專(zhuān)利名稱(chēng)：人g－蛋白偶聯(lián)受體的制作方法
描述本發(fā)明涉及新的已鑒定的多核苷酸、由它們編碼的多肽以及此類(lèi)多核苷酸和多肽的用途，并涉及它們的產(chǎn)生。更明確地，本發(fā)明的多核苷酸和多肽涉及G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，此后稱(chēng)之為IGS1。本發(fā)明也涉及對(duì)此類(lèi)多核苷酸和多肽之作用的抑制或活化，涉及含有該多核苷酸的載體、含有該載體的宿主細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中IGS1基因過(guò)度表達(dá)、錯(cuò)表達(dá)、表達(dá)不足和/或被抑制(敲除動(dòng)物)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及篩選化合物的方法，其中所述化合物能作為該G-蛋白偶聯(lián)受體IGS1的激動(dòng)劑或拮抗劑。
背景技術(shù)：
已充分確定許多醫(yī)學(xué)上重要的生物進(jìn)程由參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白質(zhì)介導(dǎo)，其中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及G-蛋白和/或第二信使；例如cAMP(Lefkowitz，自然(Nature)，1991，351353-354)。此處這些蛋白質(zhì)指的是參與G-蛋白途徑的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的一些實(shí)例包括GPC受體(例如腎上腺素能因子和多巴胺的那些受體(Kobilka，B.K.等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1987，8446-50；Kobilka，B.K.等人，科學(xué)(Science)，1987，238650-656；Bunzow，J.R.等人，自然，1988，336783-787))、G-蛋白自身、效應(yīng)蛋白質(zhì)(例如磷脂酶C、腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶)以及調(diào)節(jié)(actuator)蛋白質(zhì)(例如蛋白激酶A和蛋白激酶C(Simon，M.I.等人，科學(xué)，1991，252802-8))。
例如，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種形式中，激素與GPCR結(jié)合后，該受體與異三聚體的G-蛋白相互作用，誘導(dǎo)GDP從鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合位點(diǎn)位離。在正常的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸細(xì)胞濃度下，GTP立即填充此位點(diǎn)。GTP與G-蛋白的α亞基結(jié)合導(dǎo)致G-蛋白從受體解離，并且G-蛋白分解為α和βγ亞基。攜帶有GTP的形式然后結(jié)合至活化的腺苷酸環(huán)化酶。GTP水解為GDP，該過(guò)程由G-蛋白自身催化(α亞基具有內(nèi)在的GTPase活性)，使G-蛋白回到其基礎(chǔ)的非活化形式。α亞基的GTPase活性實(shí)質(zhì)上是控制打開(kāi)/關(guān)掉開(kāi)關(guān)的內(nèi)部時(shí)鐘。α亞基的GDP結(jié)合形式對(duì)βγ具高親和性，接下來(lái)αGDP與βγ重新結(jié)合，使該系統(tǒng)回到基礎(chǔ)狀態(tài)。這樣，G-蛋白起到雙重作用，即作為中間體將信號(hào)從受體傳遞至效應(yīng)器(在這個(gè)實(shí)例中是腺苷酸環(huán)化酶)，以及作為控制信號(hào)持續(xù)時(shí)間的時(shí)鐘。
G-蛋白偶聯(lián)受體的膜結(jié)合超家族已表征為具有七個(gè)推定的跨膜結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是代表跨膜α-螺旋，其由胞外或胞質(zhì)環(huán)連接。G-蛋白偶聯(lián)受體包括大范圍上的生物學(xué)活性受體，例如激素、病毒、生長(zhǎng)因子和神經(jīng)受體。
G-蛋白偶聯(lián)受體家族包括多巴胺受體，其結(jié)合用于治療CNS紊亂的神經(jīng)安定藥物。該家族成員的其它實(shí)例包括(但不限于)降鈣素、腎上腺素能、神經(jīng)肽Y、somastotatin、神經(jīng)緊張素、神經(jīng)激肽、辣椒素、VIP、CGRP、CRF、CCK、緩激肽、galanin、促胃動(dòng)素、傷害感受素(nociceptin)、內(nèi)皮素、cAMP、腺嘌呤核苷、毒蠅堿、乙酰膽堿、5-羥色胺、組胺、凝血酶、激肽、促卵泡激素、視蛋白、內(nèi)皮分化基因-1、視紫紅質(zhì)、添味劑以及巨細(xì)胞病毒受體。
大部分G-蛋白偶聯(lián)受體的頭兩個(gè)胞外環(huán)中各具有單一保守的半胱氨酸殘基，其可形成二硫鍵，該二硫鍵認(rèn)為可穩(wěn)定功能的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。將這7個(gè)跨膜區(qū)指定為T(mén)M1、TM2、TM3、TM4、TM5、TM6和TM7。連接TM5和TM6的胞質(zhì)環(huán)可能是G-蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的一個(gè)主要組成部分。
大部分G-蛋白偶聯(lián)受體包含潛在的磷酸化作用位點(diǎn)，其位于第三個(gè)胞質(zhì)環(huán)內(nèi)和/或羧基末端。對(duì)一些G-蛋白偶聯(lián)受體(如β-腎上腺素受體)而言，蛋白激酶A和/或特異的受體激酶的磷酸化作用可介導(dǎo)受體的脫敏。
近來(lái)發(fā)現(xiàn)某些GPCR(像降鈣素受體樣受體)可與小的單次跨膜蛋白質(zhì)相互作用，后者被稱(chēng)為受體活性修飾蛋白質(zhì)(RAMP’s)。GPCR與某種RAMP的相互作用決定了哪個(gè)天然配體對(duì)GPCR-RAMP的組合具有適當(dāng)?shù)挠H和性，并且可調(diào)節(jié)該復(fù)合體的功能信號(hào)傳遞活性(McLathie，L.M.等人，自然(1988)393333-339)。
對(duì)一些受體，人們認(rèn)為G-蛋白偶聯(lián)受體的配體結(jié)合位點(diǎn)包含親水口袋，其由數(shù)種G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜結(jié)構(gòu)域形成，該口袋被G-蛋白偶聯(lián)受體的疏水殘基包圍。每個(gè)G-蛋白偶聯(lián)受體的跨膜螺旋之親水位點(diǎn)推定面朝里，并形成極性的配體結(jié)合位點(diǎn)。一些G-蛋白偶聯(lián)受體牽涉到TM3，因?yàn)槠渚哂信潴w結(jié)合位點(diǎn)，如TM3天冬氨酸殘基。TM5的絲氨酸、TM6的天冬酰胺以及TM6或TM7的苯丙氨酸或酪氨酸也參與配體的結(jié)合。
