本發(fā)明涉及一類通式Ⅰ所示對(duì)GPR84具有激動(dòng)作用的化合物及其制備方法，以及其在制備治療敗血癥的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：：G蛋白偶聯(lián)受體是一大類膜蛋白受體，有367個(gè)人類基因編碼相關(guān)蛋白，它幾乎參與所有細(xì)胞生理功能的調(diào)節(jié)。目前，有許多已知的GPCRs配體如：氣體、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、趨化因子等。此外，研究發(fā)現(xiàn)許多游離脂肪酸(freefattyacidsFFA)為GPCRs的內(nèi)源性配體，其主要是通過結(jié)合游離脂肪酸受體(FreefattyacidReceptors，F(xiàn)FARs)，激活下游一系列細(xì)胞通路，從而調(diào)節(jié)機(jī)體生理活動(dòng)，研究表明FFAs對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)的形成、免疫反應(yīng)等有重要作用(TomoYonezawa,等FreeFattyAcids-SensingGProtein-CoupledReceptorsinDrugTargetingandTherapeutics.CurrentMedicinalChemistry2013,20(30),3855-3871)。GPR84(G蛋白偶聯(lián)受體84)亦是一類膜蛋白受體，由25-35個(gè)連續(xù)的氨基酸構(gòu)成七個(gè)跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)，是最新發(fā)現(xiàn)的一類視紫紅質(zhì)樣受體。gpr84首先是由Wittenberger用EST(ExpressedSequenceTag)方法克隆得到。人類gpr84位于12號(hào)染色體上，鼠類gpr84位于15號(hào)染色體上，GPR84主要表達(dá)在骨髓、外周血白細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞)中(TimoWittenberger*,H.C.S.a.S.H.,AnExpressedSequenceTag(EST)DataMiningStrategySucceedingintheDiscoveryofNewG-ProteinCoupledReceptors.JOURNALOFMOLECULARBIOLOGY2001,303(3),799-813)在LPS存在的條件下，中鏈脂肪酸可以通過GPR84顯著上調(diào)巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞中IL-12p40亞基，IL12p40在細(xì)胞介導(dǎo)免疫中發(fā)揮了重要作用，它能保護(hù)Th1而抑制Th2(Wang,J等,Medium-chainfattyacidsasligandsfororphanGprotein-coupledreceptorGPR84.TheJournalofbiologicalchemistry2006,281(45),34457-64.)，說明GPR84具有維持Th1和Th2平衡功能，對(duì)于多發(fā)性硬化癥、炎癥性腸病、關(guān)節(jié)炎等自身免疫性及炎癥性疾病有重要意義。此外，肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生與慢性炎癥密切相關(guān)，當(dāng)巨噬細(xì)胞侵潤(rùn)脂肪組織時(shí)可通過分泌細(xì)胞因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，同時(shí)脂肪細(xì)胞中GPR84表達(dá)會(huì)增加，顯示GPR84也參與了脂肪酸代謝和免疫系統(tǒng)間的交叉調(diào)節(jié)(Perseghin,G.；Petersen,K.；Shulman,G.I.,Cellularmechanismofinsulinresistance:potentiallinkswithinflammation.Internationaljournalofobesityandrelatedmetabolicdisorders:journaloftheInternationalAssociationfortheStudyofObesity2003,27Suppl3,S6-11.)。2006年Ling小組發(fā)現(xiàn)GPR84能被中鏈游離脂肪酸(MCFA)激活，不能被長(zhǎng)鏈游離脂肪酸(LCFA)和短鏈游離脂肪酸(SCFA)激活，其中葵酸(C10：0)、蓖麻油酸(C11：0)、月桂酸(C12：0)激動(dòng)活性最好，其活性分別是4μM、8μM、9μM(CHO-GPR84細(xì)胞，cAMP實(shí)驗(yàn))。另外，他們還報(bào)道了一個(gè)相對(duì)較好激動(dòng)活性的化合物二吲哚甲烷(diindolylmethane,DIM)，DIMEC50＝0.5μM([35S]-GTPγS結(jié)合實(shí)驗(yàn))，0.7μM(cAMP實(shí)驗(yàn))。Suzuki等研究發(fā)現(xiàn)2-或3-羥基MCFA(2-OH-C10，3-OH-C10，2-OH-C12，3-OH-C12)也具有GPR84的激活活性，此外篩選發(fā)現(xiàn)6-OAU對(duì)GPR84有較好的活性(EC50＝0.661μM)(Suzuki,M.等Oda,T.,Medium-chainfattyacid-sensingreceptor,GPR84,isaproinflammatoryreceptor.TheJournalofbiologicalchemistry2013,288(15),10684-91)。由于GPR84正常生理表達(dá)量較低，只有在一定刺激下誘導(dǎo)其高表達(dá)，而其表達(dá)量的高低與炎癥反應(yīng)有很大的關(guān)系，是治療炎癥相關(guān)疾病非常好的靶標(biāo)，但目前其具體作用機(jī)制仍然不明，且目前無很好的GPR84激動(dòng)劑，阻礙了GPR84作用機(jī)制的研究，故急需設(shè)計(jì)合成一系列具有較好激動(dòng)活性的化合物。本發(fā)明涉及合成了一系列小分子化合物，對(duì)GPR84有很好的激動(dòng)活性，相對(duì)于目前報(bào)道的對(duì)GPR84激動(dòng)劑活性有了較大幅度的提高，從而為GPR84的作用機(jī)制研究提供較好的工具小分子，以及為抗敗血癥藥物發(fā)現(xiàn)開辟新途徑。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：：本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)與合成一類新型的化合物，其可以作為GPR84的激動(dòng)劑，從而為GPR84的作用機(jī)制研究提供較好的工具小分子，以及為抗敗血癥藥物發(fā)現(xiàn)開辟新途徑。本發(fā)明的另一目的也在于提供上述化合物的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供一種包含上述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本發(fā)明的又一目的是提供上述化合物的用途。