO 01/29058，WO00/44914，WO 00/01846，WO 99/32619，WO 99/07409，WO 99/53050；加拿大專利申請(qǐng)?zhí)?,359,180，其內(nèi)容引入本文作為參考)。為提高活性而采取的對(duì)siNA或dsNA的一些可能的修飾包括但不限于3’端二核苷酸突出端，用2’-脫氧核苷酸(2’-H)取代siNA的一條或兩條鏈，以脫氧核糖核苷酸取代siNA雙鏈體的3’端核苷酸突出片段，修飾磷酸酯-糖主鏈或核苷以包括氮或硫雜原子的至少一種，2’-氨基或2’-O-甲基核苷酸和在dsRNA構(gòu)建體中含2’-O或4’-C亞甲基橋，以及取代有義和反義鏈中的4-硫代尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶和3-(氨基烯丙基)尿嘧啶。PCT公開號(hào)WO 01/68836描述了使用內(nèi)源得到的dsRNA來(lái)減弱基因表達(dá)的方法。另外，已經(jīng)提出靶定RNAi的mRNA作為模板從5’到3’合成靶定一種細(xì)胞類型中的一種基因的新的dsRNA并可以導(dǎo)致在不同細(xì)胞類型中表達(dá)的另一基因的RNAi介導(dǎo)的沉默，即稱作傳遞RNAi的現(xiàn)象(Alder等人，2003rna 925)。
蛋白質(zhì)本發(fā)明涉及包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的分離的多肽，其變體、其片段、其類似物或衍生物。
欲制備編碼含有具有不同于SEQ ID NO2的序列(例如變體)的本發(fā)明蛋白質(zhì)的分離的核酸分子，可將一個(gè)或多個(gè)核苷酸替代、加入或缺失引入SEQ ID NO1的核苷酸序列，從而將一或多個(gè)氨基酸替代、加入或缺失引入編碼的蛋白質(zhì)。例如，豚鼠DP蛋白質(zhì)中第一和第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)分別短了三個(gè)和五個(gè)氨基酸，而在小鼠、人類和大鼠DP蛋白質(zhì)中這些胞內(nèi)環(huán)都具有相同大小。因此我們可以將其它任何直向同源物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)或多個(gè)核苷酸插入而產(chǎn)生SEQ ID NO2的變體。
在特定實(shí)施方案中，可以分析本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)(1)與信號(hào)途徑中的蛋白質(zhì)形成蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的能力；(2)結(jié)合配體的能力；(3)與細(xì)胞內(nèi)靶蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，或(4)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化或細(xì)胞應(yīng)答的能力。
可采用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞純化技術(shù)，通過(guò)適當(dāng)?shù)募兓桨笇⒈景l(fā)明的天然蛋白質(zhì)從細(xì)胞或組織中分離出來(lái)。備選地，可以利用重組DNA技術(shù)來(lái)容易地產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)。在另一個(gè)備選實(shí)施方案中，還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)肽合成技術(shù)化學(xué)合成本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性部分或片段包括肽，該肽包含與SEQ IDNO2的氨基酸序列基本相同或來(lái)自SEQ ID NO2的氨基酸序列的氨基酸序列，其包含氨基酸的數(shù)目小于本發(fā)明的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，并且顯示出本發(fā)明蛋白質(zhì)的至少一種活性。典型地，生物活性部分包含具有本發(fā)明蛋白質(zhì)的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。例如，本發(fā)明蛋白質(zhì)的生物活性片段可以包含據(jù)前人報(bào)導(dǎo)為前列腺素類家族的GPCR中特征性保留的(Hirata等人，1994)且也存在于豚鼠DP蛋白質(zhì)中的兩段序列第二個(gè)胞外環(huán)中的QYCPGTWCR和第七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域中的RFLSVISIVDPWIFI。本發(fā)明蛋白質(zhì)的生活活性部分可以是多肽，即例如長(zhǎng)度為10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。特定的生物活性多肽包括本發(fā)明蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)鑒定的結(jié)構(gòu)域。此外，其它生物活性部分(其中缺失該蛋白質(zhì)的其它區(qū)域)可通過(guò)重組技術(shù)制備，以供本發(fā)明蛋白質(zhì)的一種或多種功能活性的評(píng)估之用。有關(guān)本發(fā)明生物相關(guān)部分的進(jìn)一步指導(dǎo)在“實(shí)施例3”中提供。
其它有用的蛋白質(zhì)與SEQ ID NO2基本相同且保留了SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)的功能活性但氨基酸序列中因天然等位基因變異或誘變而不同。例如，這樣的蛋白質(zhì)和多肽具有至少一種本文所描述的生物活性。因此，本發(fā)明的有用的蛋白質(zhì)是包括與SEQ ID NO2的氨基酸序列至少有約65％、75％、85％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列且保留了SEQID NO2的蛋白質(zhì)的功能活性的蛋白質(zhì)。
為了確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸的相一性，可采用序列比對(duì)方法來(lái)取得最佳比較(例如，可在第一個(gè)氨基酸或核酸序列中引入缺口以取得與第二個(gè)氨基酸或核酸序列的最佳比對(duì))。然后比較相應(yīng)氨基酸位或核酸位上的氨基酸殘基或核苷酸。若第一和第二序列的相應(yīng)位置被相同的氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，那么認(rèn)為這兩個(gè)分子在該位置上是相同的。兩個(gè)序列的同一性是這兩個(gè)序列共有的相同位置數(shù)目為函數(shù)(即百分?jǐn)?shù)同一性＝相同位置數(shù)/總位置數(shù)(例如，重疊位置)×100)。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)序列的長(zhǎng)度相同。
兩個(gè)序列的百分?jǐn)?shù)同一性可由數(shù)學(xué)算法求出。用來(lái)比較兩序列的數(shù)學(xué)算法的非限制性實(shí)例是Karlin算法(見Karlin等人，Proc Natl Acad SciUSA(1990)872264，修正版見Karlin等人，Proc Natl Acad Sci USA(1993)905873-5877)。該算法已整合到Altschul等的NBLAST和XBLAST程序(見Altschul等人，J Mol Bio(1990)215403)。出于對(duì)比目而需要得到缺口比對(duì)時(shí)，可使用缺口BLAST法，見Altschul等人，NucleicAcids Res(1997)253389。另外，可采用PSI-Blast進(jìn)行迭代搜索來(lái)檢測(cè)分子間的遠(yuǎn)親關(guān)系。上述Altschul等人(1997)。使用BLAST、缺口BLAST和PSI-Blast程序時(shí)，可采用各自程序(諸如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)，見http//www.ncbi.nlm.nih.gov。序列比較的數(shù)學(xué)算法的另一個(gè)具體的非限制性實(shí)例是Myers等的算法(見Myers等人，CABIOS(1988)411-17)。該算法已整合到ALIGN程序(2.0版本)，該程序是GCG序列比對(duì)軟件包的一部分。當(dāng)使用ALIGN程序比較氨基酸序列時(shí)，可利用PAM120權(quán)重殘基表、缺口長(zhǎng)度罰分為12分，缺口罰分為4。
還可以采用與上述方法類似的方法，引入或不引入缺口來(lái)確定兩個(gè)序列的百分?jǐn)?shù)同一性。在計(jì)算百分?jǐn)?shù)同一性時(shí)，僅計(jì)數(shù)完全匹配。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的嵌合或融合蛋白質(zhì)。本文所用的本發(fā)明的“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含與“非本發(fā)明多肽”有效連接的SEQ ID NO2的多肽?！氨景l(fā)明的多肽”是指具有對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽?！胺潜景l(fā)明的多肽”是指具有對(duì)應(yīng)于與SEQ ID NO2基本不同的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的多肽，例如，與本發(fā)明蛋白質(zhì)不同的并且來(lái)自相同或不同生物的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的融合蛋白范圍內(nèi)，本發(fā)明的多肽可相應(yīng)于SEQ ID NO2的全部或一部分，優(yōu)選SEQ ID NO2的至少一個(gè)生物活性部分。在融合蛋白的范圍內(nèi)，“有效連接”是指本發(fā)明多肽和非本發(fā)明多肽在框內(nèi)相互融合。非本發(fā)明多肽可融合于本發(fā)明多肽的N-端或C-端。一種有用的融合蛋白利用谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，其中本發(fā)明的多肽融合到GST的C端。此類融合蛋白可方便本發(fā)明重組多肽的純化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白的范圍擴(kuò)展到免疫球蛋白融合蛋白，其中SEQ ID NO2的全部或一部分與來(lái)自免疫球蛋白家族成員的序列融合。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白可摻入藥物組合物，并施用于受試者以抑制配體與細(xì)胞表面上本發(fā)明受體蛋白質(zhì)的相互作用，從而抑制體內(nèi)受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本發(fā)明的免疫球蛋白融合蛋白還可用來(lái)影響本發(fā)明受體的同源配體的生物利用率。抑制配體-受體相互作用可以具有治療意義，諸如但不限于治療或調(diào)節(jié)睡眠、體溫、嗅覺功能、激素釋放、疼痛、胃腸道疾病、肝病、眼疾(諸如青光眼)、血液疾病(諸如血栓形成)、炎癥(包括但不限于哮喘、過(guò)敏性鼻炎、氣道機(jī)能亢進(jìn)、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎和慢性阻塞性肺病)。另外，本發(fā)明的免疫球蛋白-多肽融合蛋白可作為免疫原而在患者體內(nèi)產(chǎn)生抗體，純化配體并在篩選分析中鑒定抑制本發(fā)明受體-配體作用的分子在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的嵌合或融合蛋白經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，按照常規(guī)技術(shù)(例如使用鈍端或交錯(cuò)端末端進(jìn)行連接、限制酶消化來(lái)提供適當(dāng)?shù)哪┒恕葱枰畛湔承阅┒?、進(jìn)行堿性磷酸酶處理以避免不必要的結(jié)合和酶促連接)，將編碼不同多肽序列的DNA片段在框內(nèi)連接在一起。在另一實(shí)施方案中，融合基因由常規(guī)技術(shù)，諸如自動(dòng)化DNA合成儀合成。另外，可利用錨定引物來(lái)進(jìn)行基因片段的PCR擴(kuò)增，該錨定引物在兩個(gè)連續(xù)的基因片段間引發(fā)互補(bǔ)突出端，這兩個(gè)基因片段可以隨后退火并再擴(kuò)增生成嵌合基因序列(見例如上述Ausubel等人)。此外，還可通過(guò)商業(yè)途徑獲得許多編碼融合部分(例如GST多肽)的表達(dá)載體。編碼本發(fā)明多肽或其部分的核酸可被克隆到這樣的表達(dá)載體，使融合部分與本發(fā)明的蛋白質(zhì)在框內(nèi)連接。
核酸和蛋白質(zhì)變體如上文所解釋，本發(fā)明還涉及SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的變體。例如，可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(諸如定點(diǎn)誘變和PCR介導(dǎo)的誘變)將突變引入SEQID NO1所表示的氨基酸序列。此外，可對(duì)一個(gè)或更多預(yù)測(cè)的非必需氨基酸殘基進(jìn)行保守氨基酸替代。“保守氨基酸替代”是指一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)帶相似側(cè)鏈的氨基酸所替代。例如，一個(gè)或多個(gè)氨基酸可被另一個(gè)極性相似的氨基酸(作為功能等同物)所替代而形成沉默改變。本發(fā)明多肽的氨基酸序列中氨基酸的取代氨基酸可選自該氨基酸所屬家族的其它成員。例如，非極性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸為苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷(堿性)的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。這樣的改變將預(yù)計(jì)不會(huì)影響由聚丙烯酰胺凝膠電泳或等電點(diǎn)法確定的表觀分子量。
尤其優(yōu)選的替代為-Lys替代Arg和反之亦然，以保留正電荷；-Glu替代Asp和反之亦然，以保留負(fù)電荷；-Ser替代Thr，以保留自由-OH；以及-Gln替代Asn，以保留自由NH2。
其它替代可使用合成(即非天然發(fā)生的)的氨基酸。
還可以引入氨基酸替代來(lái)得到具有尤其優(yōu)選的性質(zhì)的氨基酸。例如，可將Cys引入潛在與另一個(gè)Cys形成二硫鍵的位置?？蓪is引入作為特定“催化”位點(diǎn)(即His可作為酸或堿，它是生物化學(xué)催化中最常用的氨基酸)?？梢隤ro，利用其特殊的平面結(jié)構(gòu)而誘導(dǎo)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的β-轉(zhuǎn)角。
還可將突變隨機(jī)引入SEQ ID NO1編碼序列的全部或片段(諸如通過(guò)飽和誘變)，然后對(duì)所生成的突變體進(jìn)行生物活性篩選，鑒定保留了活性的突變體。誘變之后，可以重組表達(dá)編碼蛋白質(zhì)，然后確定蛋白質(zhì)的活性。
本發(fā)明的變體可作為激動(dòng)劑(模擬物)或拮抗劑。本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體可通過(guò)誘變生成，例如本發(fā)明蛋白質(zhì)的離散點(diǎn)突變或截短。本發(fā)明蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑可保留與本發(fā)明天然發(fā)生的蛋白質(zhì)基本相同或部分生物活性。拮抗劑可競(jìng)爭(zhēng)地與細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)下游或上游的成員(包括本發(fā)明蛋白質(zhì))結(jié)合，從而抑制本發(fā)明天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的一種或多種活性。因此，用具有有限功能的變體進(jìn)行治療可引起特定的生物效應(yīng)。用具有本發(fā)明天然發(fā)生的蛋白質(zhì)的部分生物活性的變體進(jìn)行治療受試者，副作用要小于用該蛋白質(zhì)的天然發(fā)生的性質(zhì)進(jìn)行的治療。
欲鑒定具有激動(dòng)劑(模擬物)或拮抗劑功能的本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體，可以篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體，例如截短的突變體的組合文庫(kù)，考察蛋白質(zhì)的激動(dòng)劑或拮抗劑活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)核酸水平上的組合誘變生產(chǎn)本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體的多樣化文庫(kù)，該變體文庫(kù)由多樣化的基因文庫(kù)編碼。變體的多樣化文庫(kù)的制備方法有，例如，通過(guò)酶催化法使合成的寡核苷酸混合物連接到基因序列，這樣，簡(jiǎn)并組的本發(fā)明的潛在核酸序列表達(dá)為含有該組本發(fā)明序列的單獨(dú)多肽或備選地一組更大的融合蛋白(例如用于噬菌體展示)。由多種方法可以用于從簡(jiǎn)并寡核苷酸序列來(lái)生成本發(fā)明潛在變體文庫(kù)。簡(jiǎn)并基因序列的化學(xué)合成可由自動(dòng)化DNA合成儀進(jìn)行，該合成基因然后連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體。利用一組簡(jiǎn)并基因可以允許在一個(gè)混合物中提供編碼所希望組的本發(fā)明潛在核酸序列的所有序列。合成簡(jiǎn)并寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的(見例如Narang，Tetrahedron(1983)393；Itakura等人，Ann Rev Biochem(1984)53323；Itakura等人，Science(1984)1981056；Ike等人，Nucleic Acid Res(1983)11477)。
另外，蛋白質(zhì)編碼序列的片段文庫(kù)可用于生成片段的多樣化群體，供篩選及隨后選擇本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼序列片段文庫(kù)的建立包含在一定的條件下(在此條件下，每個(gè)分子僅發(fā)生約一個(gè)切口)用核酶處理本發(fā)明編碼序列的雙鏈PCR片段，使雙鏈DNA變性，使DNA復(fù)性形成雙鏈DNA，其包括來(lái)自不同切割產(chǎn)物的有義/反義對(duì)，用S1核酸酶處理而從重新形成的雙鏈體除去單鏈部分并將所生成的片段文庫(kù)連接到表達(dá)載體。由此方法即可得到表達(dá)文庫(kù)，其編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的N-端和多種大小的內(nèi)部片段。
用于篩選通過(guò)點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫(kù)的基因產(chǎn)物和篩選cDNA文庫(kù)以獲得具有所選特性的基因產(chǎn)物的一些技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。此類技術(shù)可以經(jīng)修改適應(yīng)于快速篩選通過(guò)組合誘變本發(fā)明蛋白質(zhì)產(chǎn)生的基因文庫(kù)。適于高通量分析篩選大基因文庫(kù)的最廣泛使用的技術(shù)一般包括將基因文庫(kù)克隆入復(fù)制型表達(dá)載體，用所得的載體文庫(kù)轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞并在一定的條件下表達(dá)組合基因，其中對(duì)所需活性的檢測(cè)有利于分離編碼基因的載體，其中所述基因的表達(dá)產(chǎn)物已得以檢測(cè)。遞歸整體誘變(recursiveensemble mutagenesis；REM)為在文庫(kù)中增加功能突變體的頻率的技術(shù)，該技術(shù)可用于與篩選測(cè)試結(jié)合來(lái)鑒定本發(fā)明的變體蛋白質(zhì)(Arkin等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1992)897811-7815；Delgrave等人，蛋白質(zhì)工程(ProteinEngineering)(1993)6(3)327-331)。
本發(fā)明蛋白質(zhì)的類似物及衍生物此外，本發(fā)明亦包括以化學(xué)修飾法制備的本發(fā)明蛋白質(zhì)衍生物或類似物。本發(fā)明之蛋白質(zhì)可通過(guò)使蛋白質(zhì)部分連接一或多個(gè)化學(xué)部分予以衍生化。
適用于衍生化之化學(xué)部分可選自水溶性聚合物，從而使該GAVE6類似物或衍生物于水性環(huán)境(例如生理環(huán)境)中不會(huì)沉淀。任選地，該聚合物為可藥用的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于例如該聚合物/成分綴合物是否將于治療上使用，以及如果使用的話，所需劑量、循環(huán)時(shí)間、對(duì)蛋白水解的抗性等考慮因素選擇所需之聚合物。對(duì)于本發(fā)明蛋白質(zhì)，這些可使用本文提供的試驗(yàn)予以確定。在此處具有用途的水溶性聚合物的實(shí)例包括，但不限于，聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧雜環(huán)己烷、聚-1，3，6-三氧雜環(huán)己烷、乙烯/馬來(lái)酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或者隨機(jī)共聚物)、dextran、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇或聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于在水中之穩(wěn)定性而于制備上具有優(yōu)點(diǎn)。