G-蛋白偶聯(lián)受體可通過(guò)異三聚體的G-蛋白與多種胞內(nèi)酶、離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行胞內(nèi)偶聯(lián)(見(jiàn)Johnson等人，內(nèi)分泌評(píng)論(Endoc.Rev.)，1989，10317-331)。不同的G-蛋白α-亞基優(yōu)勢(shì)性刺激特定的效應(yīng)器，以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種生物功能。已確定G-蛋白偶聯(lián)受體胞質(zhì)殘基的磷酸化作用是調(diào)節(jié)一些G-蛋白偶聯(lián)受體與G-蛋白偶聯(lián)的重要機(jī)制。已在哺乳動(dòng)物宿主的許多地方發(fā)現(xiàn)了G-蛋白偶聯(lián)受體。
受體—主要是GPCR類(lèi)—已導(dǎo)致了一多半目前公知的藥物(Drews，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，1996，141516)。這表明這些受體作為治療靶位已有確定的、經(jīng)證實(shí)的歷史。本發(fā)明描述的新IGS1 GPCR無(wú)疑滿(mǎn)足了本領(lǐng)域?qū)﹁b定和表征進(jìn)一步的受體之需求，其中所述進(jìn)一步的受體為可在診斷、防止、改善或糾正機(jī)能障礙、紊亂或疾病(此后通稱(chēng)為“疾病”)中發(fā)揮作用之受體。疾病包括(但不限于)精神病學(xué)的和CNS紊亂，包括精神分裂癥、陣發(fā)性焦慮(EPA)紊亂例如強(qiáng)迫觀念與行為疾病(OCD)、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(PTSD)、恐怖癥和極度焦慮、大部分的抑郁障礙、雙極情感障礙、帕金森氏疾病、一般的焦慮障礙、孤獨(dú)癬、譫語(yǔ)、多發(fā)性硬化癥、阿爾茨海默疾病/癡呆以及其它神經(jīng)變性疾病、嚴(yán)重的智力低下、運(yùn)動(dòng)障礙、亨廷頓舞蹈病、圖雷特氏綜合征、抽搐、震顫、張力障礙、痙攣、厭食癥、貪食癥、腦卒中、成癮/依賴(lài)/渴望、睡眠障礙、癲癇、偏頭痛、注意缺陷障礙(伴多動(dòng))(ADHD)；心血管疾病，包括心力衰竭、心絞痛、心律失常、心肌梗塞、心臟肥大、低血壓、高血壓—例如原發(fā)性高血壓、腎高血壓或肺高血壓、血栓形成、動(dòng)脈硬化、腦血管痙攣、蛛網(wǎng)膜下出血、腦缺血、腦梗塞、外周血管病、雷諾氏病、腎臟疾病—例如腎功能衰竭；dyslipidemias；肥胖癥；嘔吐；胃腸道紊亂，包括腸道易激綜合征(IBS)、炎性腸病(IBD)、胃食管回流疾病(GERD)、能動(dòng)性障礙、延遲的胃排空情況，如手術(shù)后或糖尿病性胃輕癱和糖尿病，潰瘍—例如胃潰瘍；腹瀉；其它疾病，包括骨質(zhì)疏松癥；炎癥；感染，如細(xì)菌、真菌、原生動(dòng)物以及病毒感染，尤其是HIV-1或HIV-2引起的感染；疼痛；腫瘤；化學(xué)治療誘發(fā)的損傷；腫瘤侵襲；免疫紊亂；尿潴留；哮喘；變態(tài)反應(yīng)；關(guān)節(jié)炎；良性前列腺肥大；內(nèi)毒素休克；敗血癥；糖尿病并發(fā)癥以及婦科疾病。
特別地，本發(fā)明描述的新IGS1 GPCR無(wú)疑滿(mǎn)足了本領(lǐng)域?qū)﹁b定和表征進(jìn)一步的受體之需求，其中所述進(jìn)一步的受體為可在診斷、防止、改善或糾正精神病學(xué)的和CNS機(jī)能障礙、紊亂或疾病中發(fā)揮作用之受體，特別是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
發(fā)明概述本發(fā)明一方面涉及IGS1多肽和重組物以及產(chǎn)生它們的方法。本發(fā)明另一方面涉及利用該IGS1多肽和多核苷酸的方法。此類(lèi)用途包括(但不限于)對(duì)上述疾病之一的治療。特別地，該用途包括對(duì)精神病學(xué)的和CNS障礙的治療，尤其是運(yùn)動(dòng)失調(diào)，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
再者，本發(fā)明的另一方面涉及使用本發(fā)明提供的物質(zhì)鑒定激動(dòng)劑和拮抗劑的方法，以及用已鑒定的化合物治療與IGS1相關(guān)的失調(diào)情況。還有本發(fā)明的另一方面涉及檢測(cè)疾病的診斷方法，其中疾病與不適當(dāng)?shù)腎GS1活性或水平有關(guān)。本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及基于動(dòng)物的系統(tǒng)，其作為IGS1表達(dá)異?；蚧钚圆划?dāng)而引起的紊亂模型。
附圖簡(jiǎn)述

圖1.不同克隆相對(duì)位置的圖式表示，分離的這些不同的克隆用于產(chǎn)生共有序列的IGS1毗連序列群。用于克隆的PCR引物表示為(IP#)。通過(guò)對(duì)克隆HNT1398和HNT1413的重疊PCR可獲得克隆HB4693。IGS1編碼序列(IGS1 PROT)的位置用星號(hào)表示(“*”)。EST20889和EST登記號(hào)AI672141的定位用“＝”表示，IGS1 DNA序列的定位用“++”表示。IGS1 DNA是IGS1毗連序列群的一部分，其中在每一個(gè)核苷酸位置上，至少對(duì)4個(gè)獨(dú)立的cDNA克隆進(jìn)行了序列測(cè)定。
圖2.用人IGS1探針進(jìn)行的多組織表達(dá)陣列分析。膜上有許多假信號(hào)。只有箭頭所指的信號(hào)與所保藏的RNA位置相同并且是特異的。
圖3.用來(lái)自不同腦區(qū)的RNA進(jìn)行人IGS1的Northern印跡分析。
表1SEQ ID NO1的IGS1-DNA
表2SEQ ID NO2的IGS1-蛋白質(zhì)
發(fā)明詳述本發(fā)明的IGS1 GPCR與其它的人類(lèi)GPCR之間在序列和基序上存在結(jié)構(gòu)相似性。此外，IGS1在腦組織中表達(dá)，特別是在尾狀核和豆?fàn)詈酥斜磉_(dá)。因此暗示了IGS1在尤其是上面提及的疾病中起作用。暗示了IGS1尤其在精神病學(xué)的和CNS障礙中作用，特別是運(yùn)動(dòng)失調(diào)，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
除非另外加以定義，此處所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中一般技術(shù)人員通常了解的意思相同。雖然類(lèi)似或等同于此處所描述的任一方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)中，現(xiàn)在仍對(duì)優(yōu)選的方法、設(shè)備和材料進(jìn)行了描述。說(shuō)明書(shū)中的所有出版物此處引用作為參考，盡管此處引用的每一個(gè)單獨(dú)的出版物均專(zhuān)門(mén)地、單獨(dú)地指出。定義提供以下定義，以利于對(duì)此處常用的某些術(shù)語(yǔ)的了解。
