一種胃癌的唾液蛋白診斷模型及其建立方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種胃癌的唾液蛋白診斷模型及其建立方法,該胃癌的唾液蛋白診斷模型的建立方法包括以下步驟:唾液標(biāo)本的收集和處理;采用WCX磁珠處理唾液樣品;點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析;數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;該胃癌的唾液蛋白診斷模型主要由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da的4個(gè)唾液蛋白峰組成。本發(fā)明通過由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)由1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da的4個(gè)蛋白峰建立的分類預(yù)測(cè)模型,將檢測(cè)人唾液中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的m/z與模型進(jìn)行分析,可以初步用于胃癌的診斷,識(shí)別率為97.83%,預(yù)測(cè)能力79.82%。本發(fā)明臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果表明該診斷模型的準(zhǔn)確率為97.56%,靈敏度為95.65%,特異性為100%。本發(fā)明的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單,具有合理可行,操作簡(jiǎn)便,可批量處理的特點(diǎn)?!緦@f明】一種胃癌的唾液蛋白診斷模型及其建立方法【
技術(shù)領(lǐng)域:
】[0001]本發(fā)明屬于胃癌診斷【
技術(shù)領(lǐng)域:
】,尤其涉及一種胃癌的唾液蛋白診斷模型及其建立方法?!?br>背景技術(shù):
】[0002]胃癌(gastriccancer,GC)是威脅人類健康最常見的消化道腫瘤之一,盡管近年來發(fā)病率和死亡率有所降低,但其發(fā)病率仍居各種惡性腫瘤的首位,而且近年來發(fā)病有明顯年輕化趨勢(shì)。相當(dāng)多的胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)是晚期。我國每年死于胃癌的病人達(dá)15~20萬,幾乎接近全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的1/4。每年新發(fā)現(xiàn)的胃癌病人約達(dá)20萬。胃癌早期癥狀常常不明顯,多為上腹部不適、隱痛、噯氣、泛酸、食欲減退、輕度貧血等部分類似胃十二指腸潰瘍或慢性胃炎癥狀。早期胃癌70%以上無明顯癥狀,隨著病情的發(fā)展,可逐漸出現(xiàn)非特異性的、類同于胃炎或胃潰瘍的癥狀,包括上腹部飽脹不適或隱痛、泛酸、噯氣、惡心,偶有嘔吐、食欲減退、消化不良、黑便等。[0003]唾液是人體不可缺少的一種重要體液,血液成分如多種激素、氨基酸、電解質(zhì)、免疫球蛋白、肌酐等均可通過毛細(xì)血管壁的唾液血液屏障進(jìn)入唾液。作為人體體液的一部分,其成分含量的變化,受體內(nèi)各種病理生理變化的影響。研究發(fā)現(xiàn)唾液成分與血清相關(guān),特別是研究證實(shí)作為唾液主要成分的蛋白質(zhì)與血清成正相關(guān)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們對(duì)于臨床診斷指標(biāo)的要求不斷提高,不僅要求正確、敏感,而且要求無創(chuàng)、簡(jiǎn)便,唾液不僅取材方便,無創(chuàng)傷性,可隨時(shí)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察,且實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定,方法靈敏度高,重復(fù)性好。隨著生化微量分析技術(shù)的進(jìn)步,使人們開始考慮用唾液代替血液作為診斷指標(biāo)。唾液研究方面走在前列的美國現(xiàn)正致力于開展一項(xiàng)重點(diǎn)研究計(jì)劃--創(chuàng)立唾液診斷學(xué)(salivarydiagnostics),即在研究正常人唾液中的全部蛋白質(zhì)組分的基礎(chǔ)上,創(chuàng)建以唾液為研究對(duì)象、快速實(shí)時(shí)(real-time)反映機(jī)體狀態(tài)的、可檢測(cè)各種系統(tǒng)性疾病和口腔疾病的蛋白質(zhì)研究體系,如蛋白質(zhì)芯片等。基于唾液的檢驗(yàn)診斷技術(shù)將會(huì)對(duì)臨床醫(yī)學(xué)及腫瘤學(xué)、分子生物學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)、病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、流行病學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生物芯片以及生物信息學(xué)等多個(gè)學(xué)科的基礎(chǔ)研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。