聚合物可具有任何分子量，并可是分枝或不分枝的。以聚乙二醇而言，為了容易操作及制備，優(yōu)選之分子量介于約2kDa與約100kDa之間(“約”一詞表明聚乙二醇制品中，有些分子較所述分子量重，有些則較輕)。視所需治療性質(zhì)(例如，所需緩釋持續(xù)時(shí)間、對(duì)生物活性的影響(若有的話)、操作容易性、抗原性的程度或缺乏、及聚乙二醇對(duì)治療性蛋白質(zhì)或類似物之其它已知效應(yīng))而定，可使用其它大小。
如此連接于本發(fā)明蛋白質(zhì)之聚合物分子的數(shù)目可不同，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定其對(duì)功能的影響?？梢允褂孟嗤虿煌幕瘜W(xué)部分(例如，聚合物，如不同重量之聚乙二醇)予以單一衍生化，或可提供二-、三-、四-衍生化或某種衍生化組合。聚合物分子對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)分子之比例可不同，其于反應(yīng)混合物中之濃度亦可以不同。通常最適比例(就其中無(wú)過(guò)量未反應(yīng)成分或諸成分及聚合物的反應(yīng)的效率而言)由例如所需衍生化程度(例如，單、二-、三-、等)、所選聚合物分子量、聚合物是不分枝的或是分枝的、及反應(yīng)條件等因素決定。
聚乙二醇分子(或其它化學(xué)部分)連接于本發(fā)明蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)慮及對(duì)功能域或抗原性域的影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員有許多可運(yùn)用的連接方法，例如，并入本文供參考用之EP 0 401 384(將PEG偶聯(lián)于G-CSF)，亦參見Maliket al.，1992，Exp.Hematol.201028-1035(記載使用tresyl chloride之GM-CSF的聚乙二醇化)。舉例而言，聚乙二醇可藉反應(yīng)基，例如，游離氨基或羧基，經(jīng)由氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合。反應(yīng)基為可與活化之聚乙二醇分子結(jié)合者。具有游離氨基之氨基酸殘基包括賴氨酸殘基及N-末端氨基酸殘基；具有游離羧基者包括天冬氨酸殘基、谷氨酸殘基及C-末端氨基酸殘基。亦可使用巰基作為反應(yīng)基，以連接聚乙二醇分子。用于治療用途時(shí)優(yōu)選連接于氨基，例如連接于N-末端或賴氨酸基團(tuán)。
可能特別需要N-末端經(jīng)化學(xué)修飾之本發(fā)明蛋白質(zhì)。使用聚乙二醇舉例說(shuō)明本發(fā)明組合物，可對(duì)多種聚乙二醇分子(由分子量、分支情況等)、反應(yīng)混合物中聚乙二醇分子對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)分子之比例、所進(jìn)行的聚乙二醇化反應(yīng)之類型、及獲得選定N-末端聚乙二醇化蛋白質(zhì)之方法予以選擇。獲得N-末端聚乙二醇化制品(亦即，如果需要，則自其它單聚乙二醇化部分中分離此部分)之方法可為從聚乙二醇化蛋白質(zhì)分子群中純化N-末端聚乙二醇化物質(zhì)。選擇性N-末端化學(xué)修飾可通過(guò)利用可以用于衍生化的不同類型伯氨基團(tuán)之不同反應(yīng)性(賴氨酸對(duì)N-末端)籍由還原性烷化作用達(dá)成。于適當(dāng)反應(yīng)條件下，可以用含羰基的聚合物對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)N-末端進(jìn)行實(shí)質(zhì)上的選擇性衍生化。例如，于容許利用賴氨酸殘基的ε-氨基與N-末端殘基的α-氨基間的pKa差異之pH下進(jìn)行反應(yīng)，可將本發(fā)明蛋白質(zhì)選擇性地N-末端聚乙二醇化。利用此選擇性衍生化，可控制水溶性聚合物與本發(fā)明蛋白質(zhì)之連接與聚合物之綴合主要發(fā)生于N-端，而其它反應(yīng)性基團(tuán)，例如賴氨酸側(cè)鏈氨基，則無(wú)明顯的修飾作用發(fā)生。使用還原性烷化作用，水溶性聚合物可屬上述類型，并且應(yīng)具有供偶聯(lián)于本發(fā)明蛋白質(zhì)之單一反應(yīng)性醛。可使用含單一反應(yīng)性醛的聚乙二醇丙醛。
抗體可使用分離之本發(fā)明蛋白質(zhì)或其部分或片段作為免疫原，使用制備多克隆與單克隆抗體之標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)之抗體。此處所用術(shù)語(yǔ)“抗體”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原結(jié)合位點(diǎn)的分子或其片段，其中所述抗原結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合抗原如本發(fā)明的蛋白質(zhì)。特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的分子是在天然含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的樣品如生物樣品中結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)而實(shí)質(zhì)上不結(jié)合其它分子的分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的實(shí)例包括用酶如胃蛋白酶處理抗體可產(chǎn)生的F(ab)和F(ab′)2片段。本發(fā)明提供以本發(fā)明蛋白質(zhì)、其變體、其片段、或其類似物或衍生物作為免疫原之多克隆、單克隆及嵌合型抗體。嵌合抗體優(yōu)選用于治療人類疾病或病癥，因?yàn)橄鄬?duì)異種抗體而言，人類或人源化抗體自身引起免疫反應(yīng)(特別是過(guò)敏反應(yīng))的可能性要小。
可使用全長(zhǎng)本發(fā)明蛋白質(zhì)作為免疫原，或者，本發(fā)明提供本發(fā)明之抗原性肽片段作為免疫原。本發(fā)明之抗原肽包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列中的至少8個(gè)(優(yōu)選地10、15、20、30或更多個(gè))氨基酸殘基，并涵蓋表位，從而對(duì)該肽產(chǎn)生的抗體可以與本發(fā)明蛋白質(zhì)形成特異免疫復(fù)合體。
免疫原一般通過(guò)用該免疫原免疫合適的受試者(如兔、山羊、小鼠或其它哺乳動(dòng)物)被用于制備抗體。合適的免疫原性制品可包含如重組表達(dá)的本發(fā)明蛋白質(zhì)或化學(xué)合成的本發(fā)明多肽。該制品還可包含佐劑，諸如弗氏完全或不完全佐劑，或類似的免疫刺激劑。用免疫原性制品免疫合適的受試者可誘導(dǎo)抗本發(fā)明蛋白質(zhì)的多克隆抗體反應(yīng)。
本發(fā)明之抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體、或嵌合抗體。此處所用術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”或“單克隆抗體組合物”是指一群這樣的抗體分子，其只包含一種可與本發(fā)明蛋白質(zhì)特定表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這樣單克隆抗體組合物一般顯示出與特定的本發(fā)明蛋白質(zhì)表位的單一結(jié)合親和性。
多克隆抗體可如上所述通過(guò)用本發(fā)明免疫原免疫合適的受試者而制備。可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如使用固定化本發(fā)明蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，在一段時(shí)間內(nèi)監(jiān)測(cè)接受免疫的受試者體內(nèi)的抗體效價(jià)。如果需要，可從哺乳動(dòng)物(如從血液)分離針對(duì)本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體分子，并用公知的技術(shù)如蛋白A層析法進(jìn)一步純化，以獲得IgG級(jí)分。免疫后在合適的時(shí)間，如當(dāng)抗體效價(jià)最高時(shí)，可從受試者獲得抗體產(chǎn)生細(xì)胞并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)利用此細(xì)胞制備單克隆抗體，所述技術(shù)有例如Kohler等人，自然(Nature)(1975)256495-497最初描述的雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kohler等人，今日免疫學(xué)(Immunol Today)(1983)472)，EBV雜交瘤技術(shù)(Cole等人，單克隆抗體和癌治療(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)，(1985)，Alan R.Liss，Inc.，77-96頁(yè))或三瘤(trioma)技術(shù)。產(chǎn)生雜交瘤的技術(shù)是公知的(一般參見免疫學(xué)最新技術(shù)(Current Protocols inImmunology)(1994)Coligan等人編輯，John Wiley & Sons，Inc.，紐約，NY)。簡(jiǎn)而言之，將永生細(xì)胞系(通常為骨髓瘤)與來(lái)自如上所述的本發(fā)明免疫原免疫過(guò)的哺乳動(dòng)物的淋巴細(xì)胞(通常為脾細(xì)胞)融合，并篩選所得雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清液來(lái)鑒定產(chǎn)生結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的單克隆抗體的雜交瘤。
可使用任一熟知的用于融合淋巴細(xì)胞和永生細(xì)胞系的方法產(chǎn)生單克隆抗體(參見如免疫學(xué)最新技術(shù)，見上文；Galfre等人，自然(1977)266550-552；Kenneth，單克隆抗體生物學(xué)分析中的新方面(Monoclonal AntibodiesANew Dimension In Biological Analyses)，Plenum Publishing Corp.，紐約，N.Y.(1980)；和Lerner，耶魯生物醫(yī)學(xué)雜志(Yale J Biol Med)(1981)54387-402)。而且，普通技術(shù)人員可以理解也可用此類方法的諸多改變后的方法。一般永生細(xì)胞系(如骨髓瘤細(xì)胞系)來(lái)自與淋巴細(xì)胞相同的哺乳動(dòng)物種類。例如，鼠雜交瘤可通過(guò)用本發(fā)明免疫原性制品免疫的小鼠的淋巴細(xì)胞與永生小鼠細(xì)胞系如骨髓瘤細(xì)胞系融合而制備，其中骨髓瘤細(xì)胞系對(duì)含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基(“HAT培養(yǎng)基”)敏感。許多骨髓瘤細(xì)胞系中的任一種都可按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用作融合伙伴(partner)，如P3-NS1/l-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Agl4骨髓瘤細(xì)胞系。這些骨髓瘤細(xì)胞系可從ATCC獲得。一般，用聚乙二醇(“PEG”)使HAT敏感的小鼠骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞融合。融合所得的雜交瘤細(xì)胞然后用HAT培養(yǎng)基選擇，其中HAT培養(yǎng)基殺死未融合的和非生產(chǎn)性融合的骨髓瘤細(xì)胞(未融合的脾細(xì)胞由于未被轉(zhuǎn)化幾天后死去)。本發(fā)明的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可通過(guò)篩選骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體進(jìn)行檢測(cè)(例如應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的ELISA試驗(yàn))。
作為制備分泌單克隆抗體的雜交瘤的備選方案，可以應(yīng)用本發(fā)明蛋白質(zhì)篩選重組組合免疫球蛋白質(zhì)文庫(kù)(如抗體噬菌體展示文庫(kù))，由此得以分離結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的免疫球蛋白文庫(kù)成員，從而鑒定和分離到單克隆抗體。用于產(chǎn)生和篩選噬菌體展示文庫(kù)的試劑盒可從供應(yīng)商處獲得(例如，Pharmacia重組噬菌體抗體系統(tǒng)，目錄號(hào)27-9400-01；以及Stratagene“SurfZAP”噬菌體展示試劑盒，目錄號(hào)240612)。
此外，特別適用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)的方法和試劑的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(見，例如Fuchs等，Bio/Technology(1991)91370-1372；Hay等，Hum Antibody Hybridomas(1992)381-85；Huse等，科學(xué)(Science)(1989)2461275-1281；Griffiths等，EMBO J(1993)25(12)725-734；美國(guó)專利號(hào)5,223,409；PCT公開號(hào)WO 92/18619；PCT公開號(hào)WO 91/17271；PCT公開號(hào)WO 92/20791；PCT公開號(hào)WO 92/15679；PCT公開號(hào)WO 93/01288；PCT公開號(hào)WO 92/01047；PCT公開號(hào)WO 92/09690；PCT公開號(hào)WO 90/02809，將它們的公開引入本文作為參考)。
此外，重組抗體，包括如包含人和非人部分的嵌合的和人源化的單克隆抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備。該類嵌合的和人源化的單克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)產(chǎn)生，例如使用如下文獻(xiàn)中描述的方法產(chǎn)生PCT公開號(hào)WO 87/02671；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?84,187；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?71,496；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?73,494；PCT公開號(hào)WO 86/01533；美國(guó)專利號(hào)4,816,567；歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?25,023；Better等，科學(xué)(1988)2401041-1043；Liu等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1987)843439-3443；Lin等，免疫學(xué)雜志(1987)1393521-3526；Sun等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1987)84214-218；Nishimura等，癌研究(Canc Res)(1987)47999-1005；Wood等，自然(1985)314446-449；Shaw等，國(guó)家癌研究所雜志(J Natl CancerInst)(1988)801553-1559；Morrison，科學(xué)(1985)2291202-1207；Oi等，生物/技術(shù)(Bio/Techniques)(1986)4214；美國(guó)專利號(hào)5,225,539；Jones等，自然(1986)321552-525；Verhoeyan等，科學(xué)(1988)2391534；和Beidler等，免疫學(xué)雜志(J Immunol)(1988)1414053-4060；將它們的公開引入本文作為參考。
特別需要完全人抗體以用于治療人類患者。該抗體可應(yīng)用轉(zhuǎn)基因小鼠制備，所述轉(zhuǎn)基因小鼠不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因，而能夠表達(dá)人的重鏈和輕鏈基因。該轉(zhuǎn)基因小鼠可以用選擇的抗原(如本發(fā)明蛋白質(zhì)的全部或一部分)以標(biāo)準(zhǔn)方式進(jìn)行免疫。針對(duì)該抗原的單克隆抗體可由常規(guī)的雜交瘤技術(shù)獲得。位于轉(zhuǎn)基因小鼠中的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過(guò)程中進(jìn)行重排，并隨后經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變。這樣，應(yīng)用該表位可鑒定出抑制本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的抗體?？寺》侨丝贵w的重鏈和輕鏈并用于構(gòu)建噬菌體展示的Fab片段。例如，可將重鏈基因克隆到質(zhì)粒載體中，以使細(xì)菌分泌重鏈。可將輕鏈基因克隆到噬菌體外殼蛋白基因中以使其可表達(dá)于噬菌體表面。使用與人輕鏈庫(kù)(隨機(jī)收集的)融合的噬菌體感染表達(dá)非人重鏈的細(xì)菌。產(chǎn)生的后代噬菌體展示雜合抗體(人輕鏈/非人重鏈)。利用選擇的抗原淘選能結(jié)合所選抗原的噬菌體。為鑒定出該噬菌體可能需要幾輪篩選。
從選出的可結(jié)合所選抗原的噬菌體中分離人輕鏈基因。然后利用選出的人輕鏈基因指導(dǎo)人重鏈基因的篩選，方法如以下所述。將選出的人輕鏈基因插入載體進(jìn)行細(xì)菌表達(dá)。表達(dá)所選人輕鏈的細(xì)菌用融合了人重鏈庫(kù)的噬菌體進(jìn)行感染。產(chǎn)生的子代噬菌體展示人抗體(人輕鏈/人重鏈)。
接著，使用選出的抗原淘選可結(jié)合所選擇抗原的噬菌體。選出的噬菌體展示出完全人抗體，該抗體識(shí)別的表位與最初選擇的非人單克隆抗體所識(shí)別的表位相同。分離編碼重鏈和輕鏈的基因，并可進(jìn)一步操作用于制備人抗體。該技術(shù)參見Jespers等的描述(生物/技術(shù)(Bio/Technology)(1994)12899-903)。
抗體(如單克隆抗體)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如親和層析或免疫沉淀)用來(lái)分離本發(fā)明蛋白質(zhì)?？?本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體可以幫助從細(xì)胞中純化天然的蛋白質(zhì)和表達(dá)于宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。此外，抗體可用于檢測(cè)本發(fā)明蛋白質(zhì)(如在細(xì)胞裂解物或細(xì)胞上清液中)以評(píng)估該蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度和表達(dá)方式?？贵w可用于診斷中作為臨床試驗(yàn)方法的一部分來(lái)監(jiān)測(cè)組織中的蛋白質(zhì)水平，以便例如，確定特定治療方案的療效。如下文所述，將抗體與可檢測(cè)的物質(zhì)偶聯(lián)可方便檢測(cè)。
可檢測(cè)的標(biāo)記物任選地，本發(fā)明的分離核酸分子、本發(fā)明多肽和本發(fā)明抗體、以及這些部分之片段，可進(jìn)行可檢測(cè)標(biāo)記。適當(dāng)標(biāo)記物包括酶、熒光團(tuán)[例如，異硫氰酸熒光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)、德克薩斯紅(TR)、羅丹明、游離或螯合的鑭系鹽(特別是Eu3+)等]、發(fā)光團(tuán)、放射性同位素、螯合劑、染料、膠體金、乳膠顆粒、配體(例如，生物素)、生物發(fā)光物質(zhì)、及化學(xué)發(fā)光劑。使用對(duì)照標(biāo)志時(shí)，受體及對(duì)照標(biāo)志可使用相同或不同的標(biāo)記物。
使用放射性標(biāo)記物，例如同位素3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、及186Re之情形下，可使用目前已知可用之計(jì)數(shù)方法。于標(biāo)記物為酶的情形下，可利用本領(lǐng)域中目前使用之比色、分光光度、熒光分光光度、電流測(cè)定或氣體定量測(cè)定等技術(shù)之任一者達(dá)成檢測(cè)。