“IGS1”特別是指包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽，或其等位基因變體。
“受體活性”或“受體的生物活性”指該IGS1的代謝功能或生理功能，包含類(lèi)似的活性或提高的活性或具有降低的、不希望的副作用的這些活性。也包括該IGS1的抗原活性和免疫原性活性。
“IGS1-基因”指包含SEQ ID NO1所示核苷酸序列的多核苷酸，或其等位基因變體，和/或它們的互補(bǔ)物。
此處所用的“抗體”包括多克隆和單克隆抗體、嵌合的、單鏈和人源化抗體，以及Fab片段，包括Fab或其它免疫球蛋白表達(dá)文庫(kù)的產(chǎn)物。
“分離的”指“通過(guò)人工”從天然狀態(tài)改變和/或從天然環(huán)境分離。這樣，如果存在于自然界的“分離的”組合物或物質(zhì)被“分離”，那么它已被改變或已被從其最初的環(huán)境移走，或兩者都有。例如，天然存在于活的動(dòng)物內(nèi)的多核苷酸或多肽不是“分離”的，但從其天然狀態(tài)的共存物質(zhì)中分離的同一多核苷酸或多肽是“分離的”，正如此處所用的該術(shù)語(yǔ)。
“多核苷酸”通常指任一多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可為未經(jīng)修飾的RNA或DNA或經(jīng)修飾的RNA或DNA?！岸嗪塑账帷卑?但不限于)單鏈和雙鏈DNA、單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合的DNA、單鏈和雙鏈RNA，以及單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)混合的RNA、包含DNA和RNA的雜交分子，其可為單鏈或更一般地，可為雙鏈或單鏈區(qū)和雙鏈區(qū)的雜合體。另外，“多核苷酸”也可包括三鏈區(qū)，其包含RNA或DNA或同時(shí)包含RNA和DNA。術(shù)語(yǔ)多核苷酸也包括含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的DNA或RNA，以及因?yàn)榉€(wěn)定性或因?yàn)槠渌蚨鴮?duì)主鏈進(jìn)行修飾了的DNA或RNA。“修飾”堿基包括例如，三苯甲基化堿基和不尋常堿基(如次黃苷)。對(duì)DNA和RNA可進(jìn)行多種修飾；這樣，“多核苷酸”包含多核苷酸經(jīng)化學(xué)修飾、酶修飾或代謝修飾后的形式，它們一般可在自然界中發(fā)現(xiàn)，以及病毒和細(xì)胞的DNA和RNA特征性的化學(xué)形式?！岸嗪塑账帷币舶ㄏ鄬?duì)短的多核苷酸，通常稱(chēng)為寡核苷酸。
“多肽”指任一肽或蛋白質(zhì)，其包含通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵而互相連接起來(lái)的兩個(gè)或多個(gè)氨基酸(即肽等配物)?！岸嚯摹敝付替溡约拜^長(zhǎng)的鏈，其中前者通常稱(chēng)為肽、寡肽或寡聚體，后者通常稱(chēng)為蛋白質(zhì)和/或其組合物。多肽可包含除了20種基因編碼氨基酸之外的其它氨基酸。“多肽”包含經(jīng)修飾的氨基酸序列，所述修飾或被天然方法修飾(如翻譯后加工)，或被本領(lǐng)域公知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾。此類(lèi)修飾在基礎(chǔ)課本和較詳細(xì)的專(zhuān)著中，以及在大量的研究文獻(xiàn)中有充分的描述。修飾可發(fā)生在多肽的任一位置，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈以及氨基或羧基末端。應(yīng)意識(shí)到在特定多肽的一些位點(diǎn)，同一類(lèi)型的修飾可以同樣或不同程度出現(xiàn)。同樣，特定多肽也可含有許多類(lèi)型的修飾。多肽可因遍在蛋白化作用而分支，并且它們可為帶或不帶分支的環(huán)狀。環(huán)狀的、分支的以及分支環(huán)狀的多肽可來(lái)自翻譯后天然加工或可通過(guò)合成法產(chǎn)生。修飾包括乙?；饔?、酰化作用、ADP-核糖基化作用、酰胺化作用、黃素的共價(jià)連接、血紅素部分的共價(jià)連接、核苷酸或核苷酸衍生物的共價(jià)連接、脂類(lèi)或脂類(lèi)衍生物的共價(jià)連接、磷脂酰肌醇的共價(jià)連接；交聯(lián)、環(huán)化作用、二硫鍵形成、去甲基化作用、共價(jià)交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；ⅵ?羧化作用、糖基化作用、GPI錨的形成、羥基化作用、碘化作用、甲基化作用、肉豆蔻?；饔谩⒀趸饔?、蛋白水解加工、磷酸化作用、異戊二烯化作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸化作用、轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的向蛋白質(zhì)添加氨基酸(如精氨?；饔煤捅樵诘鞍谆饔?。見(jiàn)例如，蛋白質(zhì)-結(jié)構(gòu)和分子特性，第二版(PROTEIN-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.)T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，紐約，1993以及，蛋白質(zhì)的翻譯后共價(jià)修飾(POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS)，B.C.Johnson，Ed.，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1983一書(shū)中的Wold，F(xiàn).，翻譯后的蛋白質(zhì)修飾展望和前景(Posttranslational Protein ModificationsPerspectives and Prospects)，1-12頁(yè)；Seifter等人，“蛋白質(zhì)修飾和非蛋白質(zhì)輔因子的分析”(“Analysisfor protein modifications and nonprotein cofactors”)，酶學(xué)方法(Meth.Enzymol.)(1990)182626-646和Rattan等人，“蛋白質(zhì)合成翻譯后修飾和老化”(“Protein SynthesisPosttranslational Modificationsand aging”)，紐約科學(xué)會(huì)紀(jì)事(Ann.NY Acad.Sci.)(1992)66348-62。