本發(fā)明所述一類通式Ⅰ所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，其中R1為R1a、R1b或R1c；R5a、R5b和R5c各自獨(dú)立地為：甲基、異丙基、C2-C9烯基、C2-C4炔基、3-6元環(huán)烷基、氰基、羥基、無取代苯基、C1-C4烷基取代的苯基、C1-C3烷氧基取代的苯基、或氟取代的苯基；優(yōu)選地，R5a、R5b和R5c各自獨(dú)立地為：甲基、異丙基、C2-C9烯基、乙炔基、3-4元環(huán)烷基、氰基、羥基、無取代苯基、C1-C4烷基取代的苯基、甲氧基取代的苯基、或氟取代的苯基；n為0-16的整數(shù)；優(yōu)選0-9的整數(shù)；T、W和Y各自獨(dú)立地為氧、氮或碳；優(yōu)選為氮或碳；R2為羥基、氨基、三氟甲基或C1-C3烷基；優(yōu)選為羥基、氨基、三氟甲基或甲基；R3不存在，或?yàn)闅?、芐基或C1-C6烷基；優(yōu)選地，R3不存在，或?yàn)闅浠蚱S基；R4不存在，或?yàn)闅浠駽1-C3烷基；優(yōu)選地，R4不存在，或?yàn)闅浠蚣谆?；Z為-OH、-NH2、＝O、＝S或C1-C6烷基羰基。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，通式Ⅰ中：R1為R1a，其中R5a為甲基、異丙基、3-4元環(huán)烷基、無取代苯基、氰基、羥基、C1-C4烷基取代苯基、甲氧基取代苯基、或氟取代苯基；R2為羥基；n為0-14；T、W和Y各自獨(dú)立地為氧、氮或碳；R3不存在，或?yàn)闅?、芐基、C1-C3烷基；R4不存在，或?yàn)闅浠駽1-C3烷基；Z為-OH、-NH2、＝O、＝S或C1-C6烷基羰基。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，通式Ⅰ為如下通式IIR1為上述R1a、R1b或R1c；R2為羥基、甲基、氨基或三氟甲基；W和Y為氮；R4為氫或C1-C3烷基；Z為羥基或氨基。在本發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方式中，通式Ⅰ為如下通式III其中：R1為上述R1a、R1b或R1cW為氮或碳。本發(fā)明通式Ⅰ優(yōu)選為如下結(jié)構(gòu)的化合物：本申請(qǐng)所述通式I化合物可通過本領(lǐng)域常規(guī)方法制備，例如，如下所述方法：路線一：其中，R6a為甲基、異丙基、C2-C4炔基、3-6元環(huán)烷基、氰基、羥基、無取代苯基、C1-C3烷基取代的苯基、C1-C3烷氧基取代的苯基、或氟取代的苯基；n為1-16；化合物1溶于EtOH/H2O(2:1)中，加入KOH和KI，再緩慢滴加溴代物2，80℃反應(yīng)6h，反應(yīng)完后柱層析分離即得產(chǎn)物Ⅳa；路線二：其中，R6b為C2-C9烯基、C2-C4炔基、3-6元環(huán)烷基、或C1-C3烷基取代的苯基；n為1-16；將化合物3和TsCl溶于無水DCM中，加入吡啶，25℃反應(yīng)3h，柱層析分離即得化合物4，再同化合物1溶于EtOH/H2O(2:1)中，加熱回流6h，反應(yīng)完后過柱分離即得產(chǎn)物Ⅳb；路線三：其中R7a為甲基、異丙基、C1-C3烷基取代的苯基、甲氧基取代的苯基、或氟取代苯基；n為1-15；將Na溶于乙醇中，加入化合物5和化合物6，80℃反應(yīng)6h，濃縮反應(yīng)液，加入少量水，調(diào)節(jié)pH至酸性，即有白色固體析出，過濾，白色固體即為所要產(chǎn)物；路線四：其中R7b為甲基、乙基、或異丙基；將化合物7溶于DCM中，加入CBr4、PPh3，，25℃反應(yīng)14h，反應(yīng)完后柱層析分離得化合物8；將化合物8溶于THF中，-78℃加入NaH，攪拌5分鐘后，加入丙二酸二乙酯，逐漸升溫至25℃，25℃反應(yīng)6h，柱層析分離即得化合物9；將化合物9與NaCl溶于DMSO中，180℃反應(yīng)3h，反應(yīng)完后柱層析分離即得化合物10；將Na溶于乙醇中，加入化合物和化合物10，80℃反應(yīng)6h，濃縮反應(yīng)液，加入少量水，調(diào)節(jié)pH至酸性，即有白色固體析出，過濾，白色固體即為所要產(chǎn)物Ⅴb；路線五：其中R7c為甲基或異丙基；n為7-12；將化合物11溶于THF中0℃下加入NaH，攪拌10分鐘后加入n-BuLi，攪拌10分鐘，再加入溴代物，0℃下反應(yīng)14h，柱層析分離得化合物12；再將化合物12溶于EtOH/H2O(2:1)中，加入NaOH，25℃反應(yīng)14h，加鹽酸調(diào)pH至4-5，有白色固體析出，過濾，白色固體即 為化合物13；將化合物13溶于THF中，加入羰基二咪唑，25℃反應(yīng)14h，柱層析分離即得化合物14；將化合物14溶于90％H2SO4中，130℃下反應(yīng)1h，柱層析分離得化合物15；將化合物15溶于28％氨水中，100℃下反應(yīng)14h,加鹽酸調(diào)pH至4-5，有白色固體析出，過濾，白色固體即為Ⅵa；路線六：其中n為4-10；將鎂屑加入乙醚中，滴入溴代物，反應(yīng)1h后，加入化合物16，過柱分離得化合物17；將化合物17溶于DCM中，加入PCC，柱層析分離得化合物18；將化合物18溶于DCM中，-78℃下加入BBr3，，逐漸升溫至25℃，25℃反應(yīng)14h，柱層析分離即得Ⅵb；路線七：其中n為5-10；將溴代物溶于甲苯中，加入三苯基膦，120℃反應(yīng)14h得化合物19；將化合物19溶于DMSO/H2O(10:1)中，130℃反應(yīng)3h，柱層析分離得化合物20(為Z和E兩種構(gòu)型混合物)；將化合物20溶于DCM中，-78℃下加入BBr3，，逐漸升溫至25℃，25℃反應(yīng)14h，柱層析分離即得Ⅵc(為Z和E兩種構(gòu)型混合物)；路線八：其中n為5-10；化合物20的制取同路線七，將化合物20(為Z和E兩種構(gòu)型混合物)溶于乙醇中，加入Pd/C，H2氛圍下反應(yīng)16h,柱層析分離得化合物21；將化合物21溶于DCM中，-78℃下加入BBr3，，逐漸升溫至25℃，25℃反應(yīng)14h，柱層析分離即得Ⅵd；路線九：其中R4為氫或C1-C3烷基；n為1-4；將Na溶于乙醇中，加入化合物22和化合物23，80℃反應(yīng)16h，濃縮反應(yīng)液，加入少量水，調(diào)節(jié)PH至酸性，即有白色固體析出，過濾，白色固體即為化合物24；再將化合物24溶于EtOH/H2O中，加入KI、KOH和溴代物，80℃反應(yīng)6h，濃縮，柱層析分離即得Ⅳc；路線十：其中R2為氨基、羥基、或甲基；n為1-4；Z為-OH、-NH2、＝O、＝S或C1-C6烷基羰基；將Na溶于乙醇中，加入化合物26和化合物25，80℃反應(yīng)16h，濃縮反應(yīng)液，加入少量水，調(diào)節(jié)pH至酸性，即有白色固體析出，過濾，白色固體即為Ⅳd；路線十一：n為1-4；R4為氫或甲基；將Na溶于乙醇中，加入化合物27和化合物23，80℃反應(yīng)16h，濃縮反應(yīng)液，加入少量水，調(diào)節(jié)pH至酸性，即有白色固體析出，過濾，白色固體即為化合物26-1；再將化合物26-1溶于EtOH/H2O中，加入KI、KOH和溴代物，80℃反應(yīng)6h，濃縮，柱層析分離即得Ⅳd-1；路線十二：其中R6c為C1-C6烷基、或芐基；X為I或Br；將化合物L(fēng)Y228-6a溶于甲苯中，加入K2CO3，0℃下加入R6cX，110℃回流12h，濃縮柱層析既得Ⅳe；路線十三：n為1-9；將化合物26溶