直接標(biāo)記物為根據(jù)本發(fā)明可用的可檢測(cè)標(biāo)記物的一個(gè)實(shí)例。直接標(biāo)記物被定義為呈天然狀態(tài)時(shí)，以肉眼或藉助于光學(xué)濾片及/或通過(guò)施加刺激(例如，以U.V.光引起熒光)易于被看見之實(shí)體。根據(jù)本發(fā)明可用的有色標(biāo)記物的實(shí)例包含金屬溶膠顆粒，例如，如Leuvering(美國(guó)專利4,313,734)所述之金溶膠顆粒；如Gribnau et al.(美國(guó)專利4,373,932)與May et al.(WO88/08534)所述之染料溶膠顆粒；如May(文獻(xiàn)同前)、Snyder(EP-A 0 280 559與0 281 327)所述之染色乳膠；或如Campbell et al.(美國(guó)專利4,703,017)所述之包封于脂質(zhì)體中之染料。其它直接標(biāo)記物包括放射性核苷酸、熒光基團(tuán)或發(fā)光基團(tuán)。除了這些直接標(biāo)記裝置外，包括酶在內(nèi)的間接標(biāo)記物亦可根據(jù)本發(fā)明予以使用。多種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法為本領(lǐng)域中悉知，例如，堿性磷酸酶與辣根過(guò)氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、脲酶，這些及其它實(shí)例已由Eva Engvall于Methods in Enzymology，70，419-439，1980之Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT及美國(guó)專利4,857,453詳細(xì)討論。
用于本發(fā)明之其它可檢測(cè)的標(biāo)記物包括磁珠或磁共振成像標(biāo)記物。
于另一實(shí)施方案中，可于本發(fā)明分離多肽、本發(fā)明抗體、或其片段上，產(chǎn)生供32P標(biāo)記用的磷酸化位點(diǎn)，例如，見述于歐洲專利號(hào)0372707。
如此處所例示，蛋白質(zhì)，包括抗體，可通過(guò)代謝標(biāo)記法予以可檢測(cè)地標(biāo)記。代謝標(biāo)記發(fā)生于在補(bǔ)充代謝性標(biāo)記物(例如[35S]-甲硫氨酸或[32P]-正磷酸鹽)的培養(yǎng)基存在下體外培養(yǎng)表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞的期間。除了以[35S]-甲硫氨酸進(jìn)行代謝性(或生物合成性)標(biāo)記外，本發(fā)明還考慮以[14C]-氨基酸及[3H]-氨基酸(其中氚取代于非不穩(wěn)定位置)進(jìn)行標(biāo)記。
除了上面引用的標(biāo)記外，還可以用抗體可識(shí)別的抗原肽標(biāo)記該抗體。實(shí)例包括HA標(biāo)記和FLAG標(biāo)記。
重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明另一方面涉及含編碼SEQ ID NO1(或其一部分)的核酸的載體，優(yōu)選表達(dá)載體。如上所解釋的，載體的一個(gè)類型為“質(zhì)粒”，是指可連入額外DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。載體的另一類型為病毒載體，其中可以將額外的DNA區(qū)段連入病毒基因組中。某些載體可在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其他的載體(如非游離型的哺乳動(dòng)物載體)在導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)時(shí)整合到宿主細(xì)胞基因組中，并因此隨宿主基因組一同復(fù)制。此外，表達(dá)載體能夠指導(dǎo)與其有效連接的基因的表達(dá)。一般，重組DNA技術(shù)中應(yīng)用的表達(dá)載體常為質(zhì)粒(載體)形式。然而，本發(fā)明意在包括其他形式的表達(dá)載體，如可執(zhí)行等同功能的病毒載體(如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸分子，所述核酸分子以適于在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的形式存在。這意味著本發(fā)明的重組表達(dá)載體包括一段或多段基于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞而選出的調(diào)控序列，該序列與待進(jìn)行表達(dá)的核酸有效連接。在重組表達(dá)載體內(nèi)，“有效連接”意指目的核苷酸序列連接到調(diào)控序列上，其連接方式允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中后在該宿主細(xì)胞中表達(dá))。術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”旨在包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)控制元件(如多聚腺苷酸化信號(hào))。該調(diào)控序列在如Goeddel，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene ExpressionTechnologyMethods in Enzymology)，185卷，Academic Press，San Diego，CA(1990)中有描述。調(diào)控序列包括那些指導(dǎo)核苷酸序列在多種宿主細(xì)胞中進(jìn)行組成型表達(dá)的序列(如組織特異的調(diào)控序列)。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)將取決于選擇進(jìn)行轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、所需蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等因素?？梢詫⒈景l(fā)明的表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生此處描述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽。
本發(fā)明的重組表達(dá)載體可設(shè)計(jì)用于在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)SEQ IDNO1或者其部分，所述細(xì)胞有例如，細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞(用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞在之前的Goeddel的文獻(xiàn)中有討論。備選地，重組表達(dá)載體可應(yīng)用如噬菌體調(diào)控元件和蛋白質(zhì)在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，其中所述元件和蛋白質(zhì)如T7啟動(dòng)子和/或T7聚合酶。
蛋白質(zhì)在原核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)大都在大腸桿菌中使用載體進(jìn)行，所述載體含有指導(dǎo)融合或非融合蛋白表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。融合載體可在其編碼的蛋白質(zhì)上添加一些氨基酸，這些氨基酸通常添加到重組蛋白的氨基端。此類融合載體一般有三種用途1)提高重組蛋白的表達(dá)；2)提高重組蛋白的溶解度；和3)在親和純化中作為配體協(xié)助重組蛋白的純化。通常，融合表達(dá)載體中在融合部分和重組表達(dá)蛋白的連接處導(dǎo)入有一個(gè)蛋白水解切割位點(diǎn)，從而使得可以在純化融合蛋白后使重組蛋白得以和融合部分分離。此類酶和關(guān)聯(lián)識(shí)別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。典型的融合表達(dá)載體包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith等，基因(Gene)(1988)6731-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRITS(Pharmacia，Piscataway，NJ)，三者分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合到靶重組蛋白上。
合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例包括pTrc(Amann等，基因(Gene)(1988)69301-315)和pET 11d(Studier等，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法(Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology)，AcademicPress，San Diego，California(1990)18560-89)。pTrc載體上靶基因的表達(dá)依賴于宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄。
使大腸桿菌中重組蛋白表達(dá)最大化的一個(gè)策略是在蛋白水解切割重組蛋白的能力被削弱的宿主中表達(dá)蛋白(Gottesman，基因表達(dá)技術(shù)酶學(xué)方法，Academic Press，San Diego，California(1990)185119-128)。另一策略是改變待插入表達(dá)載體的核酸的核酸序列，以使編碼每一氨基酸的各密碼子都為優(yōu)選在大腸桿菌中應(yīng)用的密碼子(Wada等，核酸研究(1992)202111-2118)。對(duì)本發(fā)明核酸序列進(jìn)行此類改變可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的DNA合成技術(shù)完成。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體為酵母表達(dá)載體。用于在酵母(如釀酒酵母(S.cerevisiae))中實(shí)現(xiàn)表達(dá)的載體的實(shí)例包括pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan等，細(xì)胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
備選地，可應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)SEQ ID NO1或者其部分?，F(xiàn)有可用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(如Sf 9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith等，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol Cell Biol)(1983)32156-2165)和pVL系列(Lucklow等，病毒學(xué)(Virology)(1989)17031-39)。
而在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸使用哺乳動(dòng)物表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。應(yīng)用于此處的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的實(shí)例包括，但當(dāng)然不限于pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)。當(dāng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)載體的控制功能常由病毒調(diào)控元件提供。例如，通常應(yīng)用的啟動(dòng)子來(lái)自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿病毒40。對(duì)于其他適用于原核和真核細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，見之前Sambrook等的文獻(xiàn)的第16和17章。
在另一實(shí)施方案中，重組哺乳動(dòng)物表達(dá)載體能夠指導(dǎo)核酸優(yōu)選地在特定的細(xì)胞類型中表達(dá)(例如，應(yīng)用組織特異的調(diào)控元件來(lái)表達(dá)核酸)。組織特異的調(diào)控元件在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。合適的組織特異性啟動(dòng)子的非限定實(shí)例包括白蛋白啟動(dòng)子(肝臟特異；Pinkert等，基因進(jìn)展(Genes Dev)(1987)1268-277)，淋巴特異的啟動(dòng)子(Calame等，Adv Immunol(1988)43235-275)，特別是T細(xì)胞受體(Winoto等，EMBO J(1989)8729-733)和免疫球蛋白(Banerji等，細(xì)胞(Cell)(1983)33729-740；Queen等，細(xì)胞(Cell)(1983)33741-748)的啟動(dòng)子，神經(jīng)元特異的啟動(dòng)子(如神經(jīng)絲啟動(dòng)子；Byrne等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1989)865473-5477)，胰腺特異的啟動(dòng)子(Edlund等，科學(xué)(Science)(1985)230912-916)和乳腺特異的啟動(dòng)子(如奶乳清蛋白啟動(dòng)子；美國(guó)專利號(hào)4,873,316和歐洲申請(qǐng)?zhí)?64,166)。發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子也包括在內(nèi)，如鼠hox啟動(dòng)子(Kessel等，科學(xué)(Science)(1990)249374-379)和甲胎蛋白啟動(dòng)子(Campes等，基因進(jìn)展(Genes Dev)(1989)3537-546)。將前面參考文獻(xiàn)的每一個(gè)的公開引入本文作為參考。
本發(fā)明還提供含本發(fā)明的DNA分子的重組表達(dá)載體，其中該DNA分子以反義方向克隆在表達(dá)載體中。也就是，DNA分子有效連接到調(diào)控序列上，該連接方式使得可以表達(dá)(通過(guò)轉(zhuǎn)錄該DNA分子)產(chǎn)生與本發(fā)明的mRNA反義的RNA分子?？梢詫?duì)與反義方向克隆的核酸有效連接的調(diào)控序列進(jìn)行選擇以指導(dǎo)反義RNA分子在多種細(xì)胞類型中持續(xù)表達(dá)。例如，可選擇病毒啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子或調(diào)控序列以指導(dǎo)反義RNA實(shí)現(xiàn)組成型、組織特異性或細(xì)胞類型特異性表達(dá)。反義表達(dá)載體的形式可為重組質(zhì)粒、噬菌?；驕p毒病毒，其中反義核酸被置于高效調(diào)控區(qū)域的控制下，其活性由載體所導(dǎo)入的細(xì)胞的類型決定。使用反義基因進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的討論見Weintraub等(Reviews-Trends in Genetics，Vol.1(1)1986)。
本發(fā)明的另一方面涉及已導(dǎo)入本發(fā)明的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”和“重組宿主細(xì)胞”在此處可互換使用。應(yīng)當(dāng)理解，該術(shù)語(yǔ)不僅指特定的受試細(xì)胞，也指該細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境影響在傳代過(guò)程中可發(fā)生某些改變，這樣，后代實(shí)際上可能并非與親代細(xì)胞相同，但其仍包括在此處所用術(shù)語(yǔ)的范圍之內(nèi)。
宿主細(xì)胞可為任意的原核或真核細(xì)胞。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在細(xì)菌細(xì)胞(如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)、293細(xì)胞或COS細(xì)胞)中表達(dá)。其他合適的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員公知。載體DNA可通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如此處所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種將外源核酸(如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、轉(zhuǎn)導(dǎo)、DEAE-葡聚糖-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。
對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知根據(jù)應(yīng)用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小部分的細(xì)胞可將外源DNA整合到基因組中。為鑒定和篩選整合體，一般將編碼選擇標(biāo)記的基因(如抗生素抗性基因)與目的基因一同導(dǎo)入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些可賦予藥物抗性的基因，所述藥物如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸可與編碼SEQ ID NO1或者其部分的基因位于同一載體上被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或編碼選擇標(biāo)記的核酸可以導(dǎo)入不同的載體上。被導(dǎo)入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可通過(guò)藥物篩選進(jìn)行鑒定(例如，摻入了選擇標(biāo)記物基因的細(xì)胞將存活，而其他細(xì)胞死亡)。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞(如培養(yǎng)的原核或真核宿主細(xì)胞)可用于產(chǎn)生(即表達(dá))本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過(guò)應(yīng)用本發(fā)明的宿主細(xì)胞產(chǎn)生SEQ ID NO2或者其部分的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞(編碼SEQ ID NO1的重組表達(dá)載體已經(jīng)導(dǎo)入了該細(xì)胞)，由此使本發(fā)明的蛋白質(zhì)得以產(chǎn)生。在另一實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)基或宿主細(xì)胞中分離本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明包含誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)，其用于其他亞克隆到修飾表達(dá)載體上的蛋白質(zhì)的重組表達(dá)。例如，包含突變G蛋白的宿主細(xì)胞(例如，酵母細(xì)胞、Y2腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞和cyc-S49，見美國(guó)專利號(hào)6,168,927B1，5,739,029和5,482,835；Mitchell等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc NatlAcad USA)(1992)89(19)8933-37和Katada等，生物化學(xué)雜志(J BiolChem)(1984)259(6)3586-95)用包含編碼SEQ ID NO1的核酸序列的第一表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中SEQ ID NO2在宿主細(xì)胞中進(jìn)行功能表達(dá)。盡管表達(dá)的本發(fā)明的蛋白質(zhì)具有組成型活性，但突變的存在不允許信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生；即，不能激活G蛋白指導(dǎo)的下游級(jí)聯(lián)放大(例如，不能激活腺苷酰環(huán)化酶)。隨后，用第二表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)包含SEQ ID NO1的宿主細(xì)胞。除待通過(guò)此誘導(dǎo)型系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的目的基因外，第二載體還包含與宿主細(xì)胞G蛋白突變體互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)基因(即，哺乳動(dòng)物或酵母的功能性Gs、Gi、Go或Gq，例如，見PCT公開號(hào)WO 97/48820；美國(guó)專利號(hào)6,168,927 B1、5,739,029和5,482,835，并并且將它們完整引入本文作為參考)。第二載體的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因?yàn)榭烧T導(dǎo)的；即，處于外源添加的組分(如四環(huán)素、IPTG、小分子等，見之前的Sambrook等的文獻(xiàn))的控制下，所述組分可以激活與所述互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因有效連接的啟動(dòng)子。加入誘導(dǎo)劑后，該互補(bǔ)結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能性表達(dá)，結(jié)果具有組成型活性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)將形成復(fù)合體，導(dǎo)致適當(dāng)?shù)南掠瓮返募せ?例如，形成第二信使)。第二載體包含的目的基因具有有效連接的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子可以由合適的第二信使(如CREB和AP1元件)激活。這樣，當(dāng)?shù)诙攀狗e聚時(shí)，目的基因上游的啟動(dòng)子被激活以表達(dá)所述基因的產(chǎn)物。缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)，目的基因的表達(dá)關(guān)閉。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，用于此誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞包括但不限于，S49(cyc-)細(xì)胞。盡管本發(fā)明考慮包含G-蛋白突變的細(xì)胞系，但也可以人工制備/構(gòu)建出合適的突變體(見針對(duì)酵母細(xì)胞的美國(guó)專利號(hào)6,168,927B1、5,739,029和5,482,835)。
