一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片及其應用的制作方法
【專利摘要】一種唾液中糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片及其應用，其中糖芯片至少包括NA2F、LNDFI、Lewis-Ytetrasaccharide、LNDFII、Gal、4β-Gal及Lac糖探針的組合，用該糖芯片制備檢測唾液中糖結合蛋白的變化的試劑盒，以及利用該糖芯片檢測唾液中糖結合蛋白的變化的應用。本發(fā)明利用糖探針的組合能非損傷，快速鑒別唾液中糖結合蛋白的變化，為非損傷性鑒別肝炎、肝硬化與肝癌提供新方法。
【專利說明】一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒別疾病的糖芯片，具體涉及一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片。
【背景技術】
[0002]國際癌癥研究機構的最新資料表明，肝癌是全球最常見的五種惡性腫瘤之一，2008年全球肝癌患者74.9萬，死于肝癌的患者69.5萬，其中中國肝癌患者40.2萬，死于肝癌的患者37.2萬(http://globocan.1arc.fr/)。據(jù)中國衛(wèi)生部《2012中國衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒》顯示，2011年惡性腫瘤高居我國主要疾病死亡率的首位，而其中肝癌位居惡性腫瘤死亡率的第二位(http://www.moh.gov.cn)。肝癌死亡率高的原因之一是當前肝癌的確診通常是在晚期，因而錯過了最佳的治療時期，而且臨床診斷后患者平均生存時間不到12個月。甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein, AFP)是目前肝癌診斷的特異性指標,但AFP測定存在假陽性和假陰性的問題。約20%的晚期肝癌患者，直至病故前，AFP測定仍為陰性。病理組織學檢查仍是目前診斷的金標準，但鑒于組織學檢查固有的缺陷如損傷性檢查、不能動態(tài)檢測、存在取樣差異等。因此尋求非損傷性檢查，進行肝癌早期診斷，是防控肝癌的關鍵。
[0003]隨著社會的進步，科學技術的發(fā)展，人們對醫(yī)學檢查的要求也越來越高，要求無倉1J、簡便、快速的疾病檢查診斷方法。與血清標本相比，唾液采集安全方便、無創(chuàng)傷和無血源性疾病傳播的危險。而且近年來，唾液作為臨床樣本已被廣泛應用于多種疾病諸如艾滋病、自身免疫性疾病、酒精性肝硬變、囊性纖維病、糖尿病、心血管病、齲病等的藥物水平監(jiān)測、病情監(jiān)控和療效評價當中。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)生時，蛋白質和脂分子糖基化的異常導致糖鏈發(fā)生了結構和數(shù)量的改變，相應地和這些糖鏈相互作用的糖結合蛋白(glycan- bindingprotein, GBP)的表達也發(fā)生異常改變。從變化的唾液糖結合蛋白中可以找到與疾病相關的生物標志物，而基于唾液檢測的新技術和新方法也會逐漸成為今后非侵襲性臨床診斷發(fā)展的一個方向。隨著分子生物學及細胞生物學的發(fā)展，糖結合蛋白被更多的研究者所關注，糖結合蛋白通過和糖蛋白糖鏈或糖脂糖鏈的相互作用調控細胞識別、信號傳遞、細胞內吞以及細胞生長、分化和凋亡等生物學行為。在肝細胞GBP的研究方面已發(fā)現(xiàn)了一些GBP，其中有代表性的是位于肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體或肝的Gal/GalNAc受體,通過該受體蛋白與糖鏈的相互識別和特異性結合，而使去唾液酸糖蛋白運入細胞內。
[0004]我國90% 以上的肝癌為肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC), 75%?80% 的HCC發(fā)病與肝臟慢性病毒性感染有關。目前研究表明:在肝病的炎癥、硬化、癌變的過程中患者肝組織和血清中發(fā)生了糖蛋白糖鏈結構和功能的改變，同時也伴隨著相關糖結合蛋白數(shù)量和種類的改變。糖鏈因其結構復雜和功能多樣，包含了巨大的信息量，當與之相關的糖結合蛋白發(fā)生改變時，翻譯后的修飾過程即會出現(xiàn)糖鏈修飾紊亂等情況，就會產生嚴重的后果。如在病理狀態(tài)下，由于糖代謝酶類活力的改變或缺陷，可使糖蛋白上的糖鏈表達水平發(fā)生異常，導致細胞功能失常，甚至出現(xiàn)惡性發(fā)展。
[0005]生物芯片現(xiàn)已成為快速、高效、高通量取得相關信息的重要手段。隨著糖生物學及糖組學研究的進展，糖芯片正發(fā)展成為糖生物學及糖組學新興的檢測工具。糖芯片檢測樣品用量少、高通量、靈敏度極高，并且可以與多種檢測手段整合使用，可以快速、準確檢測出待測樣本中糖結合蛋白數(shù)量及種類的差異，因而可大大提生物芯片結果檢測、分析的速度和效率，是一種新型的快速、高效的鑒別病癥的手段。
[0006]糖芯片是通過固定于芯片上的糖探針與樣品中糖結合蛋白特異性結合研究糖結合蛋白與糖鏈相互作用的最有效的高通量分析工具，其潛在的應用范圍非常廣泛，例如篩選糖結合蛋白、抗體特異性分析、細菌和病毒的粘附以及酶的特性分析等方面，也能幫助研究者發(fā)展新的診斷方法和監(jiān)測疾病狀態(tài)以及發(fā)展治療疾病的藥物。而凝集素芯片是通過固定于芯片上的凝集素探針與樣品中糖蛋白糖鏈特異性結合，可以高通量地檢測出樣品中糖蛋白糖鏈結構和連接方式的變化，是研究糖蛋白糖鏈結構變化最有效的分析工具之一，其有助于發(fā)展新的診斷和監(jiān)測疾病的方法。兩者相比，除檢測的對象不同外，糖芯片具有比凝集素芯片檢測靈敏度高的特性；而凝集素芯片的制備較糖芯片簡單，成本較低。
【發(fā)明內容】
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片及其應用，其能非損傷，快速鑒別唾液中糖結合蛋白的變化，為非損傷性鑒別肝炎、肝硬化與肝癌提供新方法。
[0008]本發(fā)明的技術解決方案是:
一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片，包括測試糖探針組，其特殊之處在于:所述測試糖探針組至少包括 NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF I1、Gal、
4β -Gal及Lac糖探針的組合。
[0009]一種上述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