于乙腈中，0℃下加入鹽酸肼、三乙胺，移至室溫?cái)嚢?0min，加入鄰苯二甲酸酐，加熱回流16h，濃縮反應(yīng)液，加入DCM，過濾除去濾渣，濾液用5％氨水洗滌，濃縮有機(jī)相，干燥，即得化合物27；將化合物27溶于THF中，0℃下，緩慢滴入KHMDS，攪拌5分鐘，加入碘甲烷，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，淬滅反應(yīng)，萃取濃縮柱分離得化合物28；將NH4Cl加入無水甲苯中，N2保護(hù)，0℃下緩慢滴加三甲基鋁，待無甲烷氣體冒出后緩慢滴加溶于甲苯的化合物28，80℃攪拌15h，冷卻至室溫，加入少量硅膠，攪拌10分鐘，過濾，濃縮濾液，加入鹽酸甲醇，攪拌12h，濃縮即得粗品29；將Na溶于甲醇中，加入粗品29和化合物22-1，加熱回流12h，濃縮，加入少量水至固體溶解，再調(diào)pH至酸性有白色固體析出，過濾，將濾渣柱分離即得Ⅳf；路線十四：n為1-9；將鎂屑加入乙醚中，滴入溴代物，反應(yīng)1h后，加入化合物30，柱分離得化合物31，再將其溶入NaOCH3/MeOH中，加熱回流16h，得化合物32；將32溶于DCM中，-78℃滴加BBr3，緩慢升至25℃，反應(yīng)12h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，淬滅反應(yīng)，柱分離即得Ⅶ；路線十五：其中R7c為甲基或異丙基；n為6-12；將化合物11溶于THF中0℃下加入NaH，攪拌10分鐘后加入n-BuLi，攪拌10分鐘，再加入溴代物，0℃下反應(yīng)14h，柱層析分離得化合物12；將化合物23加入水中，70℃下攪拌待化合物23全部溶解，加入K2CO3和化合物12，105℃下敞口反應(yīng)，待溶劑完全蒸干，停止加熱，冷卻至室溫，加入水將固體溶解，溶液呈白色乳狀，加鹽酸(1N)調(diào)pH至酸性，有白色粘稠固體析出，倒去上層清液，固體用水(5ml)，洗三次，再經(jīng)柱層析分離即得Ⅷa；將化合物33溶于少量水中，再緩慢滴入溶于THF/H2O(5:2)的Ⅷa，加熱回流6h，再加入鹽酸，回流12h，濃縮柱分離即得Ⅷb。路線十六：其中n為1-4；將化合物34溶于THF中，與二羰基咪唑反應(yīng)生成化合物35；將六甲基硅烷溶于THF中，-78℃滴加正丁基鋰制備六甲基硅鋰再加入二乙基鋅和化合物35、36,反應(yīng)，柱層析分離得到化合物37；再將化合物37溶于乙醇中，加入醋酸銨，25℃反應(yīng)3h后，濃縮加入甲苯回流3h，柱層析分離即得黃色固體VIII。路線十七：將化合物38溶于乙醇中，加入胺，100℃下回流16h,得到化合物39；將Na溶于甲醇中，加入粗品化合物39和丙二酸二乙酯，加熱回流12h，濃縮，加入少量水至固體溶解，再調(diào)pH至酸性有白色固體析出，過濾，將濾渣柱分離即得IX。具體實(shí)施方式：下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不局限于這些實(shí)施例?；衔镏苽鋵?shí)施例下述制備實(shí)施例中，NMR用Varian生產(chǎn)的Mercury-Vx300M儀器測(cè)定，NMR定標(biāo)：δH7.26ppm(CDCl3)，2.50ppm(DMSO-d6)，3.15ppm(CD3OD)；試劑主要由上?；瘜W(xué)試劑公司提供；TLC薄層層析硅膠板由山東煙臺(tái)會(huì)友硅膠開發(fā)有限公司生產(chǎn)，型號(hào)HSGF254；化合物純化使用的正相柱層析硅膠為山東青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)，型號(hào)zcx-11，200-300目。制備實(shí)施例一(化合物編號(hào)LY214-5)化合物1(100mg，0.69mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.3mg，0.069mmol，0.1eq),再緩慢加入2-1(310mg，0.26ml，3.0eq)，80℃反應(yīng)6h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完后，加入稀鹽酸(1M，10ml)再加入EA(15ml)萃取3次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌、干燥、過濾、濃縮柱層析分離(DCM：MeOH＝30:1)得LY214-5(白色固體，12mg，8％)。(DMSO-d6)δ12.1(s，2H)，5.11(s,1H)，3.08(t，J＝6.0Hz，2H)，1.61(m，2H)，1.36(m，2H)，1.28(m，2H)，0.87(t，J＝6.3Hz，3H)用同樣方法合成以下化合物：制備實(shí)施例二(化合物編號(hào)LY224-a)將3-1(0.1ml，1.02mmol，1eq)溶于無水DCM(5ml)，加入吡啶(104mg，1.3mmol，1.3eq)再冷卻至0℃，緩慢滴加加入溶于無水DCM(5ml)TsCl(214mg，1.12mmol，1.1eq)，升至20℃，攪拌12h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完全后，濃縮柱層析分離(DCM：MeOH＝30:1)得4-1(無色油狀液體，145mg，56％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝5.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),4.05(t,J＝7.2Hz,2H),2.50(m,2H),2.45(s,3H),2.08(m,2H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).化合物1(67mg，0.47mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，再緩慢加入4-1(145mg，0.52mmol，1.1eq)，80℃反應(yīng)6h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完后，加入稀鹽酸(1M，10ml)再加入EA(15ml)萃取3次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌、干燥、過濾、濃縮柱層析分離(DCM：MeOH＝30:1)得LY224-a(白色固體，44mg，42％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.36(s,1H), 5.12(s,1H),3.18(t,J＝6.3Hz,2H),2.52-2.55(m,2H),2.21–2.03(m,2H),1.03(t,J＝7.5Hz,3H).制備實(shí)施例三(化合物編號(hào)LY224-b)取Na(250mg)溶于乙醇(8ml)中，加入5(500mg，4.9mmol，1eq)，待固體溶解后，緩慢滴入溶于乙醇(5ml)6-1(1.1g，5.89mmol，1.2eq)，有白色固體析出，加熱回流3h，冷卻、過濾，取濾液，濃縮濾液，加入3mlH2O將固體溶解，緩慢滴入稀鹽酸(2M)至PH為3-5，有白色固體析出，過濾，取濾渣，加入5ml甲醇，攪拌1h，過濾，取濾渣，干燥即為L(zhǎng)Y224-b(白色固體，1.0g，91％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.64(s,2H),5.02(s,1H),2.52(t,J＝7.5Hz,2H),1.62(q,J＝6.6Hz2H),1.25(m,10H),0.84(t,J＝6.6Hz,3H).