在相關(guān)的方面，細(xì)胞用與如下cDNA有效連接的載體轉(zhuǎn)化，所述cDNA包含編碼SEQ ID NO2中所示蛋白質(zhì)的序列。該系統(tǒng)包含的第一和第二載體可以考慮包括但不限于，pCDM8(Seed，自然(Nature)(1987)329840)和pMT2PC(Kaufman等，EMBO J(1987)6187-195)、pYepSecl(Baldari等，EMBO J(1987)6229-234)、pMFa(Kurjan.，細(xì)胞(Cell)(1982)30933-943)、pJRY88(Schultz等，基因(Gene)(1987)54113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)和pPicZ(Invitrogen Corp，SanDiego，CA)。
在一個(gè)相關(guān)方面，宿主細(xì)胞可通過(guò)適宜的方法轉(zhuǎn)染，其中轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致功能性蛋白質(zhì)的表達(dá)(例如，Sambrook等，同上和Kriegler，基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實(shí)驗(yàn)室指南(Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual)，Stockton Press，New York，NY，1990)。該“功能性蛋白質(zhì)”包括但不限于，一經(jīng)表達(dá)即可與G-蛋白形成復(fù)合體的蛋白質(zhì)，其中該G-蛋白調(diào)節(jié)第二信使的形成。于本文中具有用途的其它宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法包括，但當(dāng)然不限于，轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、使用基因槍、或DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)子(參見，例如，Wu et al.，1992，J.Biol.Chem.267963-967；Wu and Wu，1988，J.Biol.Chem.26314621-14624；Hartmut et al.，加拿大專利申請(qǐng)2,012,311，1990年3月15日申請(qǐng))。
廣泛種類的啟動(dòng)子于本發(fā)明中具有用途。的確，本發(fā)明多肽之表達(dá)可由本領(lǐng)域中已知之任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子元件控制，但這些調(diào)控元件必須在選定供表達(dá)用的宿主中具有功能。可用于控制表達(dá)之啟動(dòng)子包括，但不限于，SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域(Benoist和Chambon，1981，Nature 290304-310)、勞氏肉瘤病毒3’長(zhǎng)末端重復(fù)中所含的啟動(dòng)子(Yamamoto et al.，1980，Cell22787-797)、皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因之調(diào)控序列(Brinster etal.，1982，Nature 29639-42)、原核表達(dá)載體例如β-內(nèi)酰胺酶啟動(dòng)子(Villa-Kamaroff，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727-3731)、或tac啟動(dòng)子(DeBoer，et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8021-25)；亦參見《Scientific American》中“來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白質(zhì)”，1980，24274-94；得自酵母或其它真菌之啟動(dòng)子元件例如Gal 4啟動(dòng)子、ADC(醇脫氫酶)啟動(dòng)子、PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子、堿性磷酸酶啟動(dòng)子；及具有組織特異性且已用于轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之動(dòng)物轉(zhuǎn)錄控制區(qū)域于胰腺腺泡細(xì)胞中具活性之彈性蛋白酶I基因控制區(qū)域(Swift et al.，1984，Cell 38639-646；Ornitz et al.，1986，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50399-409；MacDonald，1987，Hepatology 7425-515)；于胰腺β細(xì)胞中具活性之胰島素基因控制區(qū)域(Hanahan，1985，Nature 315115-122)、于淋巴細(xì)胞中具活性之免疫球蛋白基因控制區(qū)域(Grosschedl et al.，1984，Cell 38647-658；Adames et al.，1985，Nature 318533-538；Alexander et al.，1987，Mol.Cell.Biol.71436-1444)、于睪丸、乳房、淋巴與肥大細(xì)胞中具活性之小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)域(Leder et al.，1986，Cell 45485-495)、于肝臟中具活性之白蛋白基因控制區(qū)域(Pinkert et al.，1987，Genes and Devel.1268-276)、于肝臟中具活性之甲胎蛋白基因控制區(qū)域(Krumlauf et al.，1985，Mol.Cell.Biol.51639-1648；Hammer et al.，1987，Science 23553-58)、于肝臟中具活性之α1抗胰蛋白酶基因控制區(qū)域(Kelsey et al.，1987，Genes and Devel.1161-171)、于髓樣細(xì)胞中具活性之β-珠蛋白基因控制區(qū)域(Mogram et al.，1985，Nature 315338-340；Kollias et al.，1986，Cell 4689-94)、于大腦少突膠質(zhì)細(xì)胞中具活性之髓鞘堿性蛋白質(zhì)基因控制區(qū)域(Readhead et al.，1987，Cell 48703-712)、于骨骼肌中具活性之肌球蛋白輕鏈-2基因控制區(qū)域(Sani，1985，Nature 314283-286)、及于下丘腦中具活性之促性腺素釋放激素基因控制區(qū)域(Mason et al.，1986，Science 2341372-1378)。
含本發(fā)明核酸分子之表達(dá)載體可由四種一般方法予以鑒定(a)所需質(zhì)粒DNA或特定mRNA之PCR擴(kuò)增、(b)核酸雜交、(c)存在或不存在選擇標(biāo)記基因的功能、及(d)插入序列之表達(dá)。第一方法中，核酸可利用PCR擴(kuò)增以便擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。第二方法中，插入表達(dá)載體中的外源基因之存在可通過(guò)使用包含與插入的標(biāo)記基因同源的序列的探針進(jìn)行核酸雜交予以鑒定。第三方法中，重組載體/宿主系統(tǒng)可根據(jù)由載體中插入外源基因引致的某些“選擇標(biāo)記”基因功能(例如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、抗生素抗性、轉(zhuǎn)化表型、桿狀病毒中包含體的形成等)之存在與否予以鑒定和挑選。于另一實(shí)例中，若編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其變體、或其類似物或衍生物之核酸插入載體之“選擇標(biāo)記”基因序列內(nèi)，則含該插入物之重組體可由不存在該基因功能予以鑒定。第四方法中，只要表達(dá)的蛋白質(zhì)呈現(xiàn)功能活性構(gòu)象，則重組表達(dá)載體可藉測(cè)定由重組載體表達(dá)的基因產(chǎn)物之活性、生化或免疫學(xué)特征予以鑒定。
廣泛種類的宿主/表達(dá)載體組合可用于表達(dá)本發(fā)明之DNA序列。有用的表達(dá)載體，舉例而言，可由染色體片段、非染色體的及合成的DNA序列組成。適當(dāng)之載體包括SV40之衍生物與已知細(xì)菌質(zhì)粒，例如，大腸桿菌質(zhì)粒col E1、pCR1、pBR322、pMal-C2、pET、pGEX(Smith et al.，1988，Gene 6731-40)、pMB9及其衍生物、質(zhì)粒例如RP4；噬菌體DNA，例如，λ噬菌體的許多衍生物，例如，NM989，及其它噬菌體DNA，例如，M13與絲狀單鏈?zhǔn)删wDNA；酵母質(zhì)粒例如2μ質(zhì)粒或其衍生物；用于真核生物細(xì)胞之載體，例如用于昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞之載體；由質(zhì)粒與噬菌體DNA的組合衍生之載體，例如經(jīng)修飾使用噬菌體DNA或其它表達(dá)控制序列的質(zhì)粒等。
例如，于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中，非融合轉(zhuǎn)移載體，例如但不限于pVL941(BamH1克隆位點(diǎn)；Summers)、pVL1393(BamH1、SmaI、XbaI、EcoR1、NotI、XmaIII、BglII、及PstI克隆位點(diǎn)；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、及BamH1克隆位點(diǎn)；Summers和Invitrogen)、及pBlueBacIII(BamH1、BglII、PstI、NcoI、及HindIII克隆位點(diǎn)，可具有藍(lán)/白重組體篩檢；Invitrogen)，及融合轉(zhuǎn)移載體，例如但不限于pAc700(BamH1與KpnI克隆位點(diǎn)，其中BamH1識(shí)別位點(diǎn)由起始密碼子開始；Summers)、pAc701與pAc702(與pAc700相同，但讀框不同)、pAc360[多角體蛋白起始密碼子下游36堿基對(duì)BamH1克隆位點(diǎn)；Invitrogen(195)]、及pBlueBacHisA、B、C[三個(gè)不同讀框，具有BamH1、BglII、PstI、NcoI、及HindIII克隆位點(diǎn)，供ProBond純化之N-末端肽，及噬菌斑藍(lán)/白重組體篩檢；Invitrogen(220)]均可使用。
考慮用于本發(fā)明之哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括具有可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子[例如二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動(dòng)子]之載體，例如，具有DHFR表達(dá)載體之任何表達(dá)載體、或DHFR/氨甲喋呤共擴(kuò)增載體，例如pED[PstI、SalI、SbaI、SmaI、及EcoRI克隆位點(diǎn)，載體表達(dá)克隆基因與DHFR二者；參見Kaufman，Current Protocols in Molecular Biology，16.12(1991)]?；蛘?，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亞磺酰亞胺共擴(kuò)增載體，例如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、及BclI克隆位點(diǎn)，其中載體表達(dá)谷氨酰胺合成酶與克隆基因；Celltech)。于另一實(shí)施方案中，可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下指導(dǎo)附加體表達(dá)之載體，例如pREP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及KpnI克隆位點(diǎn)、組成型RSV-LTR啟動(dòng)子、潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pCEP4(BamH1、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、及KpnI克隆位點(diǎn)、組成型hCMV立即早期基因、潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及BamH1克隆位點(diǎn)、可誘導(dǎo)之金屬硫蛋白Iia基因啟動(dòng)子、潮霉素選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pREP8(BamH1、XhoI、NotI、HindIII、NheI、及KpnI克隆位點(diǎn)、RSV-LTR啟動(dòng)子、組氨醇選擇標(biāo)記；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、及BamH1克隆位點(diǎn)、RSV-LTR啟動(dòng)子、G418選擇標(biāo)記；Invitrogen)、及pEBVHis(RSV-LTR啟動(dòng)子、潮霉素選擇標(biāo)記、經(jīng)由ProBond樹脂可純化及以腸激酶可切割的N-端肽；Invitrogen)。用于本發(fā)明之可選擇哺乳動(dòng)物表達(dá)載體包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、及Apa1克隆位點(diǎn)、G418選擇；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、XbaI克隆位點(diǎn)、G418選擇；Invitrogen)等。根據(jù)本發(fā)明可以使用之痘苗病毒哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(參見，kaufmun，1991，文獻(xiàn)同前)包括但不限于pSC11(SmaI克隆位點(diǎn)、TK-及β-gal選擇)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、及HindIII克隆位點(diǎn)；TK-及β-gal選擇)、及pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindII、SbaI、BamHI、及Hpa克隆位點(diǎn)；TK或XPRT選擇)。
根據(jù)本發(fā)明亦可使用酵母表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其變體、或其類似物或衍生物。例如，僅舉二例如下，非融合pYES2載體(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamH1、SacI、KpnI、及HindIII克隆位點(diǎn)；Invitrogen)或融合pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamH1、SacI、KpnI、及HindIII克隆位點(diǎn)、以ProBond樹脂純化及以腸激酶切割的N-端肽；Invitrogen)，均可根據(jù)本發(fā)明予以使用。
一經(jīng)鑒定及分離出特定之重組DNA分子，便可使用本領(lǐng)域中已知的數(shù)種方法擴(kuò)增它。一旦建立適當(dāng)?shù)乃拗飨到y(tǒng)及生長(zhǎng)條件，即可將重組表達(dá)載體增殖并大量制備。如先前之說(shuō)明，可使用之表達(dá)載體包括，惟不限于，下述載體或其衍生物人類或動(dòng)物病毒例如痘苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒例如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如，λ)、及質(zhì)粒與粘粒DNA載體，僅舉數(shù)例如上。
此外，可選擇能以所需特定方式調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)、或修飾及加工基因產(chǎn)物之宿主細(xì)胞株。不同宿主細(xì)胞在蛋白質(zhì)的翻譯與翻譯后加工及修飾上[例如，糖基化作用、切割(例如，信號(hào)序列之切割)]具有特征性及特異的機(jī)制?？蛇x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保表達(dá)的外源蛋白質(zhì)得到所需的修飾及加工。例如，細(xì)菌系統(tǒng)中之表達(dá)可用于制備無(wú)糖基化的核心蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可用于制備非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的宿主細(xì)胞為受精的卵母細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，所述細(xì)胞中已導(dǎo)入編碼對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的序列。然后該宿主細(xì)胞可以用于產(chǎn)生基因組中導(dǎo)入了外源序列的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，或產(chǎn)生其中內(nèi)源序列已被改變的同源重組動(dòng)物。該動(dòng)物可用以研究本發(fā)明蛋白質(zhì)的功能和/或活性，以及用于鑒定和/或評(píng)估本發(fā)明蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)劑。如此處所用，“轉(zhuǎn)基因動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選為嚙齒動(dòng)物，如大鼠或小鼠，其中動(dòng)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的其他實(shí)例包括非人靈長(zhǎng)類、綿羊、狗、奶牛、山羊、雞、兩棲動(dòng)物等。本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案是豚鼠，其過(guò)表達(dá)本發(fā)明的受體并且將可以用作過(guò)敏性鼻炎、支氣管哮喘或慢性阻塞性肺病的動(dòng)物模型。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)基因”指外源DNA，其整合到細(xì)胞基因組中，并在細(xì)胞發(fā)育成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后保留在成熟動(dòng)物的基因組內(nèi)。轉(zhuǎn)基因指導(dǎo)編碼的基因產(chǎn)物在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的一種或多種細(xì)胞類型或組織中表達(dá)。如此處所用，“同源重組動(dòng)物”為非人動(dòng)物，優(yōu)選地為哺乳動(dòng)物，其對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO1的內(nèi)源基因已通過(guò)同源重組發(fā)生改變。這在動(dòng)物發(fā)育之前，在內(nèi)源基因和導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞(如動(dòng)物的胚胎細(xì)胞)的外源DNA分子間完成。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以通過(guò)使用上述一種轉(zhuǎn)染方法將編碼SEQ IDNO1或其部分的核酸分子導(dǎo)入受精卵母細(xì)胞的雄性原核，然后允許卵母細(xì)胞在假孕的雌性代孕動(dòng)物體內(nèi)發(fā)育來(lái)產(chǎn)生。所述cDNA序列(如(SEQ ID NO1)中的序列)可作為轉(zhuǎn)基因?qū)敕侨藙?dòng)物的基因組中。備選地，人基因的非人同源物，如小鼠基因可以基于與對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的cDNA的雜交分離。內(nèi)含子序列和多腺苷酸化信號(hào)也可包括在轉(zhuǎn)基因內(nèi)，以提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)效率。組織特異的調(diào)控序列可以有效連接本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因以指導(dǎo)本發(fā)明蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。用于通過(guò)胚胎操作和顯微注射產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，尤其諸如小鼠的動(dòng)物的方法是本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)操作，且可參見如美國(guó)專利號(hào)4,736,866和4,870,009、美國(guó)專利號(hào)4,873,191及Hogan，Manipulating the Mouse Embryo(操作小鼠的胚胎)，(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容特此作為參考引入本文?？梢允褂孟嗨频姆椒óa(chǎn)生在基因組中存在轉(zhuǎn)基因和/或在動(dòng)物的組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)本發(fā)明的mRNA的其它轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。起始的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可用來(lái)繁殖其它的攜帶轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。此外，攜帶編碼SEQ ID NO1的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可進(jìn)一步被培育成攜帶其他轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