此處所用的術(shù)語(yǔ)“變體”是指多核苷酸或多肽，其分別不同于參考的多核苷酸或多肽，但保留了基本的特性，如基本的生物特性、結(jié)構(gòu)特性、調(diào)節(jié)特性或生化特性。多核苷酸的一般變體之核苷酸序列不同于另一個(gè)，參考核苷酸。變體核苷酸序列的變化可改變或不改變多肽的氨基酸序列，其中所述的多肽由參考多核苷酸編碼。核苷酸的變化可導(dǎo)致參考序列所編碼的多肽中氨基酸的替換、添加、刪除、融合和截短，對(duì)此將在下面討論。多肽的一般變體之氨基酸序列不同于另一個(gè)，參考多肽。通常，差異是有限的，以使參考多肽之序列與變體總體上非常相似，并且在許多區(qū)域是相同的。變體和參考多肽氨基酸序列上的差異可以是一個(gè)或多個(gè)氨基酸以任一組合的替換、添加和刪除。替換或插入的氨基酸殘基可由遺傳密碼編碼，也可不由遺傳密碼編碼。多核苷酸或多肽的變體可以自然產(chǎn)生(如等位基因變體)，或者它可以是非自然產(chǎn)生的變體。多核苷酸和多肽之非自然產(chǎn)生的變體可通過(guò)誘變技術(shù)或直接合成而產(chǎn)生。
“同一性”是對(duì)核苷酸序列或氨基酸序列之同一性的量度。通常將序列排列起來(lái)，以獲得最大限度的匹配。“同一性”本身具有本領(lǐng)域認(rèn)知的意義并且可用公開(kāi)的技術(shù)計(jì)算。見(jiàn)例如(計(jì)算分子生物學(xué)(COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY)，Lesk，A.M.，ed.，牛津大學(xué)出版社，紐約，1988；生物計(jì)算機(jī)學(xué)資訊學(xué)和基因組計(jì)劃(BIOCOMPUTINGINFORMATICS AND GENOME PROJECTS)，Smith，D.W.，ed.，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993；序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析，第一部分(COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA，PARTI)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，新澤西，1994；分子生物學(xué)中的序列分析(SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULARBIOLOGY)，von Heinje，G.，學(xué)術(shù)出版社，1987；以及序列分析導(dǎo)引(SEQUENCE ANALYSIS PRIMER)，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，MStockton Press，紐約，1991)。雖然存在許多可用于測(cè)量?jī)蓚€(gè)多核苷酸或多肽間同一性的方法，該術(shù)語(yǔ)“同一性”為技術(shù)人員周知(Carillo，H.，和Lipton，D.，工業(yè)與應(yīng)用數(shù)學(xué)會(huì)應(yīng)用數(shù)學(xué)雜志(SIAM J.Applied Math.)(1988)481073)。測(cè)定兩個(gè)序列間的同一性或相似性的常用方法包括(但不限于)公開(kāi)于超大計(jì)算機(jī)指南(Guide to Huge Computers)，MartinJ.Bishop，ed.，學(xué)術(shù)出版社，圣地亞哥，1994和Carillo，H.，和Lipton，D.，工業(yè)與應(yīng)用數(shù)學(xué)會(huì)應(yīng)用數(shù)學(xué)雜志(1988)481073中的方法。測(cè)定同一性或相似性的方法已按規(guī)則編在計(jì)算機(jī)程序中。優(yōu)選的、用于測(cè)定兩個(gè)序列間的同一性或相似性的計(jì)算機(jī)程序方法包括(但不限于)GCG程序包(Devereux，J.，等人，核酸研究(Nucleic Acids Research)(1984)12(1)387)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul，S.F.等人，分子生物學(xué)雜志(J.Molec.Biol.)(1990)215403)。單詞“同源性”可替代單詞“同一性”。
通過(guò)一種多核苷酸進(jìn)行說(shuō)明，其所具有的核苷酸序列例如與SEQ IDNO1的參考核苷酸序列至少具95％的“同一性”是指在SEQ ID NO1的參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸中，該多核苷酸的核苷酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)核苷酸的不同外，該多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換句話(huà)說(shuō)，為了獲得核苷酸序列與參考核苷酸序列至少95％相同的多核苷酸，參考序列中多達(dá)5％的核苷酸可被刪除或被另一核苷酸替代；或可將一些核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄校渲胁迦氲暮塑账峥啥噙_(dá)參考序列之總核苷酸的5％；或在一些核苷酸中，存在刪除、插入和替換的組合，其中所述核苷酸多達(dá)參考序列之總核苷酸的5％。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考核苷酸序列的5或3末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的核苷酸中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。
類(lèi)似地，一種多肽，其所具有的氨基酸序列例如與SEQ ID NO2的參考氨基酸序列至少具95％的“同一性”是指在SEQ ID NO2的參考氨基酸序列之每100個(gè)氨基酸中，該多肽之氨基酸序列除了含有多達(dá)5個(gè)氨基酸的變化外，該多肽之氨基酸序列與參考序列相同。換句話(huà)說(shuō)，為了獲得氨基酸序列與參考氨基酸序列至少95％相同的多肽，參考序列中多達(dá)5％的氨基酸殘基可被刪除或被另一氨基酸替代；或可將一些氨基酸插入?yún)⒖夹蛄兄?，其中插入的氨基酸多達(dá)參考序列之總氨基酸殘基的5％。參考序列的這些突變可發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或在這些末端位置之間的任意地方，它們或單獨(dú)散在于參考序列的殘基中，或以一個(gè)或多個(gè)鄰近的組存在于參考序列中。本發(fā)明的多肽本發(fā)明一方面涉及IGS1多肽(包括IGS1蛋白質(zhì))。IGS1多肽包括SEQ ID NO2的多肽和具有由DNA插入片段編碼的氨基酸序列之多肽，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，于1999年7月15日保藏在荷蘭的真菌菌種保藏中心；還包括包含SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽和包含具有由DNA插入片段編碼的氨基酸序列之多肽，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心；以及包含與SEQ ID NO2和/或具有由DNA插入片段編碼的氨基酸序列之多肽至少80％同一性的氨基酸序列的多肽，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心，并且較優(yōu)選地至少90％、更優(yōu)選地至少95％的同一性。進(jìn)一步地，那些至少97％、特別是至少99％的同一性的多肽是高度優(yōu)選的。IGS1多肽中也包括具有與包含SEQ ID NO2之氨基酸序列的多肽或與具有由DNA插入片段編碼的氨基酸序列之多肽至少80％同一性的氨基酸的多肽，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心，并且較優(yōu)選地至少與SEQ ID NO2 90％同一性、更優(yōu)選地至少95％。進(jìn)一步地，那些至少97％、特別是至少99％同一性的多肽是高度優(yōu)選的。優(yōu)選地，IGS1多肽顯示該受體的至少一種生物活性。