[0004]隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究范圍的不斷拓展,唾液蛋白質(zhì)組學(xué)(Salivaryproteomics)作為一個(gè)年輕的新興的研究領(lǐng)域,加上蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的全面推廣[0005]和提聞,其自動(dòng)化、聞通量、聞靈敏度和可重復(fù)的特點(diǎn),正在逐漸引起人們的廣泛關(guān)注。唾液蛋白質(zhì)組的分析精度提高,技術(shù)難度降低,從而使得口腔內(nèi)唾液蛋白的研究轉(zhuǎn)移到提高蛋白組的全表達(dá)譜研究和疾病生物標(biāo)記確立,生物靶向治療應(yīng)用研究中去,使其能夠更好的為臨床診斷服務(wù),為人類疾病治療做貢獻(xiàn)。唾液蛋白質(zhì)組學(xué)旨在以“組學(xué)”的研究思路尋找、發(fā)現(xiàn)和鑒定唾液中與疾病過程和治療過程相關(guān)的生物標(biāo)志物(蛋白質(zhì)、多肽),致力進(jìn)行唾液蛋白質(zhì)組比較檢測(cè),全譜檢測(cè)的一門科學(xué).它的發(fā)展直接影響了唾液分析在臨床診斷中的地位和水平。國外唾液蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。長(zhǎng)期以來,由于原有的技術(shù)限制了口腔唾液蛋白的通量分析和精確測(cè)定,使大多數(shù)唾液蛋白的生物功能處于未知狀態(tài),唾液在人體疾病中的診斷和預(yù)后判斷中的潛在作用并未顯現(xiàn)。隨著高通量、高精度的蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用,使得唾液蛋白中生物標(biāo)記用于疾病的早期診斷預(yù)防、生物蛋白靶向治療、預(yù)后監(jiān)測(cè)判斷等均已成為可能。近幾十年來利用唾液作為檢測(cè)人體疾病的手段,用來診斷感染性疾病、免疫性疾病、內(nèi)分泌疾病及腫瘤等眾多疾病方面均已取得不少成果。目前國內(nèi)對(duì)開展唾液蛋白組學(xué)的研究?jī)H限于口腔疾病及糖尿病。[0006]基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD1-T0F-MS)是近年來發(fā)展起來的一種軟電離新型有機(jī)質(zhì)譜,通過引入基質(zhì)分子,使待測(cè)分子不產(chǎn)生碎片,解決了非揮發(fā)性和熱不穩(wěn)定性生物大分子解吸離子化的問題,是分析難揮發(fā)的有機(jī)物質(zhì)的重要手段之一,并于2002年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。從此,MALD1-T0FMS在世界范圍內(nèi)得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展,并廣泛應(yīng)用于生物技術(shù)和制藥企業(yè)的藥物開發(fā)、科研領(lǐng)域的生物分析和化學(xué)檢測(cè)以及安全部門的核輻射、化學(xué)物質(zhì)和生物病原體的監(jiān)測(cè)等。[0007]因此從唾液蛋白來探索胃癌的早期診斷篩查模型是無創(chuàng)傷、無痛苦、簡(jiǎn)便易行、重復(fù)性好的一種診斷模式?!?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種胃癌的唾液蛋白診斷模型及其建立方法,旨在解決胃癌檢測(cè)無創(chuàng)傷,無痛苦的問題。[0009]本發(fā)明實(shí)施例是這樣實(shí)現(xiàn)的,首先選取慢性胃炎組和健康對(duì)照組,收集唾液標(biāo)本,并采用WCX磁珠處理唾液樣品,再采用一種新的技術(shù)平臺(tái)——MALD1-TOF-MS檢測(cè)分析,數(shù)據(jù)分析用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰,用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白,分析有差異趨勢(shì)的多肽,在兩組間找到4個(gè)有統(tǒng)計(jì)差異顯著的蛋白峰,進(jìn)一步利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測(cè)模型。[0010]本發(fā)明實(shí)施例的另一目的在于提供一種胃癌的唾液蛋白診斷模型,該胃癌的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da的4個(gè)唾液蛋白峰組成。