用同樣方法合成以下化合物：制備實(shí)施例四(化合物編號(hào)LY244)將7-1(0.5ml，3.68mmol，1eq)，溶于無水DCM(20ml)中，加入三苯基膦(1.2g，4.41mmol，1.2eq)、四溴化碳(1.4g，4.41mmol，1.2eq)，20℃攪拌12h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，濃縮反應(yīng)液，柱層析分離(純PE)得8-1(無色油狀液體，310mg，59％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝8.1Hz,2H),7.34(d,J＝8.1Hz,2H),4.05(s,2H),2.50(m,2H),2.45(q,J＝8.1Hz,3H),2.08(m,2H),1.06(t,J＝7.5Hz,3H).將丙二酸二乙酯(91mg，0.63mmol,1eq)溶于THF(10ml)中，冷卻至-78℃，加入NaH(19.7mg，0.82mmol,1.1eq)，攪拌10分鐘，緩慢滴入8-1(100mg，0.69mmol，1.1eq)逐漸升至20℃攪拌12h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加入水(5ml)淬滅反應(yīng)，EA(10ml)萃取三次，再加水(5ml)反萃取兩次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾柱層析分離得9-1(無色油狀液體，52mg，41％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.10(m,4H),4.25–4.10(m,4H),3.67(t,J＝6.9Hz,1H),3.17(d,J＝7.8Hz,2H),2.60(q,J＝13.8Hz,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H),1.20(t,J＝7.2,6H).將9-1(130mg，0.63mmol，1eq)溶于DMSO(2ml)中，加入NaCl(74mg，1.26mmol，2eq)，160℃下加熱3h，加入水(5ml)加EA(5ml)萃取三次,再加水(5ml)反萃三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾柱層析分離得10-1(無色油狀液體，56mg，43％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.12(m,4H),4.14(q,J＝14.4Hz,2H),2.91(t,J＝8.4 Hz,2H),2.59(t,J＝8.4Hz,2H),2.54(q,J＝13.8Hz,2H),1.28((t,J＝7.2Hz,3H),1.22((t,J＝7.2Hz,3H).取Na(250mg)溶于乙醇(8ml)中，加入2(212mg，2.08mmol，1.1eq)，待固體溶解后，緩慢滴入溶于乙醇(5ml)10-1(390mg，1.89mmol，1eq)，有白色固體析出，加熱回流3h，冷卻、過濾，取濾液，濃縮濾液，加入3ml的H2O將固體溶解，緩慢滴入稀鹽酸(2M)至PH為3-5，有白色固體析出，過濾，取濾渣，加入5ml甲醇，攪拌1h，過濾，取濾渣，干燥即為L(zhǎng)Y244(白色固體，147mg，35％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.50(s,2H),7.12(m,4H),5.06(s,1H),2.95–2.88(t,J＝7.5Hz,2H),2.78–2.69(t,J＝8.1Hz,2H),2.60–2.53(q,J＝7.5Hz,2H),1.15(t,J＝7.5Hz,1H).制備實(shí)施例五(化合物編號(hào)LY237、LY238-d)將11(1ml，7.7mmol，1eq)加入無水THF(20ml)中，冷卻到0℃，加入NaH(203mg，8.5mmol，1.1eq)，攪拌5分鐘，再加入正丁基鋰(5.3ml，8.5mmol，1.6M，1.1eq)，攪拌五分鐘，再加入溴代物(1.3ml，7.7mmol，1eq)，0℃下攪拌12h，溶液變?yōu)辄S色乳狀液體，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加入水(10ml)淬滅反應(yīng)，EA(10ml)萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾柱層析分離得12-1(黃色油狀液體，647mg，34％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ4.19(q,J＝15Hz,2H),3.42(s,2H),2.53(t,J＝7.2Hz,2H),1.28(m,14H),0.87(t,J＝6.3Hz,3H).1HNMR(300MHz,DMSO)δ12.53(s,1H),3.43(s,2H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.23(m,14H),0.85(t,J＝6.3Hz,3H).將12-1(647mg，2.67mmol，1eq)溶于EtOH/H2O(10/10ml)，加入NaOH(139mg，3.47mmol，1.3eq)，20℃攪拌12h，加入EA(10ml)洗滌兩次，取水相，加入稀鹽酸(1M)調(diào)PH至3-5，有白色固體析出，過濾，真空干燥既得13-1(白色固體，410mg，72％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ12.53(s,1H),3.43(s,2H),2.39(t,J＝7.2Hz,2H),1.23(m,14H),0.85(t,J＝6.3Hz,3H).將13-1(100mg，0.47mmol，1eq)溶于無水THF(10ml)中，加入羰基二咪唑(106mg，0.65mmol，1.4eq)，20℃攪拌12h，加入H2O(10ml)EA(10ml)萃取三次，合并有機(jī)相濃縮，加入甲醇(3ml)，靜置，有白色針狀晶體析出，過濾，即得14-1(白色針織晶體，28mg，16％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ12.30(s,1H),5.91(s,1H),3.07(t,J＝7.2Hz,2H),2.47t,J＝7.8Hz,2H),1.65(m,4H),1.26(m,24H),0.88(t,J＝6.7,5.7Hz,6H).取14-1(14mg，0.037mmol，1eq)溶于90％的H2SO4(5ml)，130℃攪拌1h，加入EA(5ml)萃取，濃縮層析分離得LY238-d(白色固體，6mg，67％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ5.96(s,1H),5.57(s,1H),5.30(s,1H),2.46(t,J＝7.5Hz,2H),1.62(m,2H),1.26(m,12H),0.87(d,J＝6.3Hz,3H).將LY238-d(26mg，0.1mmol，1eq)溶于30％氨水(5ml)，100℃回流14h，加入稀鹽酸(1M)調(diào)PH至3-4，有白色固體析出，過濾，干燥即為L(zhǎng)Y237(白色固體，20mg，83％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ10.85(s,1H),10.27(s,1H),5.58(s,1H),5.33(s,1H),2.33(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(q,J＝6.6Hz,2H),1.24(m,12H),0.85(t,J＝6.0Hz,3H).