IGS1多肽可為“成熟”蛋白質(zhì)形式或?yàn)檩^大蛋白質(zhì)(如融合蛋白質(zhì))的一部分。含有額外的氨基酸序列通常是有利的，其中所述之額外的氨基酸序列包括分泌或前導(dǎo)序列、前序列、利于純化的序列(如多個(gè)組氨酸殘基)或在重組體產(chǎn)生過(guò)程中起穩(wěn)定作用的額外序列。
IGS1多肽片段也包括在本發(fā)明中。片段是具有氨基酸序列的多肽，其具有與上述IGS1多肽之氨基酸序列的一部分(非全部)相同的氨基酸序列。與IGS1多肽一樣，片段可以“獨(dú)立存在”或包含在較大的多肽中，片段在其中形成一部分或一個(gè)區(qū)域，最優(yōu)選地是作為單一的連續(xù)區(qū)域。本發(fā)明之多肽片段的代表性實(shí)例包括例如，氨基酸數(shù)從約1-20、21-40、41-60、61-80、81-100以及101至IGS1多肽末端的片段。文中“約”包括在特指范圍的任一末端或兩端多出或少了數(shù)個(gè)、5個(gè)、4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或1個(gè)氨基酸。
優(yōu)選的片段包括例如，具有IGS1多肽之氨基酸序列的截短多肽，其中不包括對(duì)包括氨基末端的連續(xù)殘基序列的刪除，或?qū)Π然┒说倪B續(xù)殘基序列的刪除，或?qū)蓚€(gè)連續(xù)殘基序列的刪除，其中一個(gè)包含氨基末端，一個(gè)包含羧基末端。通過(guò)結(jié)構(gòu)或功能屬性表征的片段也是優(yōu)選的，例如含有α-螺旋和α-螺旋形成區(qū)、β-片層和β-片層形成區(qū)、轉(zhuǎn)角和轉(zhuǎn)角形成區(qū)、卷曲和卷曲形成區(qū)、親水區(qū)、疏水區(qū)、α兩親區(qū)、β兩親區(qū)、可變形區(qū)、表面形成區(qū)、底物結(jié)合區(qū)和高抗原系數(shù)區(qū)的片段。其它優(yōu)選的片段為生物活性片段。生物活性片段是那些介導(dǎo)受體活性的片段，包括那些具相似活性或具升高的活性，或具降低的、不希望的活性之片段。也包括那些對(duì)動(dòng)物，尤其對(duì)人是抗原或免疫原的片段。
這樣，本發(fā)明的多肽包括具有氨基酸序列與SEQ ID NO2之氨基酸序列至少80％同一性的多肽和/或具有由DNA插入片段編碼的氨基酸序列之多肽，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心，或其片段，其中所述片段與對(duì)應(yīng)片段有至少80％同一性。優(yōu)選地，所有這些多肽片段保留了受體的生物活性，包括抗原活性。所定義的序列和片段的變體也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。優(yōu)選的變體是那些通過(guò)保守氨基酸替換而不同于參考序列的變體—即用另一個(gè)類(lèi)似特征的殘基替換的變體。一般此類(lèi)替換為Ala、Val、Leu和Ile之間；Ser和Thr之間；酸性殘基Asp和Glu之間；Asn和Gln之間；以及堿性殘基Lys和Arg之間；或芳香族殘基Phe或Tyr之間。特別優(yōu)選的變體是其中有數(shù)個(gè)、5-10個(gè)、1-5個(gè)或1-2個(gè)氨基酸被以任一組合替換、刪除或添加。
本發(fā)明的IGS1多肽可以任一合適的方式制備。此類(lèi)多肽包括分離的天然存在多肽、重組產(chǎn)生的多肽、合成產(chǎn)生的多肽或通過(guò)這些方法的結(jié)合產(chǎn)生的多肽。制備此類(lèi)多肽的方法為本領(lǐng)域公知。本發(fā)明的多核苷酸本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及IGS1多核苷酸。IGS1多核苷酸包括編碼IGS1多肽和片段的分離的多核苷酸，以及與其密切相關(guān)的多核苷酸。更明確地，本發(fā)明的IGS1多核苷酸包括這樣的多核苷酸，其包含的核苷酸序列包含于SEQ ID NO1中，例如可編碼SEQ ID NO2的IGS1多肽之多核苷酸，具有SEQ ID NO1特定序列的多核苷酸，以及基本上對(duì)應(yīng)于DNA插入片段的多核苷酸，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心。
IGS1多核苷酸還包括如下多核苷酸包含其全長(zhǎng)至少與SEQ ID NO2的編碼IGS1之多核苷酸序列80％同一性的核苷酸序列之多核苷酸，包含其全長(zhǎng)序列與SEQ ID NO1至少80％同一性的核苷酸序列之多核苷酸，以及基本上相應(yīng)于包含在保藏于荷蘭真菌菌種保藏中心的保藏物(CBS 102049)中的DNA插入片段的多核苷酸。
在這點(diǎn)上，具至少90％同一性的多核苷酸是特別優(yōu)選的，并且那些具至少95％同一性的多核苷酸是尤其優(yōu)選的。而且，具至少97％同一性的多核苷酸是高度優(yōu)選的，并且那些具至少98-99％同一性的多核苷酸是最高度優(yōu)選的，具至少99％同一性的多核苷酸是最優(yōu)選的。也包括在IGS1多核苷酸條目下的核苷酸序列是這樣的，其中所述核苷酸序列為可在一定條件下可與SEQ ID NO1或DNA插入片段中所含有的核苷酸序列具足夠的同一性可與之雜交的一段核苷酸序列，其中DNA插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心，所述條件可用于擴(kuò)增或用作探針或標(biāo)記。本發(fā)明也提供與此類(lèi)IGS1多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
