細(xì)胞表面標(biāo)志分子用于檢測(cè)肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞表面標(biāo)志分子用于檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的用途，具體涉 及磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(glypican-3，GPC3)、去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor, ASGPR) 1/2和/或細(xì)胞角蛋白組合（cytokeratins，CK) 8/18/19在檢測(cè)肝細(xì)胞 肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝癌發(fā)病率和死亡率分別占全球惡性腫瘤第五和第二位，年死亡人數(shù)與新發(fā)病例 數(shù)幾乎相同，約60萬(wàn)。肝癌也是我國(guó)常見(jiàn)惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率分別占我國(guó)惡性腫瘤 第三和第二位，其中肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌的主要類(lèi)型，約 70%死于腫瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。目前肝細(xì)胞肝癌以外科治療為主，如腫瘤切除術(shù)和肝移植術(shù)，主 要問(wèn)題為術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。
[0003] 循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells, CTCs)是從上皮來(lái)源的實(shí)體腫瘤脫落， 進(jìn)入外周血的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)腫瘤細(xì)胞會(huì)隨血流遷移到達(dá)合適的微環(huán)境，種植于遠(yuǎn)處器官， 形成轉(zhuǎn)移灶。
[0004] 檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞有助于發(fā)現(xiàn)早期微轉(zhuǎn)移灶，可以用來(lái)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤病情的發(fā) 展，為評(píng)估患者預(yù)后及監(jiān)測(cè)臨床治療效果提供參考信息。既往研究表明存在于外周血中的 循環(huán)腫瘤細(xì)胞與較高的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)程度相關(guān)，現(xiàn)主要用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌的 臨床檢測(cè)，以輔助預(yù)后評(píng)估。
[0005] 目前從外周血中檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞的技術(shù)依照對(duì)象分為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞核酸和檢 測(cè)腫瘤細(xì)胞自身。腫瘤細(xì)胞核酸檢測(cè)技術(shù)依賴(lài)于針對(duì)腫瘤細(xì)胞特異的DNA序列設(shè)計(jì)的 RT-PCR和qPCR方法，假陽(yáng)性率高，穩(wěn)定性差；基于腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)依賴(lài)于腫瘤細(xì)胞表 面特異表達(dá)的蛋白標(biāo)志，富集腫瘤細(xì)胞后用細(xì)胞病理學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)直觀(guān)地觀(guān)察腫瘤細(xì)胞的形 態(tài)，而成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞鑒定的主流方法之一。CellSearch?系統(tǒng)自2004年以來(lái)被美國(guó)食 品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA)先后批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前 列腺癌、結(jié)腸癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)，該方法也于2012年8月被我國(guó)食品藥品監(jiān) 督管理局（China Food and Drug Administration, CFDA)批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者外周 血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)。CellSearch?系統(tǒng)的基本原理是基于捕獲和富集外周血中帶有上 皮細(xì)胞表面標(biāo)記上皮細(xì)胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)的稀有 的腫瘤細(xì)胞，將細(xì)胞表面帶有EpCAM標(biāo)記（EpCAM+)和細(xì)胞角蛋白（cytokeratins，CK) 8、18 及/或19標(biāo)記（CK+)，排除白細(xì)胞表面標(biāo)記⑶45 (⑶450的有核細(xì)胞(細(xì)胞核染料4, 6-聯(lián) 瞇-2_苯基吲哚，4, 6-diamidino_2-phenylindole，DAPI+)鑒定為乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸 癌的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0006] 然而，該方法不適用于肝細(xì)胞肝癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)，因?yàn)檠芯勘砻鳎孩?