[0011]本發(fā)明提供的胃癌的唾液蛋白診斷模型及其建立方法,通過由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)由1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da的4個(gè)蛋白峰建立的分類預(yù)測(cè)模型,將檢測(cè)人唾液中相應(yīng)的蛋白質(zhì)的m/z與模型進(jìn)行分析,可以初步用于胃癌的診斷,識(shí)別率為97.83%,預(yù)測(cè)能力79.82%。本發(fā)明臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果表明該診斷模型的準(zhǔn)確率為97.56%,靈敏度為95.65%,特異性為100%。本發(fā)明的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單,具有合理可行,操作簡(jiǎn)便,可批量處理的特點(diǎn)?!緦@綀D】【附圖說明】[0012]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的胃癌的唾液蛋白診斷模型的建立方法流程圖?!揪唧w實(shí)施方式】[0013]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白,以下結(jié)合實(shí)施例,對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解,此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明,并不用于限定本發(fā)明。[0014]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。[0015]一種胃癌的唾液蛋白診斷模型主要由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da的4個(gè)唾液蛋白峰組成。[0016]如圖1所示,本發(fā)明實(shí)施例的胃癌的唾液蛋白診斷模型的建立方法包括以下步驟:[0017]SlOl:唾液標(biāo)本的收集和處理:每個(gè)唾液樣本采集量大約2ml?5ml,所有收集的樣品放入冰盒后,立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室,4°C冰箱過夜后離心,分裝后于_80°C冰箱保存。實(shí)驗(yàn)時(shí)由-80°C冰箱取出樣本,常溫解凍,避免反復(fù)凍融;[0018]S102:采用WCX磁珠處理唾液樣品,加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存_20°C,24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析;[0019]S103:點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析:將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點(diǎn)靶,室溫下干燥后,再各點(diǎn)基質(zhì)溶液,然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-T0F質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析;[0020]S104:數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰。用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白,分析有差異趨勢(shì)的多肽,并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測(cè)模型。[0021]在步驟S103中,應(yīng)用線性模式,采集相對(duì)分子量范圍IOOODa?lOOOODa,激光能量為20%,累計(jì)400shots,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次,獲得肽質(zhì)量指紋圖(PMF)。[0022]在步驟S104中,建立分類預(yù)測(cè)模型的方法為:[0023]首先使用遺傳算法,設(shè)變異率為0.2,交叉率為0.5,初始染色體個(gè)數(shù)為1000,適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率,最終經(jīng)過10000次進(jìn)化,遍歷k,最終在差異蛋白中,選用了其中的幾個(gè)蛋白峰,建立模型。計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率用隨機(jī)抽樣方法,隨機(jī)選擇80%樣本建立模型,其余的20%作為驗(yàn)證樣本,運(yùn)行十次,驗(yàn)證模型的有效性,平均特異性、靈敏性及平均正確率,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0024]結(jié)合以下具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明:[0025]第一步,唾液收集時(shí)間為6:00AM?8:00ΑΜ,收集前一晚睡前不再進(jìn)食及服用任何藥物,收集前2h開始禁食水。