用同樣的方法制備下列化合物：制備實(shí)施例六(化合物編號(hào)LY250)取鎂屑(58mg，2.4mmol，2eq)加入無水乙醚(5ml)中，在氮?dú)夥諊戮徛渭愉甯?231mg，1.2mmol，1eq)，50℃回流反應(yīng)45分鐘，再緩慢加入溶于無水乙醚(10ml)的16(200mg，1.2mmol，1eq)，滴加完畢后，50℃回流3h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后，緩慢滴加水(5ml)淬滅反應(yīng)，加入EA(10ml)萃取三次，合并有機(jī)相飽和食鹽水洗滌、干燥、濃縮，柱層析(PE:EA＝10：1)分離得17-1(無色油狀液體，200mg，60％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ6.51(d,J＝2.1Hz,2H),6.37(t,J＝2.4Hz,1H),4.64–4.54(m,1H),3.78(s,6H),1.57(m,2H),1.26(m,12H),0.85(t,J＝6.6Hz,3H).將17-1(220mg，0.79mmol，1eq)溶于無水DCM(10ml)中，加入PCC(507mg，2.36mmol，3eq)和硅膠(880mg)，20℃反應(yīng)14h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后，過濾，濃縮，柱層析(PE:EA＝10：1)分離得18-1(白色固體，161mg，73％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.09(d,J＝2.1Hz,2H),6.63(t,J＝2.1Hz,1H),3.83(s,6H),2.87(t,J＝7.5Hz,2H),1.77–1.62(m,2H),1.30(m,12H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).將18-1(157mg，0.56mmol，1eq)溶于無水DCM(5ml)中，冷卻到-78℃，緩慢滴加三溴化硼(2M0.85ml，1.68mmol，3eq)，緩慢升至20℃，攪拌14h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后緩慢滴加水(5ml)淬滅反應(yīng)，加入EA(10ml)萃取三次，合并有機(jī)相飽和食鹽水洗滌、干燥、濃縮，柱層析(PE:EA＝3：1)分離得LY250(無色油狀液體，100mg，71％)。1HNMR(300MHz,cd3od)δ6.87(d,J＝2.1Hz,2H),6.47(m,1H),2.90(t,J＝7.2Hz,2H),1.66(m,2H),1.32(m,10H),0.89(t,J＝6.9Hz,3H).制備實(shí)施例七(化合物編號(hào)LY234)將溴辛烷(1ml，5mmol，1eq)溶于甲苯(20ml)中，加入三苯基膦(1.6g，6mmol，1.2eq)，120℃回流12h，濃縮反應(yīng)液，加入正己烷(20ml)，有白色粘稠固體析出，傾倒出液體，加入PE/EA(20ml/10ml)洗滌三次，用傾倒法除去液體，真空干燥得19-1粗品直接后投。將19-1(460mg，1.01mmol，1.2eq)溶于DMSO/H2O(5ml/0.5ml)中，加入18(139mg，0.84mmol，1eq)、碳酸鉀(232mg，1.68mmol，2eq)，130℃回流12h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后加入EA(5ml)萃取三次，有機(jī)相用H2O(5ml)反萃取三次，合并有機(jī)相飽和食鹽水洗滌、干燥、濃縮，柱層析(PE:EA＝50:1)分離得20-1(無色油狀液體，230mg，89％)。(E/Z＝1.2)E1HNMR(300MHz,CDCl3)δ6.50(d,J＝2.1Hz,2H),6.34(t,J＝2.4Hz,1H),6.31(d,J＝15.6Hz,1H),6.28(m,1H),3.79(s,3H),2.19(q,J＝13.2Hz,2H),1.44(m,2H),1.28(m,8H),0.88(t,J＝6.6Hz,4H)。Z1HNMR(300MHz,CDCl3)δ6.43(d,J＝2.1Hz,1H),6.23(t,J＝6.4Hz,1H),6.34(d,J＝11.4Hz,1H),5.67(m,1H),3.79(s,3H),2.33(q,J＝14.1Hz,2H),1.44(m,2H),1.44(m,2H),1.28(m,8H),0.88(t,J＝6.6Hz,4H).將20-1(476mg，1.8mmol，1eq)溶于無水DCM(10ml)中，冷卻到-78℃，緩慢滴加三溴化硼(2M2.7ml，5.4mmol，3eq)，緩慢升至20℃，攪拌14h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后緩慢滴加水(10ml)淬滅反應(yīng)，加入EA(15ml)萃取三次，合并有機(jī)相飽和食鹽水洗滌、干燥、濃縮，柱層析(PE:EA＝3：1)分離得LY234(黃色油狀液體，320mg，76％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)Eδ6.48–6.30(m,3H),6.30–6.09(m,2H),2.16(m,2H),1.42(m,10H),0.93(t,J＝7.5Hz,3H)。Zδ6.48–6.30(m,3H),6.35(m,1H),5.63(m,1H),2.29(m,2H),1.42(m,10H),0.93(t,J＝7.5Hz,3H).制備實(shí)施例八(化合物編號(hào)LY236)19-1、20-1的制備同制備實(shí)施例七；將20-1(100mg，0.38mmol)溶于EtOH(10ml)中，加入Pd/C(10mg)，氫氣氛圍下20℃反應(yīng)14h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后，氮?dú)庵脫Q，過濾，濃縮濾液，柱層析(PE:EA＝50:1)分離得21(無色油狀液體，54mg，54％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ6.35(d,J＝2.1Hz,2H), 6.31–6.28(t,J＝2.1Hz,1H),3.78(s,6H),2.54(t,J＝7.5Hz,2H),1.58(m,4H),1.28(m,6H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).將21(264mg，0.19mmol，1eq)溶于無水DCM(5ml)中，冷卻到-78℃，緩慢滴加三溴化硼(2M0.27ml，0.54mmol，3eq)，緩慢升至20℃，攪拌14h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完后緩慢滴加水(5ml)淬滅反應(yīng)，加入EA(10ml)萃取三次，合并有機(jī)相飽和食鹽水洗滌、干燥、濃縮，柱層析(PE:EA＝3:1)分離得LY236(黃色固體，16mg，70％)。1HNMR(300MHz,CDCl3)δ6.24(d,J＝2.1Hz,2H),6.22–6.13(m,1H),4.73(s,2H),2.48(t,J＝7.8Hz,2H),1.56(m,2H),1.26(m,12H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).