本發(fā)明的IGS1與G-蛋白偶聯(lián)受體家族的其它蛋白質(zhì)具有結(jié)構(gòu)相關(guān)性，這一點(diǎn)可通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST研究結(jié)果顯示。表2的氨基酸序列(SEQ ID NO2)的主要部分(氨基酸殘基7-222和396-470)與兔α-1c腎上腺素能受體(登記號(hào)#O02824，Miyamoto S等人，RL life Sci.(1997)602069-2074)具有約30％的同一性(應(yīng)用BLAST，AltschulS.F.等人，，核酸研究253389-3402)，并且31-220的氨基酸殘基與人G-蛋白偶聯(lián)受體RE2(GenBank登記號(hào)#AF091890)具有約33％的同一性。表1的核苷酸序列(SEQ ID NO1)與人α-1a/d腎上腺素能受體中的266個(gè)核苷酸殘基(登記號(hào)#L31722，Bruno J.F.等人，生物化學(xué)與生物物理學(xué)研究快訊(Biochem.Biophys.Res.Commun.)(1991)1791485-1490)57％相同，與人G-蛋白偶聯(lián)受體RE2的前1426個(gè)核苷酸殘基(GenBank登記號(hào)#AF091890)44％相同。進(jìn)一步地，IGS1蛋白質(zhì)序列的親水性分析(Hofmann，K.，Stoffel，W.(1993)Biol.Chem.Hoppe-Seyler 347166)表明存在7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。這樣，可以預(yù)計(jì)本發(fā)明的IGS1多肽和多核苷酸尤其是具有與它們同源的多肽和多核苷酸類(lèi)似的生物功能/特性，并且它們的應(yīng)用對(duì)任一本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
本發(fā)明的多核苷酸可從自然資源中獲得，如基因組DNA。特別地，可設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并PCR引物，其編碼特定GPCR基因亞家族內(nèi)的保守區(qū)。用簡(jiǎn)并引物對(duì)基因組DNA或cDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致該目標(biāo)基因家族一些成員的擴(kuò)增(包括已知的和新的)(當(dāng)所使用的是基因組模板時(shí)，簡(jiǎn)并引物必須位于同一外顯子內(nèi))。(Libert等人，科學(xué)，1989，244569-572)。本發(fā)明的多核苷酸也可用公知的和商業(yè)上可得到的技術(shù)合成。
編碼SEQ ID NO2之IGS1多肽的核苷酸序列可與包含在SEQ IDNO1中的多肽編碼序列相同(核苷酸數(shù)36至1559)，或者它可以是一個(gè)不同的核苷酸序列，因?yàn)榛蛎艽a子的冗余性(簡(jiǎn)并性)，其與SEQ IDNO1中含有的多肽編碼序列相比，也可顯示變化，但仍編碼SEQ ID NO2之多肽。
當(dāng)本發(fā)明的多核苷酸用作產(chǎn)生IGS1多肽的重組體時(shí)，該多核苷酸可自身包含成熟多肽或其片段的編碼序列；也可符合閱讀地包含成熟多肽或其片段的編碼序列與其它編碼序列，例如那些編碼前導(dǎo)序列或分泌序列、前蛋白、原蛋白或前原蛋白質(zhì)序列、或其它融合肽部分。例如，可編碼促進(jìn)融合多肽純化的標(biāo)記序列。本發(fā)明此方面的某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記序列是6個(gè)組氨酸肽或HA標(biāo)簽，其中pQE載體(Qiagen，Inc.)可提供6個(gè)組氨酸肽，并且Gentz等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院報(bào)(1989)86821-824進(jìn)行了描述。多核苷酸也可包含5’和3’非編碼序列，例如轉(zhuǎn)錄、非翻譯區(qū)、剪切和多聚腺苷化信號(hào)、核糖體結(jié)合位以及穩(wěn)定mRNA的序列。
進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案為編碼IGS1變體的多核苷酸，其中IGS1變體包含SEQ ID NO2的IGS1多肽之氨基酸序列，其中的幾個(gè)、5-10個(gè)、1-5個(gè)或1-2個(gè)氨基酸殘基以任一組合被替換、刪除或添加。
可用本領(lǐng)域普遍公知的方法基因工程設(shè)計(jì)本發(fā)明的多核苷酸，以便為一些目的而改變IGS1編碼序列，其包括(但不限于)克隆、加工和/或基因產(chǎn)物之表達(dá)的改變。通過(guò)隨機(jī)片段化的DNA改組和基因片段的PCR重新組裝以及合成寡核苷酸可用來(lái)基因工程化核苷酸序列。例如寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變可用于導(dǎo)入突變，以產(chǎn)生氨基酸替換、產(chǎn)生新的限制性位點(diǎn)、改變修飾作用(例如糖基化作用或磷酸化作用)模式、改變密碼子偏好、產(chǎn)生剪接變體等。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及可與上述序列雜交的多核苷酸。在這方面，本發(fā)明特別涉及到在嚴(yán)緊條件下可與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。此處所用術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)緊條件”是指只要序列間存在至少80％，優(yōu)選至少90％，較優(yōu)選地至少95％，更優(yōu)選地至少97％，特別優(yōu)選地至少99％的同一性，則會(huì)發(fā)生雜交。
本發(fā)明的多核苷酸可用作cDNA和基因組DNA的雜交探針，以分離編碼IGS1的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆，以及分離與IGS1基因具有高序列相似性的其它基因(包括編碼來(lái)自非人物種的同種物或直系同源進(jìn)化物的基因)的cDNA和基因組克隆，其中所述多核苷酸與SEQ ID NO1中含有的核苷酸序列或其片段相同或十分相同。本領(lǐng)域技術(shù)人員周知此類(lèi)雜交技術(shù)。一般地，這些核苷酸序列與參考的核苷酸序列80％，優(yōu)選地90％，更優(yōu)選地95％相同。探針通常包含至少5個(gè)核苷酸，并且優(yōu)選地至少8個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少10個(gè)核苷酸，更優(yōu)選地至少12個(gè)核苷酸，特別是至少15個(gè)核苷酸。此類(lèi)探針最優(yōu)選的為具有至少30個(gè)核苷酸，以及具有至少50個(gè)核苷酸。特別優(yōu)選的探針在30至50個(gè)核苷酸的范圍之間。
為了獲得編碼IGS1多肽之多核苷酸，其包括來(lái)自非人物種的同種物或直系同源進(jìn)化物，一個(gè)實(shí)施方案包含以下步驟在嚴(yán)緊的雜交條件下，用具有SEQ ID NO1或其片段的標(biāo)記探針篩選合適的文庫(kù)，并分離含有該核苷酸序列的全長(zhǎng)cDNA和基因組克隆。此類(lèi)雜交技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。嚴(yán)緊雜交條件為如上所定義的或經(jīng)改變的條件，于溶液中42℃過(guò)夜溫育，然后在約65℃下，用0.1×SSC洗膜，其中所述雜交溶液含有50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖以及20微克/ml變性的切斷鮭精DNA。