并用清水漱口后靜坐于椅子上,前5min內(nèi)的唾液自然吞下后開始收集,口腔唾液積聚至一定量后,吐入置于經(jīng)過冰浴預(yù)冷的50ml離心管內(nèi),每個(gè)唾液樣本采集量大約2ml?5ml,采集時(shí)間為20min?30min,每個(gè)樣本采集完立即放入冰盒內(nèi);[0026]第二步,標(biāo)本處理[0027]所有收集的樣品放入冰盒后,立即轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室,4°C冰箱過夜后3000r/min離心IOmin,再以10000r/min,5min,4°C離心,取50ul唾液分裝在0.5mlEP管中,于-80°C冰箱保存,實(shí)驗(yàn)時(shí)由_80°C冰箱取出樣本,常溫解凍,所有檢測(cè)唾液均避免反復(fù)凍融;[0028]第三步,磁珠選擇:為選擇最適合的磁珠類型,使用三種不同磁珠(離子交換型WCX(弱陽離子)磁珠、疏水型HIC-8磁珠、銅螯合型IMAC-Cu磁珠)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)分析,經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)唾液樣品用WCX磁珠磁珠富集后的峰較多P值較小,說明WCX找到的峰差異較顯著。所以最終選擇WCX磁珠進(jìn)行實(shí)驗(yàn);[0029]第四步,磁珠處理步驟:[0030]步驟一,4°C冰箱取出磁珠試劑盒,取出WCX磁珠懸浮液一管,手動(dòng)上下?lián)u動(dòng),完全混勻磁珠懸浮液,I分鐘;[0031]步驟二,取出IOul磁珠結(jié)合緩沖液(bindingsolution,BS)加入200ul樣品管中,再加入IOul磁珠至樣品管,用加樣槍上下吸打混勻,避免起泡;[0032]步驟三,向樣品管加5ul已處理唾液,用加樣槍上下吸打混勻至少5次,避免起泡;[0033]步驟四,將樣品管室溫下靜置5分鐘;[0034]步驟五,將樣品管放入磁珠分離器。使磁珠貼壁I分鐘,磁珠與懸浮的液體分離,液體應(yīng)清澈;[0035]步驟六,用加樣槍吸去懸浮的液體,槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠,避免吸走磁珠;[0036]步驟七,再向樣品管中加入IOOul磁珠清洗緩沖液(washingsolution,WS);[0037]步驟八,在磁珠分離器前后相鄰兩孔間反復(fù)移動(dòng)樣品管10次(注意磁珠在管中的運(yùn)動(dòng));[0038]步驟九,使樣品管在磁珠分離器上靜置,磁珠貼壁,磁珠與懸浮的液體分離,液體應(yīng)清澈;[0039]步驟十,用加樣槍吸去懸浮的液體,槍頭應(yīng)避免接觸到磁珠,避免吸走磁珠;[0040]步驟十一,重復(fù)步驟七-步驟十步驟兩次,最后一次加樣槍吸去懸浮的液體時(shí),要保證懸浮液完全被吸走;[0041]步驟十二,從磁珠分離器上取下樣品管,并向樣品管中加入5ul磁珠洗脫緩沖液(elutingsolution,ES),混勻貼壁的磁珠,反復(fù)吸打10次,吹打過程中應(yīng)避免起泡;[0042]步驟十三,樣品管放入磁珠分離器,磁珠貼壁2min,磁珠與懸浮的液體充分分離后,將上清液移入干凈的0.5ml樣品管;[0043]步驟十四,向0.5ml樣品管中加入5ul穩(wěn)定緩沖液(Stablesolution,SS),用加樣槍小心吸打混勻;[0044]步驟十五,加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析或凍存_20°C,24小時(shí)之內(nèi)質(zhì)譜分析;[0045]第五步,點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析[0046]將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取Iul分別點(diǎn)靶,室溫下干燥后,再各點(diǎn)Iul濃度為0.3g/L,[乙醇(色譜級(jí))/丙酮(色譜級(jí))=2/1,新鮮配置]的α—氰基一4一羥基肉桂酸基質(zhì)溶液(溶于50%乙腈,2%三氟乙酸),然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-T0F質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析,應(yīng)用線性模式,采集相對(duì)分子量范圍IOOODa?lOOOODa,激光能量為20%,累計(jì)400shots,質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次,獲得肽質(zhì)量指紋圖PMF;[0047]第六步,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[0048]使用儀器上配置的由Bruker公司開發(fā)的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),系統(tǒng)包括FlexAnalysis3.0和ClinProTooIs2.1兩個(gè)軟件,用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰。用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法(參數(shù)T-Test和非參數(shù)方法WilcoxonTest)尋找差異蛋白,分析有差異趨勢(shì)的多肽,并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN(k-nearestneighboure,k=I,3,5,7)建立分類預(yù)測(cè)模型,首先使用遺傳算法,設(shè)變異率為0.2,交叉率為0.5,初始染色體個(gè)數(shù)為1000,適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率,最終經(jīng)過10000次進(jìn)化,遍歷k,最終在差異蛋白中,選用了其中的幾個(gè)蛋白峰,建立模型,計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率,用隨機(jī)抽樣方法(隨機(jī)選擇80%樣本建立模型,其余的20%作為驗(yàn)證樣本,運(yùn)行十次),驗(yàn)證模型的有效性(平均特異性、靈敏性及平均正確率)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。[0049]結(jié)合以下結(jié)果和分析對(duì)本發(fā)明的使用效果做補(bǔ)充說明:[0050]結(jié)果:[0051]正常對(duì)照組與胃癌組兩組間除算法選擇問題被排除的樣本共41例,對(duì)樣本檢測(cè)質(zhì)譜圖進(jìn)行分析比較,兩個(gè)組共得到蛋白質(zhì)峰為74個(gè),其中通過遺傳算法找到4個(gè)統(tǒng)計(jì)差異顯著的蛋白峰(P<0.05),選擇質(zhì)荷比為1472.78Da、2936.49Da、6556.8IDa和7081.17Da這四個(gè)蛋白質(zhì)峰進(jìn)行建模。分析了差異蛋白峰表達(dá)譜。其中胃癌患者1472.78Da峰處顯著高于正常人。通過對(duì)這4個(gè)峰的鑒別,建立了分類預(yù)測(cè)模型,其識(shí)別率為97.83%,預(yù)測(cè)能力79.82%。臨床回代檢驗(yàn)結(jié)果,對(duì)研究中23例胃癌組的唾液樣品,其中有22例被準(zhǔn)確檢出為胃癌,18例正常對(duì)照組中所有18例全部確定為非胃癌。結(jié)果表明,該模型的準(zhǔn)確率為97.56%(40/41),靈敏度為95.65%(22/23),特異性為100%(18/18)。(表1,表2)[0052]表1胃癌唾液蛋白質(zhì)組診斷模型的臨床符合率【權(quán)利要求】1.一種胃癌的唾液蛋白診斷模型的建立方法,其特征在于,該胃癌的唾液蛋白診斷模型的建立方法包括以下步驟:步驟一,唾液標(biāo)本的收集和處理;步驟二,采用WCX磁珠處理唾液樣品,加入穩(wěn)定緩沖液的洗脫液可以用來直接質(zhì)譜分析;步驟三,點(diǎn)樣及質(zhì)譜分析:將磁珠處理好的多肽樣品溶液各取分別點(diǎn)靶,室溫下干燥后,再各點(diǎn)基質(zhì)溶液,然后將制備好的點(diǎn)樣板置于MALD1-TOF質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析;步驟四,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用FlexAnalysis3.0軟件進(jìn)行標(biāo)峰和校正峰,用軟件ClinProTools2.1中的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方法尋找差異蛋白,分析有差異趨勢(shì)的多肽,并利用軟件中的遺傳算法結(jié)合KNN建立分類預(yù)測(cè)模型;建立分類預(yù)測(cè)模型的方法為:首先使用遺傳算法,設(shè)變異率為0.2,交叉率為0.5,初始染色體個(gè)數(shù)為1000,適應(yīng)度函數(shù)用KNN判定結(jié)果的準(zhǔn)確率,最終經(jīng)過10000次進(jìn)化,遍歷k,最終在差異蛋白中,選用了幾個(gè)蛋白峰,建立模型,計(jì)算模型的特異性、敏感性及平均準(zhǔn)確率用隨機(jī)抽樣方法,隨機(jī)選擇80%樣本建立模型,其余的20%作為驗(yàn)證樣本,運(yùn)行十次,驗(yàn)證模型的有效性,平均特異性、靈敏性及平均正確率。2.一種胃癌的唾液蛋白診斷模型,其特征在于,該胃癌的唾液蛋白診斷模型由人唾液蛋白中質(zhì)荷比(m/z)分別為1472.78Da、2936.49Da、6556.81Da和7081.17Da的4個(gè)唾液蛋白峰組成?!疚臋n編號(hào)】G01N27/64GK104007169SQ201410233882【公開日】2014年8月27日申請(qǐng)日期:2014年5月29日優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日【發(fā)明者】吳正治,孫珂煥,曹美群申請(qǐng)人:深圳市第二人民醫(yī)院