為生成同源重組動(dòng)物，制備出含至少部分本發(fā)明基因(例如，本發(fā)明基因的人或者非人同源物，例如，鼠基因)的載體，所述部分本發(fā)明基因中已經(jīng)導(dǎo)入缺失、添加或替代因而可以改變(如功能性破壞)本發(fā)明的基因。在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)載體，以致在同源重組后可破壞內(nèi)源基因的功能(即，不再編碼功能蛋白質(zhì)；也稱為“敲除”載體)。
備選地，可設(shè)計(jì)載體，以便在同源重組后內(nèi)源基因發(fā)生突變或改變但仍編碼功能蛋白質(zhì)(例如，可改變上游調(diào)控區(qū)域由此改變內(nèi)源蛋白質(zhì)的表達(dá))。
在此同源重組載體中，改變的該基因部分在5′和3′端側(cè)翼為該基因的其它核酸序列，從而允許在載體攜帶的外源基因和存在于胚胎干細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源基因之間發(fā)生同源重組。此其它的側(cè)翼核酸序列的長(zhǎng)度應(yīng)足以使與內(nèi)源基因的同源重組成功進(jìn)行。一般地，載體內(nèi)包括幾千堿基的側(cè)翼DNA(5′及3′端)(例如參見，Thomas等，細(xì)胞(Cell)(1987)51503中對(duì)同源重組載體的描述)。
將載體導(dǎo)入(如通過(guò)電穿孔)胚胎干細(xì)胞系，且篩選出導(dǎo)入的本發(fā)明基因與內(nèi)源基因發(fā)生同源重組的細(xì)胞(例如參見，Li等，細(xì)胞(Cell)(1992)69915)。然后將篩選出的細(xì)胞注射到動(dòng)物(例如，小鼠)的胚泡中以形成嵌合集合體(例如參見，Bradley，畸胎癌和胚胎干細(xì)胞實(shí)用方法(Teratocarcinomas and Embryonic Stem CellsA Practical Approach)，Robertson編輯，IRL，Oxford，(1987)，113-152頁(yè))。然后將嵌合胚胎植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物，并使胚胎生長(zhǎng)足月。在生殖細(xì)胞中帶有同源重組DNA的子代可用于繁殖動(dòng)物，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的生殖系傳送，所繁殖的動(dòng)物的所有細(xì)胞都將含有同源重組的DNA。
用于構(gòu)建同源重組載體和同源重組動(dòng)物的方法可以進(jìn)一步參見Bradley，生物/技術(shù)中的最新觀點(diǎn)(Current Opinion in Bio/Technology)(1991)2823-829和PCT公開號(hào)WO 90/11354、WO 91/01140、WO 92/0968和WO 93/04169中的描述，將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
在另一實(shí)施方案，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物可含有選擇系統(tǒng)以允許調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。該系統(tǒng)的一個(gè)實(shí)例為噬菌體P1的cre/loxP重組酶系統(tǒng)。對(duì)cre/loxP重組酶系統(tǒng)的描述參見如Lakso等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(ProcNatl Acad USA))(1992)896232-6236。重組酶系統(tǒng)的另一實(shí)例為釀酒酵母(S.cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)(O′Gorrnan等，科學(xué)(Science)(1991)2511351-1355)。如果cre/loxP重組酶系統(tǒng)被用于調(diào)控轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，則需要同時(shí)含有編碼cre重組酶和選定蛋白的轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物。該動(dòng)物可通過(guò)構(gòu)建“雙重”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如通過(guò)兩轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的交配(所述動(dòng)物中一個(gè)含有編碼選定蛋白的轉(zhuǎn)基因而另一個(gè)含有編碼重組酶的轉(zhuǎn)基因)來(lái)提供。
此處描述的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的克隆可根據(jù)以下文獻(xiàn)描述的方法制備，Wilmut等，自然(Nature)(1997)385810-813和PCT公開號(hào)WO 97/07668和WO 97/07669(將它們完整引入本文作為參考)。簡(jiǎn)言之，可以分離轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的細(xì)胞如體細(xì)胞，誘導(dǎo)其脫離生長(zhǎng)周期并進(jìn)入G0期。然后，通過(guò)應(yīng)用如電脈沖將此靜止細(xì)胞與去除細(xì)胞核的卵母細(xì)胞融合，所述去核卵母細(xì)胞與分離的靜止細(xì)胞來(lái)自同一動(dòng)物物種。然后培養(yǎng)重建的卵母細(xì)胞以使其發(fā)育成桑椹胚或胚細(xì)胞，然后將其轉(zhuǎn)移到假孕的雌性代孕動(dòng)物體內(nèi)。雌性代孕動(dòng)物生育的后代即是分離細(xì)胞(如體細(xì)胞)所來(lái)源的動(dòng)物的克隆。
本發(fā)明的額外用途及方法本發(fā)明的核酸分子、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)同源物和抗體以及這些部分的片段可用于一種或多種以下的方法中a)篩選試驗(yàn)；b)檢測(cè)試驗(yàn)(例如，染色體作圖、組織分型、法醫(yī)生物學(xué))；c)預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)(例如，診斷試驗(yàn)、預(yù)后試驗(yàn)、監(jiān)測(cè)臨床試驗(yàn)和藥物基因組學(xué))；和d)治療方法(如治療性和預(yù)防性的)。本發(fā)明的蛋白質(zhì)與其他細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用，因此可用于(i)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖；(ii)調(diào)節(jié)細(xì)胞分化；和(iii)調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，和(iv)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。本發(fā)明的分離的核酸分子可用于表達(dá)本發(fā)明的蛋白質(zhì)(例如，在基因治療應(yīng)用中在宿主細(xì)胞中通過(guò)重組表達(dá)載體表達(dá))，用于檢測(cè)本發(fā)明的mRNA(如在生物樣品中)或用于檢測(cè)本發(fā)明的基因中的遺傳損傷以及用于調(diào)節(jié)內(nèi)源mRNA、DNA或者蛋白質(zhì)的活性。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可用于篩選能調(diào)節(jié)該蛋白質(zhì)活性或表達(dá)以及治療特征是內(nèi)源性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生不足或過(guò)量的疾病的藥物或化合物。應(yīng)用本發(fā)明也可以針對(duì)與野生型蛋白質(zhì)相比活性降低或異常的蛋白質(zhì)形式的產(chǎn)生來(lái)進(jìn)行篩選。此外，本發(fā)明的抗體可用于檢測(cè)和分離蛋白質(zhì)，以及用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)以上描述的篩選試驗(yàn)鑒定新型藥劑，及其在此處描述的治療中的用途。
1.檢測(cè)和篩選試驗(yàn)存在內(nèi)源配體時(shí)激活G蛋白受體將允許G蛋白受體復(fù)合體形成，由此導(dǎo)致GTP結(jié)合G蛋白。G蛋白的GTPase結(jié)構(gòu)域可以將GTP緩慢水解為GDP，在正常情況下導(dǎo)致受體失活。但組成型激活的受體會(huì)持續(xù)將GDP轉(zhuǎn)變成GTP。
G蛋白的不可水解底物[35S]GTPγS可用于監(jiān)測(cè)G蛋白與如下胞膜增強(qiáng)的結(jié)合作用，其中所述胞膜表達(dá)組成型激活的受體。Traynor和Nahorski報(bào)道，[35S]GTPγS可用于監(jiān)測(cè)在存在和缺乏配體時(shí)與膜偶聯(lián)的G蛋白(Traynor等，Mol Pharmacol(1995)47(4)848-54)。該試驗(yàn)系統(tǒng)優(yōu)選用于候選化合物的起始篩選，因?yàn)樵撓到y(tǒng)可通用于所有G蛋白偶聯(lián)受體，而不必考慮與受體結(jié)合的具體G蛋白的種類。
Gs刺激腺苷酰環(huán)化酶，而Gi和Go抑制該酶。如在本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，腺苷酰環(huán)化酶催化ATP向cAMP轉(zhuǎn)化；因而，偶聯(lián)Gs蛋白的組成型活化GPCR將與提高的cAMP細(xì)胞水平相關(guān)聯(lián)。備選地，偶聯(lián)Gi(或Go)蛋白的組成型活化GCPRs將與降低的cAMP細(xì)胞水平相關(guān)聯(lián)，參見“突觸傳導(dǎo)的間接機(jī)制(Indirect Mechanism of Synaptic Transmission)”，第8章，從神經(jīng)元到腦(3rdEd.)，Nichols等編，Sinauer Associates，Inc.，1992。因此，檢測(cè)cAMP的試驗(yàn)可用于判定候選化合物是否為受體的逆向激動(dòng)劑。本領(lǐng)域內(nèi)已知的多種測(cè)定cAMP的方法均可以使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗-cAMP抗體用于基于ELISA的試驗(yàn)中。在另一實(shí)施方案中，則考慮全細(xì)胞第二信使報(bào)告系統(tǒng)(見PCT公開號(hào)WO 00/22131，并將其完整引入本文作為參考)。一個(gè)具體實(shí)施方案是下面“實(shí)施例5”中描述的SPA試驗(yàn)。
在一個(gè)相關(guān)的方面，環(huán)AMP通過(guò)促進(jìn)cAMP效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)的結(jié)合而驅(qū)使基因表達(dá)，其中cAMP效應(yīng)DNA結(jié)合蛋白或轉(zhuǎn)錄因子(CREB)然后在稱為cAMP效應(yīng)元件的特異性位點(diǎn)結(jié)合啟動(dòng)子并驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)。因此可構(gòu)建這樣的報(bào)告體系，其在報(bào)告基因如β-半乳糖苷酶或螢光素酶之前具有包含多個(gè)cAMP效應(yīng)元件的啟動(dòng)子。進(jìn)一步地，當(dāng)組成型活化的Gs-連接受體引起cAMP的累積時(shí)，則可激活基因并表達(dá)報(bào)告蛋白。然后可用標(biāo)準(zhǔn)的生物化學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)報(bào)告蛋白如β-半乳糖苷酶或螢光素酶(PCT公開號(hào)WO 00/22131，將其引入本文作為參考)。
其它G蛋白，如Go和Gq，與磷脂酶C的激活相關(guān)，所述磷脂酶又可水解磷脂PIP2釋放出兩個(gè)胞內(nèi)信使甘油二酯(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3積聚的增加與Gq-相關(guān)受體和Go-相關(guān)受體的激活相關(guān)聯(lián)(PCT公開號(hào)WO 00/22131，將其引入本文作為參考)。檢測(cè)IP3積聚的試驗(yàn)可用于判定候選化合物是否為Gq-相關(guān)受體或Go-相關(guān)受體的逆向激動(dòng)劑。Gq-相關(guān)受體還可用AP1報(bào)告試驗(yàn)檢測(cè)，該試驗(yàn)在于檢測(cè)Gq-依賴的磷脂酶C是否引起了含AP1元件的基因的激活。這樣，激活的Gq-相關(guān)受體將顯示為該基因表達(dá)的增強(qiáng)，而逆向激動(dòng)劑將顯示為該表達(dá)的減弱。
本發(fā)明提供了用于鑒定調(diào)節(jié)劑的方法(此處也稱作“篩選試驗(yàn)”)，所述調(diào)節(jié)劑即能結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)或?qū)缭摰鞍踪|(zhì)表達(dá)或活性具有刺激或抑制效應(yīng)的候選或測(cè)試化合物或試劑(例如，肽、肽模擬物(peptidomimetics)、小分子或其他藥物)。例如，本文描述的篩選試驗(yàn)可以用于鑒定作為所述受體的拮抗劑的化合物，其可用于治療支氣管哮喘。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于篩選如下候選或測(cè)試化合物的試驗(yàn)，所述化合物能結(jié)合膜結(jié)合形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)、多肽或其生物活性部分或調(diào)節(jié)其活性。本發(fā)明的測(cè)試化合物可應(yīng)用眾多手段之任一種在本領(lǐng)域內(nèi)公知的組合文庫(kù)方法中獲得，包括生物文庫(kù)；可空間尋址的平行固相或液相文庫(kù)；需要去褶合(deconvolution)的合成文庫(kù)方法；“單珠單化合物”文庫(kù)方法；和應(yīng)用親和層析選擇的合成文庫(kù)方法。生物文庫(kù)方法限于肽文庫(kù)，而其他四種方法適用于肽、非肽寡聚體或小分子化合物文庫(kù)(Lam，抗癌藥物研究(Anticancer Drug Des)(1997)12145)。
用于合成分子文庫(kù)的方法的實(shí)例可在本領(lǐng)域內(nèi)找到，例如DeWitt等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1993)906909；Erb等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1994)9111422；Zuckermann等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(J Med Chem)(1994)372678；Cho等，科學(xué)(Science)(1993)2611303；Carrell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332059；Carell等，Angew Chem Int Ed Engl(1994)332061和Gallop等，醫(yī)學(xué)化學(xué)雜志(JMed Chem)(1994)371233。
化合物文庫(kù)可呈現(xiàn)在溶液中(例如，Houghten Bio/Techniques(1992)13412-421)或珠子上(Lam，自然(Nature)(1991)35482-84)、芯片上(Fodor，自然(Nature)(1993)364555-556)、或細(xì)菌(美國(guó)專利號(hào)5,223,409)、孢子(美國(guó)專利號(hào)5,571,698；5,403,484和5,223,409)、質(zhì)粒(Cull等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1992)891865-1869)或噬菌體上(Scott等，科學(xué)(Science)(1990)249386-390；Devlin，科學(xué)(Science)(1990)249404-406；Cwirla等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876378-6382；和Felici，分子生物學(xué)雜志(J Mol Biol)(1991)222301-310)；將前面參考文獻(xiàn)的每一個(gè)的公開引入本文作為參考。
在本發(fā)明的一個(gè)特定實(shí)施方案中，試驗(yàn)為基于細(xì)胞的試驗(yàn)，其中在細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)(或其生物活性部分)的細(xì)胞與受試化合物接觸，并測(cè)定受試化合物結(jié)合該蛋白質(zhì)的能力。例如，細(xì)胞可為酵母細(xì)胞或哺乳動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞。測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合能力的測(cè)定可以通過(guò)例如以下方式進(jìn)行將測(cè)試化合物與放射性同位素或酶標(biāo)記偶聯(lián)，這樣測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)或其生物活性部分的結(jié)合可通過(guò)檢測(cè)復(fù)合體中的標(biāo)記化合物進(jìn)行確定。例如，測(cè)試化合物可直接或間接標(biāo)記125I、35S、14C或3H，放射性同位素的檢測(cè)可通過(guò)直接計(jì)數(shù)放射量或通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)進(jìn)行。備選地，測(cè)試化合物可應(yīng)用如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或螢光素酶進(jìn)行酶標(biāo)記，且酶標(biāo)記的檢測(cè)可通過(guò)測(cè)定適宜的底物向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化來(lái)實(shí)現(xiàn)。在特定的實(shí)施方案中，試驗(yàn)包括將在細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與可以結(jié)合所述蛋白質(zhì)的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測(cè)試化合物接觸并測(cè)定測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中對(duì)測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)相互作用的能力的測(cè)定包括測(cè)定測(cè)試化合物與已知化合物相比優(yōu)先與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物活性部分結(jié)合的能力。