制備實(shí)施例九(化合物編號(hào)LY290-b)將1.2gNa緩慢溶于17ml甲醇中，待Na反應(yīng)完后，加入溶于甲醇(17ml)的23(3.8g，0.05mol，1eq)，再加入22-2(8.7g，0.05mol，1eq)，有白色固體析出，加熱回流16h，冷卻至50℃，加入鹽酸(1M，25ml)調(diào)PH至酸性，白色固體逐漸溶解，過濾除去不容固體，冷卻至0℃，靜置12h，有晶體析出，過濾，固體用冰水洗滌，干燥即為24-1(2.08g，白色固體，26.3％)?；衔?4-1(100mg，0.60mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.3mg，0.069mmol，0.1eq)，再緩慢加入25-1(381mg，1.80mmol，3.0eq)，80℃反應(yīng)6h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完后加入稀鹽酸(1M，10ml)，再加入EA(15ml)萃取3次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌、干燥、過濾、濃縮柱層析分離(DCM:MeOH＝30:1)得LY290-b(白色固體，17mg，9.8％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.31(s,2H),7.26(m,J＝7.2,2H),7.21–7.11(m,3H),3.13(t,J＝6.6,2H),2.59(m,2H),1.71(s,3H),1.69–1.60(m,4H).制備實(shí)施例十(化合物編號(hào)LY274-a)化合物26-2(100mg，0.70mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.6mg，0.07mmol，0.1eq)，再緩慢加入25-1(445mg，2.1mmol，3.0eq)，80℃反應(yīng)6h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完后加入稀鹽酸(1M，10ml)再加入EA(15ml)萃取3次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌、干燥、過濾、濃縮柱層析分離(DCM：MeOH＝30:1)得LY274-a(白色固體，10mg，5.2％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ7.26(m,2H),7.19(m,3H),6.02(s,4H),5.12(s,1H),3.00(t,J＝6.6Hz,2H),2.59(q,J＝6.6Hz,2H),1.62(m,4H).用同樣的方法得到下面化合物：制備實(shí)施例十一(化合物編號(hào)LY328)將600mgNa緩慢溶于5ml甲醇中，待Na反應(yīng)完后，加入溶于甲醇(5ml)的23(760mg，0.01mol，1eq)，再加入27(2.00g，0.01mol，1eq)，有棕色固體析出，加熱回流16h，冷卻至50℃，加入鹽酸(1M，25ml)調(diào)PH至酸性，白色固體逐漸溶解，過濾除去不溶固體，冷卻至0℃，靜置12h，有晶體析出，過濾，固體用冰水洗滌，干燥即為26-1(1.00g，白色固體，51.0％)化合物26-1(100mg，0.50mmol,1.0eq)溶于EtOH/H2O(10ml/5ml)中，加入KI(11.3mg，0.069mmol，0.1eq),再緩慢加入25-1(318mg，1.50mmol，3.0eq)，80℃反應(yīng)6h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完后加入稀鹽酸(1M，10ml)，再加入EA(15ml)萃取3次，合并有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌、干燥、過濾、濃縮柱層析分離(DCM:MeOH＝30:1)得LY328(白色固體，80mg，67.2％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ13.50(s,1H)，7.32–7.22(m,2H),7.17(m,3H),6.58(s,1H),3.16(t,J＝9.6Hz,2H),2.60(q,J＝6.9Hz,2H),1.67(m,4H)制備實(shí)施例十二(化合物編號(hào)LY242)取LY228-6a(100mg，0.44mmol，1.0eq)溶于甲苯中，加入K2CO3(120mg，0.88mmol，2.0eq)，0℃下緩慢滴入碘甲烷(62.04mg，0.44mmol，1.0eq)，回流3h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，反應(yīng)完后，濃縮反應(yīng)液，柱層析分離(DCM:MeOH＝30:1)得LY242(白色固體，21mg，19.8％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ12.24(s,1H),3.30(s,3H),3.09(t,J＝6.9Hz,2H),1.78–1.54(m,2H),1.44–1.30(m,2H),1.25-1.28(m,4H),1.01–0.71(t,J＝5.4Hz,3H).用同樣的方法制取下列物質(zhì)：制備實(shí)施例十三(化合物編號(hào)LY238-c)將26-1(2ml，10mmol，1eq)溶于乙腈(20ml)中，0℃下加入鹽酸肼(760mg，11mmol，1.1eq)、三乙胺(1.6ml，11mmol，1.1eq)，移至室溫?cái)嚢?0min，加入鄰苯二甲酸酐(1.5g，10.1eq，1.01eq)，加熱回流16h，冷卻至室溫，濃縮反應(yīng)液，再加入DCM(10ml)，攪拌充分溶解，過濾除去濾渣，濾液用5％氨水(10ml)洗滌三次，再用飽和食鹽水(10ml)洗滌有機(jī)相，合并有機(jī)相，濃縮，干燥，即得27-1(黃色油狀液體，1.35g，96％)；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ2.33(t,J＝7.2Hz,2H),1.72–1.59(m,2H),1.45(m,2H),1.29(s,10H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H).將27-1(480mg，3.46mmol，1.0eq)溶于THF(10ml)中，0℃下緩慢滴入KHMDS(10ml，10mmol，3eq)，攪拌5分鐘，加入碘甲烷(0.42ml，3.46mmol，2eq)，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加水(5ml)淬滅反應(yīng)，加入EA(5ml)萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，干燥，濃縮柱層析(PE：EA＝30:1)分離得28-1(黃色油狀液體，150mg，28.4％)；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ1.66–1.55(m,2H),1.39(m,1H),1.31(d,J＝4.5Hz,3H),1.29(s,10H),0.87(t,J＝6.6Hz,3H).