僅僅有30%左右的肝癌細(xì)胞表面表達(dá)EpCAM ;②不僅如此，表達(dá)EpCAM的肝細(xì)胞肝癌屬于外 周血中為數(shù)很少的肝癌腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,其生物學(xué)特性和普通外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞有很 大區(qū)別；③腫瘤具有異質(zhì)性（heterogenicity)，即由一個(gè)克隆來(lái)源的腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程 中形成在侵襲能力、生長(zhǎng)速度、對(duì)刺激的反應(yīng)、對(duì)抗癌藥物的敏感性等方面有所不同的亞克 隆的過(guò)程。大約30%的上皮來(lái)源腫瘤細(xì)胞表面不表達(dá)EpCAM，具有異質(zhì)性；④無(wú)論美國(guó)的FDA 和中國(guó)的CFDA都沒(méi)有官方授權(quán)批準(zhǔn)用于檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法。因 此，研究肝細(xì)胞肝癌代表性的細(xì)胞表面標(biāo)志分子用以鑒定循環(huán)中肝細(xì)胞肝癌來(lái)源的有核細(xì) 胞，即肝細(xì)胞肝癌的循環(huán)腫瘤細(xì)胞非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究和反復(fù)摸索，找到了適合檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌的循 環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志分子以及相應(yīng)的檢測(cè)方法，由此完成了本發(fā)明。
[0008] 本發(fā)明第一方面涉及檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子的試劑用于制備檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌 的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)品(例如試劑盒）的用途，所述細(xì)胞表面標(biāo)志分子選自細(xì)胞表面表 達(dá)CK8、CK18、CK19、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3, GPC3)、去唾液酸糖蛋白受體 (asialoglycoprotein receptor，ASGPR) KASGPR2 中的至少一種。
[0009] 本發(fā)明第二方面涉及檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子的試劑用于制備診斷或輔助診斷肝 細(xì)胞肝癌的產(chǎn)品(例如試劑盒）的用途，所述細(xì)胞表面標(biāo)志分子選自CK8、CK18、CK19、GPC3、 ASGPRl、ASGPR2中的至少一種。
[0010] 本發(fā)明第三方面涉及檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子的試劑用于制備對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行 疾病進(jìn)展動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后評(píng)估或肝癌肝移植循環(huán)腫瘤細(xì)胞本底檢測(cè)的產(chǎn)品(例如 試劑盒）的用途，所述細(xì)胞表面標(biāo)志分子選自CK8、CK18、CK19、GPC3、ASGPR1、ASGPR2中的 至少一種。
[0011] 本發(fā)明第四方面涉及產(chǎn)品（例如試劑盒）或組合物，其包含檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子 的試劑，所述細(xì)胞表面標(biāo)志分子選自CK8、CK18、CK19、GPC3、ASGPR1、ASGPR2中的至少一種； 所述產(chǎn)品(例如試劑盒）或組合物用于檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞、診斷或輔助診斷肝細(xì) 胞肝癌、或者對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn)行疾病進(jìn)展動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后評(píng)估或肝癌肝移植循環(huán) 腫瘤細(xì)胞本底的檢測(cè)。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述的細(xì)胞表面標(biāo)志 分子包括（1)〇(8、0(18、0(19中的至少一種，（2)456?1?1和/或456?1?2，以及（3)6?〇3。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述的檢測(cè)細(xì)胞表面 標(biāo)志分子的試劑是指能夠特異性識(shí)別細(xì)胞表面標(biāo)志分子的抗體，例如單克隆抗體或多克隆 抗體，優(yōu)選單克隆抗體。
[0014] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子的抗體是指分別能夠與 CK8/18/19、GPC3、ASGPR1/2特異性結(jié)合的單克隆抗體。
[0015] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)CK8、CK18、CK19的抗體為一種共同抗 體，其能夠分別與CK8、CK18或CK19特異性結(jié)合。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè) ASGPRUASGPR2的抗體為一種共同抗體，其能夠分別與ASGPRl或ASGPR2特異性結(jié)合。