在另一實(shí)施方案中，試驗(yàn)為基于細(xì)胞的試驗(yàn)，包括使細(xì)胞表面表達(dá)膜結(jié)合形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)或其生物活性部分的細(xì)胞與測(cè)試化合物接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)所述蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力。測(cè)試化合物調(diào)節(jié)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力可通過(guò)，例如，測(cè)定所述蛋白質(zhì)結(jié)合靶分子或與其相互作用的能力來(lái)確定。如此處所用，“靶分子”是指天然與本發(fā)明蛋白質(zhì)結(jié)合或作用的分子，如表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的細(xì)胞的表面分子、在第二細(xì)胞的表面上的分子、在細(xì)胞外周圍區(qū)域中的分子、與胞膜內(nèi)表面結(jié)合的分子或細(xì)胞質(zhì)分子。靶分子可以是另一種分子或本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶分子為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的成分，所述途徑促進(jìn)胞外信號(hào)(例如由化合物結(jié)合膜結(jié)合形式的本發(fā)明的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的信號(hào))通過(guò)細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，靶分子可為具有催化活性的第二胞內(nèi)蛋白質(zhì)或促進(jìn)下游信號(hào)分子關(guān)聯(lián)的蛋白質(zhì)。
本申請(qǐng)的蛋白質(zhì)與靶分子結(jié)合或作用的能力可通過(guò)以上描述的用于測(cè)定直接結(jié)合的其中一種方法來(lái)測(cè)定。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明蛋白質(zhì)與靶分子結(jié)合或作用的能力可通過(guò)測(cè)定靶分子的活性來(lái)確定。靶分子活性的測(cè)定方法有例如檢測(cè)靶分子對(duì)胞內(nèi)第二信使(如胞內(nèi)Ca2+、甘油二酯、IP3等)的誘導(dǎo)、檢測(cè)靶分子對(duì)合適底物的催化/酶促活性、檢測(cè)報(bào)告基因(例如有效連接編碼可檢測(cè)標(biāo)記(如螢光素酶)的核酸的效應(yīng)調(diào)控元件)的誘導(dǎo)或檢測(cè)細(xì)胞反應(yīng)，例如細(xì)胞分化或細(xì)胞增殖或功能。具體實(shí)施方案在下面的“實(shí)施例4”中描述，其中本發(fā)明的受體偶聯(lián)到Gα16以引起鈣應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)，包括將本發(fā)明蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸，并測(cè)定測(cè)試化合物結(jié)合所述蛋白質(zhì)或其生物活性部分的能力。測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)的結(jié)合可以如以上所描述的方式直接或間接進(jìn)行檢測(cè)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試驗(yàn)包括將本發(fā)明蛋白質(zhì)或其生物活性部分與能結(jié)合該蛋白質(zhì)的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測(cè)試化合物接觸并測(cè)定測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)相互作用的能力。其中對(duì)測(cè)試化合物與本發(fā)明蛋白質(zhì)相互作用的能力的測(cè)定包括測(cè)定測(cè)試化合物與已知化合物相比優(yōu)先結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物活性部分的能力。
本發(fā)明的另一無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)涉及將本發(fā)明蛋白質(zhì)或其生物活性部分與測(cè)試化合物接觸并測(cè)定測(cè)試化合物調(diào)節(jié)(如刺激或抑制)所述蛋白質(zhì)或其生物活性部分的活性的能力。對(duì)測(cè)試化合物調(diào)節(jié)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的活性的能力的測(cè)定可通過(guò)，例如利用以上描述的用于測(cè)定直接結(jié)合的其中一種方法測(cè)定所述蛋白質(zhì)結(jié)合靶分子的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。在備選的實(shí)施方案中，對(duì)測(cè)試化合物調(diào)節(jié)所述蛋白質(zhì)活性的能力的測(cè)定可通過(guò)測(cè)定所述蛋白質(zhì)進(jìn)一步調(diào)節(jié)靶分子的能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如，可以按前述測(cè)定靶分子對(duì)適當(dāng)?shù)孜锏拇呋?酶促活性。
本發(fā)明另一無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)包括將本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其生物活性部分與能結(jié)合所述蛋白質(zhì)的已知化合物接觸以形成試驗(yàn)混合物，將試驗(yàn)混合物與測(cè)試化合物接觸并測(cè)定測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)相互作用的能力，其中對(duì)測(cè)試化合物與所述蛋白質(zhì)相互作用的能力的測(cè)定包括測(cè)定所述蛋白質(zhì)優(yōu)先結(jié)合靶分子或調(diào)節(jié)靶分子的活性的能力。
受體可由非配體分子激活，所述非配體分子并不一定抑制配體結(jié)合但可引起受體結(jié)構(gòu)改變以致造成G蛋白結(jié)合或，可能的受體聚集、二聚化或簇集，從而引起激活作用。例如，可以針對(duì)暴露于細(xì)胞表面的本發(fā)明受體的多個(gè)部位產(chǎn)生抗體。如用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)(如監(jiān)測(cè)cAMP水平或胞內(nèi)Ca2+水平)所測(cè)定的，這些抗體可以通過(guò)G蛋白級(jí)聯(lián)激活細(xì)胞。由于涉及分子作圖，特別是表位作圖，單克隆抗體可能是優(yōu)選的。單克隆抗體可由表達(dá)于細(xì)胞表面的完整受體以及已知形成在細(xì)胞表面的肽引起?？蓱?yīng)用Geysen等，美國(guó)專利號(hào)5,998,577的方法以獲得大量的相關(guān)肽。
所發(fā)現(xiàn)的可激活本發(fā)明受體的抗體可經(jīng)過(guò)修飾以最小化與受體激活無(wú)關(guān)的活性，如補(bǔ)體結(jié)合。這樣，可對(duì)抗體分子實(shí)行截短或突變以使受體激活以外的活性最小或喪失。例如，對(duì)某些抗體，僅需要抗原結(jié)合部分。這樣，可去除抗體的Fc部分。
將表達(dá)本發(fā)明受體的細(xì)胞暴露于抗體以激活該受體。然后使激活的細(xì)胞暴露于多種分子以期鑒定出那些調(diào)節(jié)受體活性并導(dǎo)致更高激活水平或更低激活水平的分子。然后可對(duì)達(dá)此目的的分子在無(wú)抗體的情況下在表達(dá)本發(fā)明受體的細(xì)胞上進(jìn)行試驗(yàn)，以觀察對(duì)非激活細(xì)胞的效應(yīng)。然后可以用公知的技術(shù)檢測(cè)靶分子并將其修飾為候選藥物，用于治療與代謝改變相關(guān)的失調(diào)。
本發(fā)明的無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)適于應(yīng)用可溶形式和膜結(jié)合形式的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。對(duì)于包括膜結(jié)合形式的無(wú)細(xì)胞試驗(yàn)，可能需要利用增溶劑以使膜結(jié)合形式維持在溶液中。該增溶劑的實(shí)例包括非離子去污劑，如正辛基葡糖苷、正十二烷基葡糖苷、正十二烷基麥芽糖苷、辛酰基-N-甲基葡糖酰胺、癸?；?N-甲基葡糖酰胺、Triton X-100、Triton X-114、THESIT、異三癸基聚(乙二醇醚)n、3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸(CHAPS)、3-[(3-膽酰氨基丙基)二甲基銨]-2-羥基-1-丙磺酸(CHAPSO)或N-十二烷基-N，N-二甲基-3-銨-1-丙磺酸。
在本發(fā)明以上試驗(yàn)方法的不止一個(gè)實(shí)施方案中，可能需要固定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其靶分子以易于從非復(fù)合形式的一種或全部?jī)煞N所述蛋白質(zhì)中分離出復(fù)合形式，以及適于試驗(yàn)的自動(dòng)化。在存在或缺乏候選化合物時(shí)測(cè)試化合物與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的結(jié)合或所述蛋白質(zhì)與靶分子的相互作用可在任何適用于容納反應(yīng)物的容器內(nèi)完成。該容器的實(shí)例包括微量滴定板、試管和微離心管。在一個(gè)實(shí)施方案中，可提供融合蛋白，該融合蛋白添加有允許其中一種或全部?jī)煞N上述蛋白質(zhì)結(jié)合到基質(zhì)上的結(jié)構(gòu)域。例如可將谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/本發(fā)明融合蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶/靶融合蛋白吸附到谷胱甘肽Sepharose珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)上。備選地，然后將谷胱甘肽衍生的微量滴定板與測(cè)試化合物組合。接著，在利于形成復(fù)合體的條件下(例如在生理性鹽和pH條件下)，孵育非吸附靶蛋白或本發(fā)明的蛋白質(zhì)及混合物。孵育后，洗滌珠子或微量滴定板孔以移去任何未結(jié)合成分，然后直接或間接地測(cè)定復(fù)合體的存在。備選地，可以使復(fù)合體與基質(zhì)解離，且用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定結(jié)合或活性水平。
其他用于固定蛋白質(zhì)于基質(zhì)上的技術(shù)也可用于本發(fā)明的篩選試驗(yàn)。例如，可利用生物素和鏈霉親和素的偶聯(lián)固定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其靶分子。生物素化的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或靶分子可應(yīng)用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)(如生物素化試劑盒，Pierce Chemicals，Rockford，IL)從生物素-NHS(N-羥基-丁二酰亞胺)制備產(chǎn)生，并固定在鏈霉親和素包被的96孔板(Pierce Chemicals)的孔內(nèi)。備選地，可使用與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)但不阻礙本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合靶分子的抗體對(duì)平板的孔進(jìn)行衍生。孵育后，通過(guò)抗體綴合，將未結(jié)合的靶標(biāo)或本發(fā)明的蛋白質(zhì)捕獲在孔內(nèi)。除了以上描述的用于檢測(cè)GST-固定的復(fù)合體的方法外，用于檢測(cè)復(fù)合體的方法還包括應(yīng)用與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或靶分子反應(yīng)的抗體對(duì)復(fù)合體進(jìn)行的免疫檢測(cè)以及依賴于檢測(cè)與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或靶分子連結(jié)的酶促活性的酶聯(lián)試驗(yàn)。
在另一實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)表達(dá)的調(diào)節(jié)劑可通過(guò)如下方法鑒定，其中，使細(xì)胞與候選化合物接觸并測(cè)定胞內(nèi)本發(fā)明的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)。將存在候選化合物時(shí)本發(fā)明的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平與缺乏候選化合物時(shí)本發(fā)明的mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平進(jìn)行比較。然后，基于該比較，可以鑒定候選化合物是否為表達(dá)的調(diào)節(jié)劑。例如，當(dāng)mRNA或蛋白質(zhì)在存在候選化合物時(shí)的表達(dá)大于(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著大于)缺乏該化合物時(shí)的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的刺激劑或激動(dòng)劑。備選地，當(dāng)mRNA或蛋白質(zhì)在存在候選化合物時(shí)的表達(dá)低于(統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著低于)缺乏該化合物時(shí)的表達(dá)，則候選化合物被鑒定為mRNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制劑或拮抗劑。如果活性在存在配體或激動(dòng)劑時(shí)減少，或在組成型表達(dá)細(xì)胞中低于基線，則候選化合物被鑒定為逆向激動(dòng)劑。胞內(nèi)mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可由此處描述的用于檢測(cè)mRNA或蛋白質(zhì)的方法進(jìn)行測(cè)定。
而在本發(fā)明另一方面，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可在雙雜交或三雜交試驗(yàn)中用作“誘餌蛋白”(例如參見美國(guó)專利號(hào)5,283,317；Zervos等，細(xì)胞(Cell)(1993)72223-232；Madura等，生物化學(xué)雜志(J Biol Chem)(1993)26812046-12054；Bartel等，Bio/Techniques(1993)14920-924；Iwabuchi等，癌基因(Oncogene)(1993)81693-1696；和PCT公開號(hào)WO 94/10300，將每篇文獻(xiàn)的公開引入本文作為參考)，以鑒定其他與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合或作用并調(diào)節(jié)本發(fā)明的蛋白質(zhì)活性的蛋白質(zhì)。該結(jié)合蛋白也可能通過(guò)本發(fā)明的蛋白質(zhì)作為如信號(hào)途徑的上游或下游元件參與信號(hào)傳播。
由于本發(fā)明使得可以制備出大量的純的本申請(qǐng)蛋白質(zhì)，故可以確定出可能功能區(qū)域的構(gòu)象的物理特征，用于合理的藥物設(shè)計(jì)。例如，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域?yàn)樘貏e有意義的區(qū)域。一旦確定了區(qū)域的形狀和離子構(gòu)型，可與這些區(qū)域作用的候選藥物即可成型，然后可以在完整細(xì)胞、動(dòng)物和患者中進(jìn)行試驗(yàn)。能夠獲得此3-D結(jié)構(gòu)信息的方法包括X射線晶體學(xué)、NMR光譜學(xué)、分子模建等。3-D結(jié)構(gòu)也可導(dǎo)致鑒定出其他已知蛋白中的類似構(gòu)象位點(diǎn)，而對(duì)于所述蛋白已存在作用于此位點(diǎn)的已知藥物。這些藥物或其衍生物可能用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
上述之篩選方法對(duì)鑒定本發(fā)明受體之激動(dòng)劑、部分激動(dòng)劑、拮抗劑、逆向激動(dòng)劑或調(diào)節(jié)劑尤其有用，其為鑒定可治療各種疾病(這些疾病包括但不限于支氣管哮喘、COPD、過(guò)敏性鼻炎、過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性結(jié)膜炎、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥和局部缺血性再灌注損傷)之化合物提供了途徑。
本發(fā)明還涉及由以上篩選試驗(yàn)鑒定到的新藥劑，以及其在此處描述的治療中的應(yīng)用。
本發(fā)明DNA序列的部分或片段可在不同應(yīng)用中作為多核苷酸試劑。例如，序列可用于(i)在染色體上對(duì)相應(yīng)的基因繪圖并，由此定位與遺傳疾病相關(guān)的基因區(qū)域；(ii)從微小量生物樣品中對(duì)個(gè)體實(shí)施鑒定(組織分型)；和(iii)為生物樣品的法醫(yī)鑒定提供幫助。這些應(yīng)用在以下的分段中描述。
2.染色體作圖一旦分離出基因的序列(或序列的一部分)，則該序列可用于在染色體上作圖定位本發(fā)明的基因。因此，此處描述的核酸分子或其片段可用于在基因組上作圖定位?；蚪M上所述序列的作圖定位是確定序列與疾病相關(guān)基因的關(guān)系的重要一步。
簡(jiǎn)言之，通過(guò)從SEQ ID NO1公開的序列中制備PCR引物(優(yōu)選的長(zhǎng)度為15-25bp)，可以對(duì)基因在基因組上作圖。引物可用于包含單個(gè)人染色體的體細(xì)胞雜合體的PCR篩選。僅有包含與本發(fā)明的序列對(duì)應(yīng)的人基因的那些雜合體能產(chǎn)生擴(kuò)增片段。
通過(guò)不同哺乳動(dòng)物體細(xì)胞(例如人和小鼠細(xì)胞)的融合可以制備體細(xì)胞雜合體。隨著人類與小鼠之融合細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂，一般而言，人染色體將隨機(jī)消失，而小鼠之染色體則保留下來(lái)?？衫眯∈蠹?xì)胞不能生長(zhǎng)(缺乏特定的酶)而人類細(xì)胞可以生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，使含有所需酶之編碼基因的人染色體保留下來(lái)。通過(guò)使用多種培養(yǎng)基，就可建立細(xì)胞系細(xì)胞系組。組中的各細(xì)胞系含一條人染色體或幾條人類染色體或全部小鼠染色體，以此方式則易于將各基因定位于特定的人染色體。(D′Eustachio等人，Science(1983)220919-924)。僅含人染色體片段的體細(xì)胞雜合體可由具有轉(zhuǎn)座或缺失的人類染色體制成。
體細(xì)胞雜合體的PCR作圖是一種將特定序列定位于特定染色體上的快速方法。每臺(tái)熱循環(huán)儀每天可定位三段或更多的序列?？深愃频赜糜趯⑿蛄凶鲌D定位到基因組特定染色體上的其他作圖策略包括原位雜交(描述于Fan等，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊(Proc Natl Acad USA)(1990)876223-27)、用標(biāo)記的流式分揀染色體預(yù)篩選和通過(guò)與染色體特異的cDNA文庫(kù)雜交進(jìn)行預(yù)選擇。
也可使用DNA序列與中期染色體鋪展物的熒光原位雜交(FISH)一步提供精確的染色體定位。染色體鋪展物的制備可應(yīng)用被化學(xué)物阻滯在分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行，所述化學(xué)物如可破壞有絲分裂紡錘體的秋水仙堿。染色體可以用胰蛋白酶短暫處理然后進(jìn)行Giemsa染色。每條染色體上會(huì)出現(xiàn)亮帶和暗帶圖案，由此可鑒定出各染色體。FISH技術(shù)可應(yīng)用短至500或600個(gè)堿基的DNA序列進(jìn)行。但是，大于1,000個(gè)堿基的克隆更有可能結(jié)合獨(dú)特的染色體位置并產(chǎn)生足夠的信號(hào)強(qiáng)度以便簡(jiǎn)單檢測(cè)。優(yōu)選地1,000個(gè)堿基且更優(yōu)選地2,000個(gè)堿基將足以在合理的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生好的結(jié)果。參見Verma等的涉及該技術(shù)的綜述(人類染色體基礎(chǔ)操作手冊(cè)(HumanChromosomesA Manual of Basic Techniques)(Pergamon Press，NewYork，1988))。染色體作圖可以在硅片上(in silico)考慮統(tǒng)計(jì)學(xué)因素，如優(yōu)勢(shì)對(duì)數(shù)得分或單純接近度(mere proximity)進(jìn)行推斷。
用于染色體作圖的試劑可單個(gè)應(yīng)用以定位染色體上的單一位點(diǎn)。此外，可應(yīng)用一組試劑標(biāo)記多個(gè)位點(diǎn)和/或多條染色體。對(duì)作圖目的，實(shí)際上優(yōu)選對(duì)應(yīng)于所述基因兩翼區(qū)域的試劑。編碼序列在基因家族內(nèi)更可能保守，因此增加了染色體作圖中交叉雜交的機(jī)會(huì)。
一旦將序列繪制在精確的染色體位置，則可以將序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)聯(lián)系起來(lái)。然后，基因和繪圖定位于同一染色體區(qū)域的疾病之間的關(guān)系，可通過(guò)連鎖分析進(jìn)行確定(物理上鄰近的基因的共遺傳)，如參見Egeland等，自然(Nature)(1987)325783-787中的描述。