將NH4Cl(94.4mg，1.76mmol，1.8eq)加入無水甲苯(10ml)中，N2保護(hù)，0℃下緩慢滴加三甲基鋁(0.9ml，1.67mmol，1.7eq)，移至室溫?cái)嚢?，待無甲烷氣體冒出后緩慢滴加溶于甲苯的28-1(150mg，0.98mmol，1eq)，80℃攪拌15h，冷卻至室溫，加入少量硅膠(300mg)，攪拌10分鐘，過濾，濃縮濾液，加入鹽酸甲醇(2ml，2N)，攪拌12h，濃縮即得粗品29-1(118mg，黃色固體)；將Na(200mg)溶于甲醇(10ml)中，加入29-1(118mg，0.69mmol，1eq)和22-1(70.4mg，0.414mmol，0.6eq)，加熱回流12h，冷卻至室溫，濃縮反應(yīng)液，加入少量水至固體溶解，再加入鹽酸(1N)調(diào)PH至酸性，有白色固體析出，過濾，取濾渣，將濾渣柱層析(DCM:MeOH＝20:1)分離即得LY238-c；(白色固體，41mg，26.8％)；1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.58(s,2H),5.06(s,1H),2.62(m,1H),1.63(m,2H),1.32(m,2H),1.19(m,8H),1.15(d,J＝6.9Hz,3H),0.84(t,J＝6.9Hz,3H).制備實(shí)施例十四(化合物編號(hào)LY225-b)將鎂屑(118mg，4.92mmol，3eq)加入乙醚(10ml)中，加入少量碘(10mg)，滴入溴辛烷(3ml，1.64mmol，1eq)，待引發(fā)后50℃反應(yīng)1h，加入溶于DCM(5ml)的30(300mg，1.64mmol,1eq)，室溫?cái)嚢?h，溶液變成橙色，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加入水(5ml)淬滅反應(yīng)，加入DCM(5ml)，萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，干燥，柱層析(PE:EA＝30:1)分離得31-1；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ2.93–2.81(t,J＝7.8Hz,2H),1.88–1.70(m,2H),1.43–1.15(m,10H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).取Na(600mg)加入甲醇(15ml)中，待Na溶解后加入31-1(300mg，1.15mmol，1eq)，加熱回流16h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待其反應(yīng)完全后，冷卻至室溫濃縮反應(yīng)液，再加入水(5ml)，加入EA(5ml)萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，干燥，柱層析(DCM:MeOH＝50:1)分離得32-1(白色固體，204mg，74.7％)；1HNMR(300MHz,CDCl3)δ4.83(s,6H),2.55(t,J＝7.5Hz,2H),1.81–1.65(m,2H),1.33(m,10H),0.88(t,J＝6.9Hz,3H).將32-1(100mg，0.395mmol，1eq)溶于DCM(5ml)中，-78℃下緩慢滴加BBr3(296mg，1.18mmol，3eq)，緩慢升至25℃,反應(yīng)12h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，加入甲醇(3ml)淬滅反應(yīng)，濃縮反應(yīng)液，柱層析(DCM：MeOH＝20:1)分離即得LY225-b；(白色固體，18mg，20.2％)；1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.19(s,2H),2.38(t,J＝7.5Hz,2H),1.59(m,2H),1.25(m,10H),0.84(t,J＝7.5Hz,3H).制備實(shí)施例十五(化合物編號(hào)LY240、LY224-c)12-2制備同12-1；將23(350mg，1.54mmol，1.5eq)加入水(0.5ml)中，70℃下攪拌待23全部溶解，加入K2CO3(213mg，1.54mmol，1.5eq)、12-2(76mg，1.0mmol，1eq)，105℃敞口反應(yīng)，待溶劑完全蒸干，停止加熱，冷卻至室溫，加入水(5ml)將固體溶解，溶液呈白色乳狀，加鹽酸(1N)調(diào)PH至酸性，有白色粘稠固體析出，倒去上層清液，固體用水(5ml)，洗三次，再經(jīng)柱層析(PE:EA＝10:1)分離即得LY240(白色固體，56mg，23.3％)；1HNMR(300MHz,DMSO)δ12.30(s,1H),12.19(s,1H),5.67(s,1H),2.33(t,J＝8.1Hz,2H),1.51(m,2H),1.26(m,10H),0.86(t,J＝6.3Hz,3H).將33(31mg，0.42mmol，2eq)溶于水(1ml)中，緩慢滴加溶于THF/H2O(5/2ml)的LY240(50mg，0.21mmol，1eq)，70℃下反應(yīng)6h，再滴入濃鹽酸(0.1ml)，70℃下反應(yīng)16h，冷卻至室溫，加入EA(5ml)萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，干燥，濃縮柱層析(DCM:MeOH＝20:1)分離即得LY224-c(白色固體，5mg，10.6％)；1HNMR(300MHz,DMSO)δ10.87(s,1H),10.77(s,1H),5.31(s,1H),2.26(t,J＝7.5Hz,2H),1.51(m,2H),1.25(m,10H),0.86(t,J＝6.6Hz,3H).制備實(shí)施例十六(化合物編號(hào)LY243)將34-1(1g，5.6mmol，1eq)溶于THF(15ml)中，冷卻至0℃，緩慢滴加溶于THF(5ml)的二羰基咪唑(998mg，6.16mmol，1.1eq)0℃反應(yīng)2h，再移至25℃反應(yīng)1h，加入水(5ml),EA(10ml)萃取三次，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，過濾濃縮得粗品35-1，直接用于下一步；取六甲基硅烷(742mg，4.61mmol，1.4eq)，-78℃下加入n-BuLi(2.9ml，4.61mmol，1.4eq)，-78℃下攪拌20min，再加入36(467mg，3.29mmol，1.0eq)，-78℃下繼續(xù)攪拌1h，再加入二乙基鋅(4.6ml，4.61mmol，1.4eq),攪拌20min后，升溫至-20℃，加入溶于THF(5ml)的35-1(900mg，3.95mmol)，升溫至-10℃，攪拌3h，加入飽和NH4Cl(10ml)淬滅反應(yīng)，再加入EA(10ml)萃取3次，合并有機(jī)相，干燥，過濾，濃縮，柱層析分離即得37-1(白色固體，321mg，27％)；取37-1(100mg，0.33mmol，1.0eq)，溶于乙醇(10ml)中，加入醋酸銨(76mg，0.99mmol，3.0eq)，25℃反應(yīng)3h，濃縮反應(yīng)液，再加入甲苯(5ml)120℃下分水回流3h，濃縮反應(yīng)液，柱層析分離(DCM:MeOH＝20:1)即得LY243(黃色固體，38mg，48.7％)。1HNMR(300MHz,DMSO)δ11.67(s,2H),7.60(d,J＝8.1Hz,2H),7.18(d,J＝8.1Hz,2H),6.54(s,1H),5.21(s,1H),2.5(t,J＝7.5Hz,2H),1.46-1.38(m,2H),1.32–1.00(m,2H),0.75(t,J＝7.5Hz,3H).