本發(fā)明的多核苷酸和多肽可用作研究試劑和材料，以發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物和人類(lèi)疾病的治療和診斷方法。載體、宿主細(xì)胞、表達(dá)本發(fā)明也涉及載體，其包含本發(fā)明的一種多核苷酸或多種多核苷酸，還涉及用本發(fā)明的載體經(jīng)基因工程改造的宿主細(xì)胞，并涉及用重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。通過(guò)本發(fā)明的DNA構(gòu)建體得到的RNA，可用無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生此類(lèi)蛋白質(zhì)。
為了產(chǎn)生重組體，可通過(guò)基因工程改造宿主細(xì)胞，使之具有本發(fā)明之多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)或其部分。許多標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)中描述的方法可實(shí)現(xiàn)多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞，例如Davis等人，分子生物學(xué)基礎(chǔ)方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)(1986)和Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版(MOLECULARCLONINGA LABORATORY MANUAL，2nd Ed.)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約(1989)中描述的例如磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、transvection、微注射、陽(yáng)離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、轉(zhuǎn)導(dǎo)、scrape loading、粒子轟擊導(dǎo)入或注射。
合適宿主的代表性實(shí)例包括細(xì)菌細(xì)胞，例如鏈球菌屬(Streptococci)、葡萄球菌屬(Staphylococci)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞；真菌細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞和曲霉屬(Aspergillus)細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞例如果蠅屬S2(Drosophila S2)和灰翅夜蛾屬Sf9(Spodoptera Sf9)細(xì)胞；動(dòng)物細(xì)胞例如CHO、COS、Hela、C127、3T3、BHK、HEK293和鮑斯黑素瘤細(xì)胞(Bowes melanoma cells)；以及植物細(xì)胞。
可使用許多表達(dá)系統(tǒng)。此類(lèi)系統(tǒng)尤其包括衍生于染色體的、游離體的以及病毒的系統(tǒng)，例如，衍生于細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、酵母游離體、插入成分、酵母染色體成分、病毒(如桿狀病毒(baculoviruses)、乳多空病毒(papova viruses)如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒(fowl pox viruses)、假狂犬病病毒(pseudorabies viruses)和逆病毒(retroviruses))的質(zhì)粒，以及衍生于其組合的質(zhì)粒，如那些衍生于質(zhì)粒和噬菌體遺傳成分的質(zhì)粒，如粘粒和噬菌粒。表達(dá)系統(tǒng)可包含控制區(qū)，其調(diào)節(jié)并引起表達(dá)。通?？墒褂萌我幌到y(tǒng)或載體，其適于在宿主內(nèi)維持、增殖或表達(dá)多核苷酸以產(chǎn)生多肽?？捎迷S多公知的和常規(guī)技術(shù)之一將合適的核苷酸序列插入表達(dá)系統(tǒng)，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(出處同前)。
可將合適的分泌信號(hào)加入目標(biāo)多肽，使被翻譯蛋白質(zhì)分泌入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、壁膜間隙或分泌至胞外環(huán)境。這些信號(hào)對(duì)多肽而言可以是內(nèi)源的或者它們可是異源信號(hào)。
如果IGS1多肽的表達(dá)用于篩選測(cè)定，通常優(yōu)選在細(xì)胞表面產(chǎn)生多肽。在這種情況下，可于使用篩選分析前收獲細(xì)胞。在IGS1多肽的親和性或功能活性由受體活性修飾蛋白質(zhì)(RAMP)修飾時(shí)，盡可能地在細(xì)胞表面共表達(dá)相關(guān)的RAMP是優(yōu)選的并且通常是需要的。在這種情況下，同樣需要在篩選分析前收獲表達(dá)IGS1多肽和相關(guān)RAMP的細(xì)胞。如果IGS1多肽分泌至培養(yǎng)基中，可回收培養(yǎng)基，以回收和純化多肽；如果產(chǎn)生在胞內(nèi)，在回收多肽前必須首先裂解細(xì)胞。
可采用公知的方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化IGS1多肽，其中包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析、羥基磷灰石層析和凝集素層析。最優(yōu)選地，使用高效液相色譜法純化?？墒褂弥苤夹g(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的重折疊，使在分離和/或純化過(guò)程中變性的多肽再生為活性構(gòu)象。診斷測(cè)定本發(fā)明也涉及IGS1多核苷酸用作診斷試劑的用途。對(duì)與功能紊亂相關(guān)的IGS1基因之突變形式的檢測(cè)可提供一種診斷工具，其可添加至或定義一種疾病或疾病易感性，其源于IGS1的低表達(dá)、過(guò)表達(dá)或表達(dá)改變。同樣在這種情況下，需要相關(guān)的受體活性修飾蛋白質(zhì)的共表達(dá)，以得到所希望質(zhì)量的診斷測(cè)定?？赏ㄟ^(guò)一系列技術(shù)于DNA水平檢測(cè)攜帶IGS1基因突變的個(gè)體。