此外，可測(cè)定受到或未受到本發(fā)明的蛋白質(zhì)相關(guān)疾病影響的個(gè)體之間DNA序列的差異。如果在一些或全部的受影響個(gè)體中觀察到突變而未在任何未受影響的動(dòng)物中觀察到此突變，則該突變可能為特定疾病的致病因子。對(duì)受到影響和未受到影響的動(dòng)物的比較一般包括首先在染色體中尋找結(jié)構(gòu)的改變，如缺失或易位，所述改變可在染色體鋪展物中觀察到或可應(yīng)用基于該DNA序列的PCR檢測(cè)到。最終，可對(duì)來(lái)自幾個(gè)動(dòng)物的基因進(jìn)行完整測(cè)序，以證實(shí)突變的存在并將突變與多態(tài)性區(qū)分開來(lái)。
3.診斷試驗(yàn)用于檢測(cè)生物樣品中本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)存在與否的示例性方法包括從受試者中獲得生物樣品，并將生物樣品與可檢測(cè)所述蛋白質(zhì)或核酸(如mRNA或基因組DNA)的化合物或試劑接觸，以檢測(cè)生物樣品中的存在。用于檢測(cè)mRNA或基因組DNA的優(yōu)選試劑為能夠與本發(fā)明的mRNA或基因組DNA雜交的標(biāo)記核酸探針。核酸探針可為，例如全長(zhǎng)核酸，如SEQ ID NO1的核酸或其部分，如長(zhǎng)度為至少15、30、50、100、250、500或更多個(gè)核苷酸并且足于在嚴(yán)格的條件下特異雜交到mRNA或基因組DNA上的寡核苷酸?？捎糜诒景l(fā)明診斷試驗(yàn)的其它合適探針在本文中有描述。
用于檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的一個(gè)特定試劑為能夠結(jié)合所述蛋白質(zhì)的抗體，優(yōu)選地為帶有可檢測(cè)標(biāo)記的抗體?？贵w可為多克隆的、嵌合的或更優(yōu)選地為單克隆的。可應(yīng)用完整的抗體或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。術(shù)語(yǔ)“生物樣品”意在包括從受試者分離的組織、細(xì)胞和生物液體，以及存在于受試者體內(nèi)的組織、細(xì)胞和液體。即，本發(fā)明的檢測(cè)方法可用于在體外及體內(nèi)檢測(cè)生物樣品中的mRNA、蛋白質(zhì)或基因組DNA。例如，用于體外檢測(cè)mRNA的技術(shù)包括Northern雜交和原位雜交。用于在體外檢測(cè)所述蛋白質(zhì)的技術(shù)包括ELISA、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫熒光。用于體外檢測(cè)基因組DNA的技術(shù)包括Southern雜交。此外，用于體內(nèi)檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)包括向受試者體內(nèi)導(dǎo)入標(biāo)記的抗-本發(fā)明的蛋白質(zhì)的抗體。例如，可給抗體標(biāo)記上放射性標(biāo)記物，其在受試者體內(nèi)的存在和部位可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)成像技術(shù)檢測(cè)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，生物樣品含有來(lái)自受試者的蛋白質(zhì)分子?；蛘?，生物樣品可以含有來(lái)自受試者的mRNA分子或來(lái)自受試者的基因組DNA分子?？梢詰?yīng)用于此處的一個(gè)特定的生物樣品是利用常規(guī)手段從受試者分離到的嗜中性粒細(xì)胞樣品。
因此，在開發(fā)預(yù)后或診斷實(shí)驗(yàn)時(shí)，將鑒定核酸或蛋白質(zhì)的多態(tài)性與疾病聯(lián)系起來(lái)用于診斷攜帶者或患者可能是有益的。例如，對(duì)于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、節(jié)段性回腸炎等，具有預(yù)后或診斷試驗(yàn)將是有益的。在與活化或發(fā)炎狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞中，本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)的表達(dá)提升。與發(fā)炎相關(guān)的失調(diào)癥包括，過(guò)敏狀態(tài)、結(jié)腸炎、節(jié)段性回腸炎、水腫狀態(tài)、接觸性過(guò)敏、過(guò)敏癥、其它形式之關(guān)節(jié)炎、腦膜炎及免疫系統(tǒng)藉由血管擴(kuò)張、發(fā)熱、聚集細(xì)胞、體液等對(duì)刺激產(chǎn)生反應(yīng)而造成刺激部位腫脹等之其它狀況。因此，代謝的失調(diào)可以用于診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。而且，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制可能是可檢測(cè)的，例如，可能存在可以在組織樣品(如血液樣品)中進(jìn)行檢測(cè)的診斷性SNP、RFLP、表達(dá)水平的變化性、功能的變化性等等。
在另一實(shí)施方案中，這些方法還包括從對(duì)照受試者獲得生物樣品；使對(duì)照樣品與能夠檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的化合物或試劑接觸，以便檢測(cè)生物樣品中蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和量；和將對(duì)照樣品中蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和量與測(cè)試樣品中蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的存在和量進(jìn)行比較。
4.高通量篩選化學(xué)文庫(kù)能調(diào)節(jié)本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)活性的化合物之任何分析法均經(jīng)得起實(shí)施高通量篩選。高通量篩選系統(tǒng)為市售可得[參見，例如，Zymark Corp.，Hopkinton，MA；Air Technical Industries，Mentor，OH；BeckmanInstruments，Inc.Fullerton，CA；Precision Systems，Inc.，Natick，MA等]。這些系統(tǒng)典型地使整個(gè)程序自動(dòng)化，包括適用于該分析法的所有樣品與試劑的吸取、液體的分配、定時(shí)孵育、及檢測(cè)器中微量培養(yǎng)板之最后讀取。這些可配置系統(tǒng)提供了高通量及迅速的啟動(dòng)，以及高度靈活性與使用者自定性。這些系統(tǒng)之廠商提供了有關(guān)多種高通量操作之詳細(xì)方案。舉例而言，Zymark Corp.提供了敘述用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、配體結(jié)合等的篩選系統(tǒng)之技術(shù)公報(bào)。
5.試劑盒本發(fā)明還包括檢測(cè)生物樣品(測(cè)試樣品)中本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)的存在的試劑盒。該試劑盒可以用于確定受試者是否患有或有增加的危險(xiǎn)性患有與異常表達(dá)相關(guān)的疾病(例如免疫學(xué)失調(diào))。例如，該試劑盒可以包含能夠檢測(cè)生物樣品中的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或mRNA的標(biāo)記化合物或試劑以及用于檢測(cè)樣品中核酸或蛋白質(zhì)的量的手段(例如，抗體或寡核苷酸探針)。當(dāng)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或mRNA的量高于或低于正常水平時(shí)，試劑盒還可以用于得出表明受試者是否患者或有危險(xiǎn)患有與本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)異常表達(dá)相關(guān)的疾病的結(jié)果。
對(duì)于基于抗體的試劑盒，其可以包含例如(1)可與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合的第一抗體(例如附著在固相支持物上)；和，任選地，(2)可與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或與第一抗體結(jié)合并綴合有可檢測(cè)試劑的第二種不同的抗體。如果不存在第二抗體，則可以可檢測(cè)地標(biāo)記第一抗體，或者對(duì)能與第一抗體結(jié)合的另一分子進(jìn)行可檢測(cè)的標(biāo)記。正如本領(lǐng)域已知的，無(wú)論如何都應(yīng)包括已標(biāo)記的結(jié)合部分以充當(dāng)可檢測(cè)的報(bào)道分子。
對(duì)于基于寡核苷酸的試劑盒，本發(fā)明的試劑盒可以包含，例如(1)可與本發(fā)明的核酸序列雜交的寡核苷酸，例如可檢測(cè)標(biāo)記的寡核苷酸或(2)可用于擴(kuò)增本發(fā)明的核酸分子的引物對(duì)。
試劑盒還可以包含例如緩沖劑、防腐劑或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。試劑盒還可以包含在探測(cè)可檢測(cè)試劑(例如酶或底物)時(shí)所必需的成分。試劑盒還可以含有可以進(jìn)行分析和與測(cè)試樣品進(jìn)行比較的對(duì)照樣品或一系列對(duì)照樣品。試劑盒的每一個(gè)成分通常裝在不同的容器中，并且所有這些不同容器被放在一個(gè)包裝中。此外，還可以裝入說(shuō)明書和背景信息。
6.在臨床試驗(yàn)過(guò)程中監(jiān)測(cè)療效監(jiān)測(cè)藥劑(例如，藥物或化合物)對(duì)本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)表達(dá)或活性的影響(例如，調(diào)節(jié)異常細(xì)胞增殖、分化和/或功能的能力)既可以應(yīng)用于基礎(chǔ)藥物篩選中也可以應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中。例如，可以在表現(xiàn)出降低的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性的受試者的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)藥劑(通過(guò)本文描述的篩選試驗(yàn)確定的)在增加基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性方面的有效性?；蛘撸梢栽诒憩F(xiàn)出增加的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性的受試者的臨床試驗(yàn)中，監(jiān)測(cè)藥劑(通過(guò)本文描述的篩選試驗(yàn)確定的)在降低基因表達(dá)、蛋白質(zhì)水平或蛋白質(zhì)活性方面的有效性。在這些臨床試驗(yàn)中，所述基因的表達(dá)或活性以及，優(yōu)選地，其它基因(例如，細(xì)胞增殖疾病所涉及的基因)的表達(dá)或活性可以用作特定細(xì)胞的免疫應(yīng)答性的標(biāo)記物。例如，但不限于，可以鑒定當(dāng)用調(diào)節(jié)本發(fā)明的核酸或蛋白質(zhì)活性的藥劑(例如，化合物、藥物或小分子)(例如，本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的藥劑)處理時(shí)細(xì)胞中可以被調(diào)節(jié)的基因(包括本發(fā)明的基因)。因此，例如，在臨床試驗(yàn)中，為了研究藥劑對(duì)細(xì)胞增殖疾病的作用，可以分離細(xì)胞，制備RNA并分析本發(fā)明的核酸及參與該疾病的其它基因的表達(dá)水平。基因表達(dá)水平(即，基因表達(dá)圖式)可以通過(guò)如下方式定量按本文所述進(jìn)行Northern印跡分析或RT-PCR，或者，作為備選方案，利用本文所述方法之一測(cè)量產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的量或測(cè)量本發(fā)明的基因或其它基因的活性水平。以此方式，基因表達(dá)圖式可以作為標(biāo)記物指示細(xì)胞對(duì)藥劑的生理反應(yīng)。由此，可以在使用藥劑治療個(gè)體之前以及治療過(guò)程中的不同點(diǎn)上，確定反應(yīng)狀態(tài)。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種方法，由此可以監(jiān)測(cè)使用藥劑(例如，通過(guò)本文所述篩選試驗(yàn)鑒定的激動(dòng)劑、拮抗劑、肽模擬物、蛋白質(zhì)、肽、核酸、小分子或其它候選藥物)治療受試者的療效，該方法包括步驟(i)在施用藥劑前從受試者獲得用藥前樣品；(ii)檢測(cè)用藥前樣品中本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)水平；(iii)從受試者獲得一個(gè)或多個(gè)用藥后樣品；(iv)檢測(cè)用藥后樣品中本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平；(v)對(duì)用藥前樣品中本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平與一個(gè)或多個(gè)用藥后樣品中本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水平進(jìn)行比較；和(vi)據(jù)此改變患者的藥劑施用方案。例如，可能期望增加藥劑施用以增加本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性，使之超過(guò)所檢測(cè)到的水平，即，增加藥劑的效力?；蛘?，可能期望降低藥劑施用以降低本發(fā)明的蛋白質(zhì)、mRNA或基因組DNA的表達(dá)或活性水，使之低于所檢測(cè)到的水平，即，降低藥劑的效力。
下面的實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1克隆豚鼠DP受體的起始外顯子DNA片段欲克隆豚鼠DP受體cDNA，首先采用PCR從基因組DNA來(lái)克隆該DP受體的外顯子片段。利用Sequencher程序(Gene Codes，Ann Arbor MI)比對(duì)人類(U31332)、小鼠(NM_008962)和大鼠(NM_022241)DP受體序列之保留區(qū)以設(shè)計(jì)一系列PCR引物。豚鼠基因組DNA購(gòu)自CeMines(Evergreen，Co.)。用于擴(kuò)增豚鼠基因組DNA的420bp片段之引物由引物675_Topo_F3(SEQ ID NO3GGGACACCCTTTCTTCTACAA)和675_Topo_R2(SEQ ID NO4GAACACATGGTGAAGAGCACTG)進(jìn)行。PCR產(chǎn)物由TOPO-TA克隆儀(Invitrogen，Carlsbad CA)按廠商說(shuō)明克隆，插入序列由ABI 3100DNA測(cè)序儀按廠商說(shuō)明測(cè)序。
3’和5’RACE-PCR克隆將所得之DNA序列與人類、小鼠和大鼠的DP序列比對(duì)。比對(duì)顯示，PCR產(chǎn)物序列雖同源卻不同于來(lái)自所檢查的物種的DP受體共有序列(圖3)。用豚鼠DP受體共有序列來(lái)設(shè)計(jì)額外的引物并采用DNA末端快速擴(kuò)增法(RACE)來(lái)延長(zhǎng)克隆的序列。為了獲得DP受體轉(zhuǎn)錄物的3’端，可采用Clontech(BD Biosciences之分公司，Palo Alto CA)的SMART RACE系統(tǒng)。采用引物675_GP_3’RACE_F(SEQ ID NO5GTGCTCGTGGCGCCGGTGTG)和由豚鼠肺mRNA轉(zhuǎn)化的cDNA模板來(lái)延長(zhǎng)豚鼠DP受體mRNA序列。將RACE產(chǎn)物克隆到PCR4-Topo(Invitrogen，Carlsbad CA)，然后經(jīng)上述之測(cè)序和比對(duì)來(lái)揭示DP受體的編碼序列的整個(gè)3’端延長(zhǎng)部分。為了分離豚鼠DP受體cDNA之5’端，使用引物675_Rev_P2(SEQ ID NO6CACATGGTGAAGAGCACGGTCATGA)來(lái)進(jìn)行SMART RACE，生成1kb PCR產(chǎn)物。以經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物為模板，用引物675_RACE_R9(SEQ ID NO7TCACCAGGCACTTGCCTAGCAGGTCTGT)來(lái)進(jìn)行5’嵌套R(shí)ACE。將RACE產(chǎn)物克隆到PCR4-Topo(Invitrogen)，如上述測(cè)序和比對(duì)，揭示DP受體之編碼序列的整個(gè)5’端延長(zhǎng)部分。
構(gòu)建編碼豚鼠DP受體之cDNA用Gene Construction Kit(Textco，Keene NH)程序來(lái)鑒定DP受體之編碼序列。設(shè)計(jì)與Gateway克隆相匹配引物(GW675，正向引物SEQ IDNO8AAAAGCAGGCTTAGGAATGTCCTTCTATCCCTGCAACAC；GW675，反向引物SEQ ID NO9AAGAAAGCTGGGTCTCACAGACTGGATTCCACGTTAG)來(lái)位于該編碼序列的側(cè)翼并將其與從豚鼠卵白蛋白質(zhì)刺激的肺細(xì)胞得到的cDNA一道用于PCR反應(yīng)。10個(gè)單位的FU Turbo(Stratagene，La Jolla CA)熱穩(wěn)定聚合酶和100ng模板cDNA用于進(jìn)行PCR。將所生成的1.1kb DNA片段按QiaQuick方案(Qiagen)用凝膠電泳層析法純化后再通過(guò)GatewayBP重組酶克隆方法(Invitrogen)克隆到pDONR201載體。將克隆反應(yīng)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli DH5-α，取所得菌落的少量制備DNA進(jìn)行測(cè)序以證實(shí)完整DP受體編碼序列的克隆。
實(shí)施例2RNA印跡分析用豚鼠DP受體的起始基因組DNA片段進(jìn)行RNA印跡分析(圖5)。將經(jīng)卵白蛋白刺激或未接受卵白蛋白刺激的雄性Hartley豚鼠的肺切除。對(duì)比未受到卵白蛋白刺激(泳道2)的豚鼠總肺RNA表達(dá)和受到卵白蛋白刺激(泳道3)的豚鼠總肺RNA表達(dá)。與經(jīng)光譜和18S RNA帶強(qiáng)度分析，RNA載入量相當(dāng)。DP受體之RNA印跡分析鑒定出了豚鼠肺中3-4kbmRNA，其大小與前人報(bào)導(dǎo)的小鼠和人類DP之轉(zhuǎn)錄物(Hirata等人，1994；Boie等人，1995)吻合。該mRNA在受卵白蛋白敏化和刺激的豚鼠肺中明顯上調(diào)，此結(jié)果與先前有關(guān)DP受體在受抗原刺激的小鼠肺中上調(diào)的報(bào)導(dǎo)相當(dāng)(Matsuoka等人，2000)。這些數(shù)據(jù)支持了DP在豚鼠肺中哮喘反應(yīng)中的重要性。
實(shí)施例3豚鼠的直向同源物DP受體的序列分析豚鼠DP受體之核苷酸序列如圖1所示，其氨基酸序列如圖2所示。豚鼠DP的cDNA含1,032bp的可讀框，其編碼345個(gè)氨基酸之蛋白質(zhì)(理論分子量為38,250)。
豚鼠DP蛋白質(zhì)包含兩個(gè)潛在的N-糖基化位置，即氨基末端的Asn-7和第一個(gè)細(xì)胞外環(huán)的Asn-86。另外，還有兩個(gè)潛在的蛋白質(zhì)激酶C磷酸化位點(diǎn)，即分別位于第一和第三混溶細(xì)胞質(zhì)環(huán)中的Ser-46和Thr-140。
豚鼠DP受體的核苷酸序列與人類、大鼠和小鼠DP的相應(yīng)序列之比較由圖1示出。在蛋白質(zhì)水平上類似地，與豚鼠DP受體之序列的同一性對(duì)于人DP為66％，對(duì)于小鼠DP為63％，對(duì)于大鼠DP為65％(圖2)。
親水性分析證實(shí)了七個(gè)假定跨膜結(jié)構(gòu)域的存在，這些區(qū)域的位置與先前所定義的小鼠、大鼠和人類DP序列之保留區(qū)的位置相同。在DP直向同源物間，序列保留性在跨膜結(jié)構(gòu)域中最高。兩段據(jù)前人報(bào)導(dǎo)為前列腺素類家族之GPCR所特別保留的序列也存在于豚鼠DP蛋白質(zhì)中所有DP直向同源物中第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)中的QYCPGTWCR和第七跨膜結(jié)構(gòu)域中的RFLSVISIVDPWIFI都是相同的。
對(duì)于不同物種，TMD VI和VII之間細(xì)胞外環(huán)也顯示出不同。即該環(huán)在直向同源物之間不同，在人類、大鼠、小鼠和豚鼠DP中該環(huán)的長(zhǎng)度分別是24、21、21和18個(gè)氨基酸。尤其令人關(guān)注的是豚鼠DP中TMD VI和VII之間的氨基酸數(shù)目要比人類DP受體的少六個(gè)氨基酸。此外，小鼠和大鼠DP受體中該區(qū)域少了3個(gè)氨基酸。Kobayashi等(2000)制備了一系列的嵌合IP-DP受體來(lái)定義使DP具有配體結(jié)合選擇性的區(qū)域。令人感興趣的是，他們所發(fā)現(xiàn)的對(duì)PGD2選擇性和有效結(jié)合有重大作用的區(qū)域之一就是穿膜VI-VII區(qū)，即新近克隆的豚鼠DP受體中缺少了6個(gè)氨基酸的該相同區(qū)域。配體親和性或化合物功效的種間差異也許源于TMD VI-VII環(huán)內(nèi)的相互作用和豚鼠受體上該環(huán)中的變異。