制備實(shí)施例十七(化合物編號(hào)LY239)取38(500mg，1.8mmol，1.0eq)溶于乙醇(10ml)中，加入正辛胺(387mg，3mmol，1.6eq)，100℃反應(yīng)16h，濃縮反應(yīng)液加入水(5ml)乙醇(5ml)置于冰浴下，有白色固體析出，過濾，得粗品39-1(白色固體，321mg)；取Na(200mg)加入甲醇(20ml)中，待Na溶解后加入39-1(700mg，4.1mmol，1eq)，加熱回流16h，TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，待其反應(yīng)完全后，冷卻至室溫濃縮反應(yīng)液，再加入水(5ml)，加入1M鹽酸調(diào)PH至3-4，加入EA(5ml)萃取三次，合并有機(jī)相，用飽和食鹽水洗滌，干燥，柱層析(DCM:MeOH＝50:1)分離得LY239(白色固體，132mg，13.5％)；1HNMR(300MHz,DMSO)δ10.29(s,2H),6.48(s,1H),4.58(s,1H),3.20(dd,J＝12.9,6.9Hz,2H),1.46(m,2H),1.26(m,10H),0.85(t,J＝6.9Hz,3H).生物實(shí)驗(yàn)實(shí)施例Fluo-4熒光染料示蹤法檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康模哼M(jìn)行本發(fā)明化合物的GPR84激動(dòng)活性測(cè)試。2.材料來源人源GPR84細(xì)胞系，通過在HEK293細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染編碼GPR84和G16蛋白的質(zhì)粒得到。熒光染料Fluo-4AM購(gòu)自Invitrogen公司。3.測(cè)試原理：細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子是一種非常重要的G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路第二信使，當(dāng)與Gα16蛋白偶聯(lián)的GPR84和配體結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+離子濃度能夠顯著增加。Fluo-4是一種Ca2+離子特異性熒光探針，能夠和Ca2+離子定量結(jié)合并發(fā)出熒光。因此采用熒光檢測(cè)法，在96孔或 384孔平底微孔板中檢測(cè)化合物的激動(dòng)活性。GPR84細(xì)胞經(jīng)熒光染料Fluo-4孵育后，加入不同濃度的化合物進(jìn)行刺激，同時(shí)用波長(zhǎng)為485nm的光源激發(fā)并于525nm波段檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化引起的染料熒光強(qiáng)度的改變，計(jì)算得到化合物的半數(shù)有效濃度(EC50)。4.實(shí)驗(yàn)過程：1.配制HBSS：0.4g/LKCl(5.4mM)，0.12g/LNa2HPO4·12H2O(0.3mM)，0.06g/LKH2PO4(0.4mM)，0.35g/LNaHCO3(4.2mM)，0.14g/LCaCl2(1.3mM)，0.10g/LMgCl2·6H2O(0.5mM)，0.05g/LMgSO4(0.6mM)，8.0g/LNaCl(137mM)，稱取上述各成分并用超純水融解，用鹽酸或NaOH溶液調(diào)節(jié)PH至7.4，過濾，4℃保存一個(gè)月。2.配制Ca緩沖液：首先配制560mMD-葡萄糖(100X)水溶儲(chǔ)存液，250mM1,2-二苯基-4-(2-苯亞硫酰)乙基-3,5-吡唑烷二酮(1000X)儲(chǔ)存液。然后在100mlHBSS中加BSA(0.5g)，560mM的D-葡萄糖儲(chǔ)存液(1ml)和250mM1,2-二苯基-4-(2-苯亞硫酰)乙基-3,5-吡唑烷二酮儲(chǔ)存液(100μl)，使終濃度分別為0.5％BSA，5.6mMD-葡萄糖，250μM1,2-二苯基-4-(2-苯亞硫酰)乙基-3,5-吡唑烷二酮，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。3.配制染料：首先配制3％的CremophorEL(100X)PBS溶解的儲(chǔ)存液和2mMFluo-4(1000X)DMSO溶解的儲(chǔ)存液，然后每毫升染料的配制為先將1μl的2mMFluo-4AM和10μl的3％的CremophorEL混勻，再用1ml鈣緩沖液稀釋并混勻。4.以4萬(wàn)個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)以上使細(xì)胞密度至80-90％用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。5.吸去待檢測(cè)細(xì)胞孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入新鮮配制的染料40μl/well，置于37度培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫孵育40min至50min。6.在細(xì)胞孵育過程中配制化合物(此步驟也可以提前準(zhǔn)備)：用實(shí)驗(yàn)前新鮮配制鈣緩沖液將作為激動(dòng)劑使用的化合物稀釋至最終工作濃度的3倍(如果是DMSO溶解的化合物應(yīng)保證最終工作時(shí)DMSO濃度不超過1％)7.在孵育步驟完成后將染料吸盡棄去，用鈣緩沖液洗一遍后換50μl的鈣緩沖液再孵育5至10min。8.用FlexStationIII微孔板檢測(cè)儀加入25μl/孔含不同濃度化合物的鈣緩沖液進(jìn)行刺激，同時(shí)用波長(zhǎng)為485nm的光源激發(fā)并于525nm波段檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化引起的染料熒光強(qiáng)度的改變。以GPR84受體為例，激動(dòng)劑6-OAU配樣情況：6-OAU起始濃度6-OAU配樣板濃度6-OAU最終工作濃度10mM(含100％DMSO)30μM(含3％DMSO)100μM(含1％DMSO)1mM(含100％DMSO)30μM(含3％DMSO)10μM(含1％DMSO)100μM(含100％DMSO)3μM(含3％DMSO)1μM(含1％DMSO)10μM(含100％DMSO)300nM(含3％DMSO)100nM(含1％DMSO)1μM(含100％DMSO)30nM(含3％DMSO)10nM(含1％DMSO)100nM(含100％DMSO)3nM(含3％DMSO)1nM(含1％DMSO)10nM(含100％DMSO)0.3nM(含3％DMSO)0.1nM(含1％DMSO)100％DMSO3％DMSO1％DMSO5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：本申請(qǐng)得到了一系列對(duì)GPR84具有優(yōu)異的激動(dòng)活性的化合物，特別是化合物L(fēng)Y237，其活性較目前報(bào)道激動(dòng)活性最好化合物6-OAU高4500倍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3