[0010]上述測試糖探針組還包括Man、Man_9 Glycan、NeuAc、Lewis_b tetrasaccharide、2' -Fucosyl-D-lac>3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N_Acetyl-D-lactosamine、Xyl及GlcNAc糖探針的組合
一種上述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
[0011]上述測試糖探針組還包括Lewis-b tetrasaccharide、NeuAc、4 β -Gal、NA2F、LNDFI及GalNAc糖探針的組合。
[0012]一種利用上述糖芯片制備檢測唾液中糖結合蛋白的變化的試劑盒。
[0013]一種上述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
[0014]一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片，包括測試糖探針組和對照探針，其特征在于:所述測試糖探針組包括1、II及III組，所述1、II及III組分別是NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF I1、Gal>4 β -Gal 及 Lac 糖探針的組 合，Man、Man-9 Glycan、NeuAc> Lewis-b tetrasaccharide>2 ' -Fucosyl-D-lac、3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N_Acetyl-D-lactosamine、Xyl 及 GlcNAc 糖探針的組合，以及:Lewis_b tetrasaccharide、NeuAc、4 β -Gal、NA2F、LNDF I 及 GalNAc 糖探針的組合。
[0015]一種利用上述糖芯片制備檢測唾液中糖結合蛋白的變化的試劑盒。
[0016]一種上述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。[0017]本發(fā)明的有益效果是:能非損傷，高通量，快速鑒別唾液中糖結合蛋白的變化，為非損傷性鑒別肝炎、肝硬化與肝癌提供新方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為糖芯片上糖探針布局圖；
圖2為健康人(H)，乙肝(HB)，肝 硬化(HC)和肝癌(HCC)患者唾液糖結合蛋白熒光檢測結果。
【具體實施方式】
[0019]1、實驗部分
1.1試劑與材料
甘氨酸，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，吐溫-20和蛋白酶抑制劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。牛血清白蛋白(BSA)購自德國Merck公司。Cy3突光均購自美國Amerhsma公司。其他化學試劑均為分析純級別，在使用前沒有經過進一步純化。所有實驗用水都為經Mill1-Q50純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)處理的超純水。S^)hadex G-25柱脫鹽購自美國GE Healthcare公司。芯片雜交盒購自美國Bio-Rad伯樂公司。其它常見玻璃器皿均為國產。41種糖(具體名稱見表1)分別購自Sigma-Aldrich公司、德國Merck公司。
[0020]表1糖探針名稱及結構
【權利要求】
1.一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片，包括測試糖探針組，其特征在于:所述測試糖探針組至少包括 NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF I1、Gal、4 β -Gal及Lac糖探針的組合。
2.根據(jù)權利要求1所述基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片，其特征在于:所述測試糖探針組還包括 Man、Man-9 Glycan、NeuAc> Lewis-b tetrasaccharide、2' -Fucosyl-D-1ac>3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N-Acetyl-D_lactosamine、Xyl及GlcNAc糖探針的組合。
3.根據(jù)權利要求1所述基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片，其特征在于:所述測試糖探針組還包括:Lewis_b tetrasaccharide、NeuAc>4 β -Gal> NA2F、LNDF I 及GalNAc糖探針的組合。
4.一種基于唾液糖結合蛋白鑒別肝系列病的糖芯片，包括測試糖探針組和對照探針，其特征在于:所述測試糖探針組包括1、II及III組，所述1、II及III組分別是NA2F、LNDF 1、Lewis-Y tetrasaccharide、LNDF II> Gal>4 β -Gal 及 Lac 糖探針的組合，Man、Man-9 Glycan、NeuAc> Lewis-b tetrasaccharide>2 ' -Fucosyl-D-lac、3 a -Fucosyl-N-acetylglucosamine、Lac、N_Acetyl-D-lactosamine、Xyl 及 GlcNAc 糖探針的組合，以及:Lewis_b tetrasaccharide、NeuAc、4 β -Gal、NA2F、LNDF I 及 GalNAc 糖探針的組合。
5.一種權利要求1所述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
6.一種權利要求2所述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
7.—種權利要求3所述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
8.—種權利要求4所述糖芯片的應用，其特征在于:用于檢測唾液中糖結合蛋白的變化。
9.一種利用權利要求2所述糖芯片制備檢測唾液中糖結合蛋白的變化的試劑盒。
10.一種利用權利要求4所述糖芯片制備檢測唾液中糖結合蛋白的變化的試劑盒。
【文檔編號】G01N33/68GK103901212SQ201410122367
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權日:2014年3月28日
【發(fā)明者】李錚, 吳昊翔, 鐘耀剛, 于漢杰, 陳琳 申請人:西北大學