豚鼠DP蛋白質(zhì)中第一和第三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)要分別短3和5個(gè)氨基酸，而在小鼠、人類和大鼠DP蛋白質(zhì)中這些細(xì)胞內(nèi)環(huán)大小都相同。Kobayashi等還強(qiáng)調(diào)了就PGD2結(jié)合而言，第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)Φ谝粋€(gè)細(xì)胞外環(huán)區(qū)的重要性。鑒于豚鼠DP中第一個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)比人類、小鼠和大鼠DP的短3個(gè)氨基酸，該區(qū)域可能是造成受體結(jié)合親和性的額外區(qū)域。受體的該區(qū)域還可能是化合物對(duì)人類和豚鼠DP具有不同親和性的原因。豚鼠DP中第三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)(介于TMD V和VI之間)少了5個(gè)氨基酸，它是造成PGD2功能相關(guān)的受體上的另一個(gè)區(qū)域。
實(shí)施例4pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建由PCR得到小鼠DP受體之全長(zhǎng)cDNA，然后采用Gateway BP重組酶克隆法將其克隆到pDONR201載體。所制成的小鼠DP載體與上述的豚鼠DP載體類似。經(jīng)DNA測(cè)序確定，該小鼠DP cDNA與Genbank檢索號(hào)NM_008962表示的以前描述的小鼠DP序列相同。為了進(jìn)行表達(dá)研究，將小鼠和豚鼠之DP受體由LR反應(yīng)亞克隆到pEAK10表達(dá)載體(EdgeBiosystems)，其已經(jīng)受到Gateway改造。pEAK10載體的Gateway改造是指以EcoRI消化，然后經(jīng)過(guò)Klenow填充將Gateway盒克隆到該載體。所生成的載體pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP用來(lái)制備下文所述之穩(wěn)定細(xì)胞系。
HEK293-Gα16細(xì)胞系的生成如所述的(Amatruda等人，1991)克隆編碼人Gα16的cDNA。簡(jiǎn)單而言，將HL-60人前髓細(xì)胞的總RNA分離出來(lái)并以之為模板在PCR中合成編碼Gα16的cDNA。將所得PCR產(chǎn)物克隆到表達(dá)載體pHook-3(Invitrogen)，其也共表達(dá)單鏈抗體(sFv)以允許用半抗原包被的磁珠用淘選方案方便地富集經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Chesnut等人，1996)。用構(gòu)建的質(zhì)粒(pGα16)來(lái)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行Zeocin選擇，然后按廠商說(shuō)明書經(jīng)磁珠富集陽(yáng)性克隆。對(duì)于最后的純化和選擇，令單個(gè)克隆單獨(dú)生長(zhǎng)，然后取等分試樣用與Gαs(GIP受體)自然偶聯(lián)的任選GPCR之表達(dá)載體另外轉(zhuǎn)染以分析Gα16的功能表達(dá)，最后用Molecular Devices Corp制造的FLIPR儀來(lái)測(cè)試經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鈣信號(hào)傳遞。
pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP在HEK293-Gα16細(xì)胞中的表達(dá)按照廠商的說(shuō)明利用Lipofectamine 2000(Gibco)來(lái)用pEAK10-gpDP和pEAK10-mDP載體轉(zhuǎn)染HEK293-Gα16細(xì)胞系。培育經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，由1ug/ml的嘌呤霉素和250ug/ml的Zeocin選擇5周。測(cè)量應(yīng)答PGD2刺激的細(xì)胞內(nèi)鈣釋放來(lái)監(jiān)視DP受體在經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體中的表達(dá)。
細(xì)胞內(nèi)鈣分析為了進(jìn)行功能鑒定，用新克隆的豚鼠DP受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293-Gα16細(xì)胞，并用小鼠DP受體產(chǎn)生等同細(xì)胞系供比較之用。對(duì)這兩種表達(dá)DP受體的細(xì)胞系以及不表達(dá)任何轉(zhuǎn)染的DP受體的親代細(xì)胞系進(jìn)行第二信使分析，使用DP受體與Gα16的結(jié)合來(lái)引發(fā)鈣反應(yīng)。用未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293-Gα16細(xì)胞或經(jīng)pEAK10-gpDP或pEAK10-mDP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)鈣測(cè)量。將經(jīng)轉(zhuǎn)染或未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種于384孔板中。用鈣分析緩沖液沖洗細(xì)胞3次。然后將細(xì)胞在37℃的4μM載鈣染料Fura-4/AM(Molecular Probes)中孵育數(shù)分鐘。用鈣分析緩沖液再?zèng)_洗三次以除去未摻入的fura-4/AM。在Fura-4/AM裝載的細(xì)胞受到PGD2或緩沖液刺激后，用FLIPR儀(Molecular Devices Corp.)來(lái)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的鈣。如圖6所示，PGD2刺激使豚鼠和小鼠之DP表達(dá)細(xì)胞系中的細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員急劇增加，EC50值分別為1.4nM和18nM。兩種細(xì)胞系中鈣釋放的最大值相當(dāng)。相比，親代HEK293-Gα16細(xì)胞系只在很高的PGD2濃度(即，高于10μM PGD2)下顯示出鈣反應(yīng)。
實(shí)施例5SPA cAMP分析新克隆的豚鼠DP受體的額外功能的鑒定利用DP的天然信號(hào)通路，即腺苷酸環(huán)化酶刺激cAMP的產(chǎn)生。經(jīng)轉(zhuǎn)染或未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以每孔40,000個(gè)細(xì)胞接種在96孔板。在37℃過(guò)夜孵育后，更換培養(yǎng)基并用確定濃度的PGD2刺激細(xì)胞15分鐘。按照生產(chǎn)商的方法，采用cAMP SPA直接篩選分析系統(tǒng)(Amersham)來(lái)測(cè)量受刺激的細(xì)胞中cAMP的積累。如圖7所示，豚鼠DP細(xì)胞系顯示出對(duì)PGD2刺激的良好cAMP反應(yīng)，該反應(yīng)與小鼠DP受體的反應(yīng)相當(dāng)。豚鼠和小鼠DP細(xì)胞系的EC50值分別為0.8nM和0.5nM，且兩種受體的最大反應(yīng)相當(dāng)。相比，親代HEK293-Gα16細(xì)胞系在受到PGD2的刺激后細(xì)胞內(nèi)cAMP并未增加。
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ctcatggcgc tgttggtgct cgccatcgtg ctgtgcaacc tgggcgccat gcgcaacctc 660tacaccatgc accagcgcct gcgacggcac acgcgctgct gcagcctccg ggaccgcgcg 720ggcgaggcgt ttccgcaatc cttggaggag ctggaccacc tgctgctgct ggccctcatg 780accgtgctct tcaccatgtg cactctgccg ttagtttatc gcgcttacta tggagcattt 840aaagctgtcg aagaggagcc cgacgacctc ctagccttgc gttttctctc tgtgatttca 900atcgtggacc cttggatctt tatcattttc agaacttcag tatttcggat gttttttcac 960aagattttca taagacctct tctttaccga aactggcact gccacttcta ccaaactaac 1020gtggaatcca gtctgtga 1038<210>2<211>345<212>PRT<213>豚鼠<400>2Met Ser Phe Tyr Pro Cys Asn Thr Thr Ala Ser Val Arg Ser Gly Asn1 5 10 15Ser Ala Thr Val Gly Gly Val Leu Phe Ser Ala Gly Leu Leu Gly Asn20 25 30Leu Leu Ala Leu Ala Leu Leu Ala Arg Ser Gly Leu Gly Ser Cys Arg35 40 45Pro Arg Pro Gln Pro Ser Val Phe Tyr Val Leu Val Cys Gly Leu Thr50 55 60Val Thr Asp Leu Leu Gly Lys Cys Leu Val Ser Pro Val Val Leu Ala65 70 75 80
Ala Tyr Ala Gln Asn Arg Ser Leu Arg Gly Leu Ala Pro Ala Gln Gly85 90 95Asp Ser Leu Cys Gln Ala Phe Ala Phe Ile Met Ser Phe Phe Gly Leu100 105 110Ala Ser Thr Leu Gln Leu Leu Ala Met Ala Leu Glu Cys Trp Leu Ser115 120 125Leu Gly His Pro Phe Phe Tyr Gln Arg His Ile Thr Val Arg Arg Gly130 135 140Val Leu Val Ala Pro Ala Val Gly Ala Phe Ser Leu Ala Phe Cys Ala145 150 155 160Leu Pro Phe Val Gly Phe Gly Asn Phe Val Gln Tyr Cys Pro Gly Thr165 170 175Trp Cys Phe Phe Gln Met Ile Ser Gly Asp Asp Ser Pro Ser Val Lys180 185 190Gly Tyr Ser Val Leu Tyr Ser Thr Leu Met Ala Leu Leu Val Leu Ala195 200 205Ile Val Leu Cys Asn Leu Gly Ala Met Arg Asn Leu Tyr Thr Met His210 215 220Gln Arg Leu Arg Arg His Thr Arg Cys Cys Ser Leu Arg Asp Arg Ala225 230 235 240Gly Glu Ala Phe Pro Gln Ser Leu Glu Glu Leu Asp His Leu Leu Leu245 250 255
Leu Ala Leu Met Thr Val Leu Phe Thr Met Cys Thr Leu Pro Leu Val260 265 270Tyr Arg Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Lys Ala Val Glu Glu Glu Pro Asp275 280 285Asp Leu Leu Ala Leu Arg Phe Leu Ser Val Ile Ser Ile Val Asp Pro290 295 300Trp Ile Phe Ile Ile Phe Arg Thr Ser Val Phe Arg Met Phe Phe His305 310 315 320Lys Ile Phe Ile Arg Pro Leu Leu Tyr Arg Asn Trp His Cys His Phe325 330 335Tyr Gln Thr Asn Val Glu Ser Ser Leu340 34權(quán)利要求
1.分離的核酸分子，其包含SEQ ID NO1的核酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中該核酸編碼SEQ ID NO2的多肽。
3.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，該核酸分子還包含可檢測(cè)的標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3的分離的核酸分子，其中可檢測(cè)的標(biāo)記包括酶、放射性同位素或發(fā)熒光的化學(xué)物質(zhì)。
5.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中該核酸序列選自RNA、合成的RNA、基因組DNA、合成的DNA和cDNA。
6.分離的核酸分子，其包含與SEQ ID NO1的核酸序列雜交的核酸序列。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸分子，其中該核酸序列在嚴(yán)格條件下雜交。
8.權(quán)利要求7的分離的核酸分子，其中雜交在約45℃下6×SSC中進(jìn)行，隨后在約50-65℃下0.2×SSC，0.1％SDS中洗滌至少一次。
9.分離的核酸分子，其包含編碼多肽的核酸，該多肽具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的核酸分子，由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性，該核酸不同于SEQID NO1的核酸。
11.分離的核酸分子，其包含與SEQ ID NO1的核酸有至少65％同一性的核酸。
12.權(quán)利要求12的分離的核酸分子，其中該核酸與SEQ ID NO1的核酸有至少75％的同一性。
13.權(quán)利要求12的分離的核酸分子，其中該核酸與SEQ ID NO1的核酸有至少85％的同一性。
14.權(quán)利要求12的分離的核酸分子，其中該核酸與SEQ ID NO1的核酸有至少95％的同一性。
15.重組多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
16.權(quán)利要求15的重組多肽，其還包含可檢測(cè)的標(biāo)記。
17.權(quán)利要求16的重組多肽，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記包括酶、放射性同位素或發(fā)熒光的化學(xué)物質(zhì)。
18.重組多肽，其包含與SEQ ID NO2的序列有至少65％同一性且保留了SEQ ID NO2的多肽的功能的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求18的重組多肽，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的序列有至少75％的同一性。
20.權(quán)利要求18的重組多肽，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的序列有至少85％的同一性。
21.權(quán)利要求18的重組多肽，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的序列有至少95％的同一性。
22.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求18的重組多肽的核酸序列。
23.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求19的重組多肽的核酸序列。
24.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求20的重組多肽的核酸序列。
25.分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求21的重組多肽的核酸序列。
26.權(quán)利要求15的重組多肽的特異性抗體。
27.權(quán)利要求26的抗體，其中該抗體選自單克隆抗體、多克隆抗體和嵌合抗體。
28.權(quán)利要求26的抗體，其還包含可檢測(cè)的標(biāo)記。
29.權(quán)利要求28的抗體，其中可檢測(cè)的標(biāo)記包含酶、放射性同位素、發(fā)熒光的化學(xué)物質(zhì)或抗體可識(shí)別的抗原肽標(biāo)簽。
30.表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含與表達(dá)控制元件有效連接的權(quán)利要求1的分離的核酸分子。
31.權(quán)利要求30的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)控制元件選自組成性調(diào)節(jié)序列、細(xì)胞特異性調(diào)節(jié)序列和可誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)序列。
32.權(quán)利要求30的表達(dá)載體，其中所述表達(dá)控制元件是啟動(dòng)子，其包含hCMV即時(shí)早期啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、腺病毒早期啟動(dòng)子、牛痘早期啟動(dòng)子、多瘤早期啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、腺病毒晚期啟動(dòng)子、牛痘晚期啟動(dòng)子、多瘤晚期啟動(dòng)子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC系統(tǒng)、TRC系統(tǒng)、λ噬菌體的主要操縱基因和啟動(dòng)子區(qū)、fd外殼蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子、酸性磷酸酶啟動(dòng)子或酵母α交配因子的啟動(dòng)子。
33.用權(quán)利要求30的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
34.權(quán)利要求33的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的宿主細(xì)胞，其中該宿主細(xì)胞包含大腸桿菌、假單胞菌、芽胞桿菌、鏈霉菌、酵母、CHO、R1.1、B-W、L-M、COS1、COS7、BSC1、BSC40、BMT10或Sf9細(xì)胞。
36.表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含與表達(dá)控制元件有效連接的權(quán)利要求6的分離的核酸分子。
37.用權(quán)利要求36的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
38.表達(dá)載體，該表達(dá)載體包含與表達(dá)控制元件有效連接的權(quán)利要求11的分離的核酸分子。
39.用權(quán)利要求38的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
40.分離的核酸分子，其包含與選自以下的核酸互補(bǔ)的反義RNAa)SEQ ID NO1的核酸；b)編碼SEQ ID NO2的氨基酸的核酸。
41.轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物，該動(dòng)物的基因組包含轉(zhuǎn)基因，該轉(zhuǎn)基因包含SEQID NO1的分離的核酸。
42.制備權(quán)利要求15的重組多肽的方法，該方法包括步驟a)在提供所述重組多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求19的宿主細(xì)胞；并且b)回收所述重組多肽。
43.檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，該方法包括步驟a)將該蛋白質(zhì)與根據(jù)權(quán)利要求26的抗體接觸；并且b)評(píng)估該抗體和該蛋白質(zhì)之間的相互作用。
44.鑒定SEQ ID NO2的激動(dòng)劑的方法，該方法包括步驟a)將潛在的激動(dòng)劑與表達(dá)SEQ ID NO2的細(xì)胞接觸；并且b)確定相對(duì)于不存在潛在激動(dòng)劑時(shí)SEQ ID NO2的信號(hào)傳遞活性，存在該潛在激動(dòng)劑時(shí)SEQ ID NO2的信號(hào)傳遞活性是否升高。
45.鑒定SEQ ID NO2的逆向激動(dòng)劑的方法，該方法包括步驟a)將潛在的逆向激動(dòng)劑與表達(dá)SEQ ID NO2的細(xì)胞接觸；并且b)確定存在該潛在的逆向激動(dòng)劑時(shí)SEQ ID NO2的活性相對(duì)于不存在該潛在的逆向激動(dòng)劑時(shí)SEQ ID NO2的活性是否下降，以及存在內(nèi)源配體或激動(dòng)劑時(shí)SEQ ID NO2的活性是否下降。
46.鑒定SEQ ID NO2的拮抗劑的方法，該方法包括步驟a)將潛在的拮抗劑與表達(dá)SEQ ID NO2的細(xì)胞接觸；并且b)確定相對(duì)于存在內(nèi)源配體或激動(dòng)劑時(shí)SEQ ID NO2的信號(hào)傳遞活性，存在潛在拮抗劑時(shí)SEQ ID NO2的信號(hào)傳遞活性是否降低。
全文摘要
本發(fā)明描述了前列腺素類受體家族的一個(gè)新成員，即豚鼠前列腺素D2受體。描述了該受體、該受體的編碼核酸及兩者的多種用途。
文檔編號(hào)C07K14/72GK1898263SQ200480039032
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者A·帕克, P·奧古斯特, T·孔茨韋勒, M·A·阿爾達(dá)提, N·巴什卡蘭 申請(qǐng)人:安萬(wàn)特藥物公司