[0016] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述抗GPC3抗體購(gòu)自Santa Cruz公司（USA)，其Cat. 勵(lì).為8(：-11395，其1^^.勵(lì).為83738。
[0017] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述抗ASGPR1/2抗體購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（USA)，其 〇&七勵(lì).為即六011954，其1^〇七勵(lì).為六37306。
[0018] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述抗CK8/18/19抗體購(gòu)自Miltenyi公司（Germany),其 Cat. NO.為 130-080-101，其 Lot. NO.為 5100630005。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述的產(chǎn)品或組合物 中還包括檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45的試劑；優(yōu)選地，所述檢測(cè)CD45的試劑為抗CD45抗體， 更優(yōu)選地，所述抗體為單克隆抗體。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述的抗體還連接有 可檢測(cè)的標(biāo)記或者易于分離的物質(zhì)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述的產(chǎn)品或組合物 中還包括第二抗體，所述第二抗體能夠特異性識(shí)別檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子的抗體；優(yōu)選地， 所述第二抗體還連接有可檢測(cè)的標(biāo)記或者易于分離的物質(zhì)。
[0022] 在本發(fā)明中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記為本領(lǐng)域公知，例如為鏈霉親和素標(biāo)記、熒光標(biāo) 記、酶標(biāo)記或同位素標(biāo)記。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記是指熒光標(biāo)記。
[0023] 在本發(fā)明中，所述易于分離的物質(zhì)為本領(lǐng)域所公知，例如為磁珠。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述的產(chǎn)品或組合物 中還包括用于富集血液中有核細(xì)胞的試劑。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明以上各方面任一項(xiàng)的用途或產(chǎn)品或組合物，其中所述用于富集有核細(xì) 胞的試劑包括紅細(xì)胞裂解液、白細(xì)胞結(jié)合劑、核染色劑中的至少一種。
[0026] 在本發(fā)明中，可以選用本領(lǐng)域公知的紅細(xì)胞裂解方法來(lái)裂解并去除紅細(xì)胞。在 本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述紅細(xì)胞裂解液的成分為：155mmolNH 4CL，10mmolKHC03,0.1 mmol EDTA。
[0027] 在本發(fā)明中，可以選用本領(lǐng)域公知的方法去除血液中的白細(xì)胞。在本發(fā)明的實(shí)施 方案中，所述白細(xì)胞結(jié)合劑為偶聯(lián)CD45抗體的磁珠(例如納米磁珠)，該磁珠能夠與白細(xì)胞 表面的CD45蛋白結(jié)合，因此可進(jìn)一步用磁力分離器分離并去除白細(xì)胞。
[0028] 在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。在本發(fā)明的實(shí)施方案 中，所述核染色劑為DAPI。
[0029] 在本發(fā)明中，所述產(chǎn)品為試劑盒或者檢測(cè)設(shè)備；當(dāng)產(chǎn)品為試劑盒時(shí)，所述試劑盒中 包括檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志分子的試劑，所述細(xì)胞表面標(biāo)志分子選自CK8、CK18、CK19、GPC3、 ASGPRl、ASGPR2中的至少一種，優(yōu)選為包括（1)CK8、CK18、CK19中的至少一種，（2) ASGPRl 和/或ASGPR2,以及（3) GPC3 ;當(dāng)產(chǎn)品為檢測(cè)設(shè)備時(shí)，所述檢測(cè)設(shè)備通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志 分子來(lái)檢測(cè)肝細(xì)胞肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞、診斷或輔助診斷肝細(xì)胞肝癌、或者對(duì)肝細(xì)胞肝癌進(jìn) 行病情動(dòng)態(tài)監(jiān)控、疾病復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)、療效評(píng)價(jià)、預(yù)后評(píng)估或肝癌肝移植循環(huán)腫瘤細(xì)胞本底的檢 測(cè)，所述細(xì)胞表面標(biāo)志分子選自CK8、CK18、CK19、GPC3、ASGPRl、ASGPR2中的至少一種，優(yōu)選 為包括（I) CK8、CK18、CK19 中的至少一種，（2) ASGPRl 和 / 或 ASGPR2,以及（3)GPC3。
[0030] 在本發(fā)明中，用于檢測(cè)的樣本為外周血，例如為外周靜脈血液，特別是全血，或者 為全血中的有核細(xì)胞成分。
[0031] 在本發(fā)明中，用于檢測(cè)的外周血的體積為5-10ml。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述外 周靜脈血的體積為7. 5ml。