用于診斷的核酸可來(lái)自受試者的細(xì)胞。例如來(lái)自血液、尿、唾液、活組織檢查或尸體解剖材料?；蚪MDNA可直接用于檢測(cè)或在分析前通過(guò)PCR或其它擴(kuò)增技術(shù)對(duì)其進(jìn)行酶擴(kuò)增。RNA或cDNA也可以類(lèi)似方式使用?？赏ㄟ^(guò)與正常基因型比較擴(kuò)增產(chǎn)物的大小而檢測(cè)刪除和插入。將擴(kuò)增的DNA與標(biāo)記的IGS1核苷酸序列雜交可鑒定點(diǎn)突變。通過(guò)RNase消化或通過(guò)變性溫度的不同可將完全匹配的序列與錯(cuò)配的雙鏈區(qū)別開(kāi)來(lái)。通過(guò)DNA片段在有或沒(méi)有變性劑的凝膠中電泳遷移率的改變，或通過(guò)直接的DNA測(cè)序也可檢測(cè)DNA序列的差異。見(jiàn)例如Myers等人，科學(xué)(1985)2301242。也可通過(guò)核酸酶保護(hù)測(cè)定來(lái)揭示特定位點(diǎn)處序列的改變，其中所述核酸酶保護(hù)測(cè)定例如RNase和S1保護(hù)或化學(xué)切割方法。見(jiàn)Cotton等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(1985)854397-4401。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)構(gòu)建寡核苷酸引物陣列來(lái)進(jìn)行例如基因突變的有效掃描，其中所述引物包含IGS1核苷酸序列或其片段。陣列技術(shù)方法是周知的，并且具普遍適用性，可用于解決分子遺傳學(xué)中的許多問(wèn)題，包括基因表達(dá)、遺傳連鎖和遺傳變異性。(見(jiàn)例如M.Chee等人，科學(xué)，274卷，610-613頁(yè)(1996))。
診斷測(cè)定提供了對(duì)尤其是上述疾病易感性的診斷或測(cè)定方法，方法是通過(guò)所述方法檢測(cè)IGS1基因中的突變。診斷測(cè)定特別提供了對(duì)精神病學(xué)的和CNS紊亂易感性的診斷或測(cè)定方法，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣，方法是通過(guò)所述方法檢測(cè)IGS1基因中的突變。
此外，尤其是上述疾病可通過(guò)包括測(cè)定樣本的方法來(lái)診斷，其中樣本來(lái)自于IGS1多肽或IGS1 mRNA水平異常下降或升高的受試者?？赏ㄟ^(guò)包括測(cè)定樣本的方法來(lái)診斷，特別是精神病學(xué)的和CNS紊亂，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣，其中樣本來(lái)自于IGS1多肽或IGS1 mRNA水平異常下降或升高的受試者。
可使用任一本領(lǐng)域公知的、用于在RNA水平定量多核苷酸的方法測(cè)定表達(dá)的下降或升高，例如PCR、RT-PCR、RNase保護(hù)、Northern印跡以及其它雜交方法。用于測(cè)定來(lái)自宿主樣本中蛋白質(zhì)水平(如IGS1)的測(cè)定技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。此類(lèi)測(cè)定方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析和ELISA測(cè)定。
本發(fā)明另一方面涉及診斷試劑盒，用于診斷尤其是上述疾病或?qū)ι鲜黾膊≈坏囊赘行栽\斷。特別地，本發(fā)明涉及精神病學(xué)的和CNS紊亂的診斷試劑盒，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
試劑盒可包含(a)IGS1多核苷酸，優(yōu)選地SEQ ID NO1的核苷酸序列或其片段；和/或(b)與(a)互補(bǔ)的核苷酸序列；和/或(c)IGS1多肽，優(yōu)選地SEQ ID NO2的多肽或其片段；和/或(d)針對(duì)IGS1多肽的抗體，優(yōu)選地針對(duì)SEQ ID NO2的多肽的抗體；和/或(e)RAMP多肽，其為IGS1多肽的相關(guān)生物特性或抗原特性所需。
應(yīng)當(dāng)理解在任一此類(lèi)試劑盒中，(a)、(b)、(c)、(d)和(e)可包括其基本成分。染色體測(cè)定本發(fā)明的核苷酸序列對(duì)染色體鑒定也是有價(jià)值的。該序列特異地靶向并且能與個(gè)體的人染色體上之特定位置雜交。根據(jù)本發(fā)明對(duì)染色體相關(guān)序列的作圖是將那些序列與基因相關(guān)疾病聯(lián)系起來(lái)的第一步重要步驟。一旦某個(gè)序列被作圖至精確的染色體位置，則可使該序列在染色體上的物理位置與遺傳圖譜數(shù)據(jù)相聯(lián)系。此類(lèi)數(shù)據(jù)可在，例如V.McKusick，人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳(Mendelian Inheritance in Man)(通過(guò)與約翰霍普金斯大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書(shū)館聯(lián)機(jī)可獲得)中找到。然后通過(guò)連鎖分析(物理毗連基因的共同繼承)鑒定作圖至同一染色體區(qū)的基因和疾病的關(guān)系。
也可測(cè)定受影響的和未受影響的個(gè)體cDNA或基因組序列的差異。如果在一些或全部受影響的個(gè)體觀察到了某個(gè)突變，而未在任一正常個(gè)體觀察到該突變，則這個(gè)突變可能是引起疾病的因子?？贵w本發(fā)明的多核苷酸或其片段或其類(lèi)似物，或表達(dá)它們(如果需要的話(huà)，與相關(guān)的RAMP一起表達(dá))的細(xì)胞也可作為免疫原，以產(chǎn)生對(duì)IGS1多肽免疫特異性的抗體。術(shù)語(yǔ)“免疫特異性的”指抗體對(duì)本發(fā)明之多肽的親和性與它們對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中其它相關(guān)多肽的親和性相比較，抗體對(duì)前者具有明顯較大的親和性。
可使用常規(guī)方法，通過(guò)將多肽或具有表位的片段、類(lèi)似物或細(xì)胞施與動(dòng)物，優(yōu)選的非人，以獲得產(chǎn)生針對(duì)IGS1多肽的抗體。對(duì)于單克隆抗體的制備而言，可使用任一提供通過(guò)連續(xù)的細(xì)胞系培養(yǎng)而產(chǎn)生抗體的技術(shù)。實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(Kohler，G.和Milstein，C.，自然(1975)256495-497)、三瘤trioma技術(shù)、人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，今日免疫學(xué)(Immunology Today)(1983)472)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，單克隆抗體與腫瘤治療(MONOCLONAL ANTIBODIES ANDCANCER THERAPY)，77-96頁(yè)，Alan R.Liss.Inc.，1985)。
上述抗體可用于分離或鑒定表達(dá)多肽的克隆，或通過(guò)親和層析法純化多肽。
此類(lèi)抗IGS1多肽抗體、或抗IGS1多肽-RAMP復(fù)合物抗體也可用于治療尤其是上述疾病。特別地，此類(lèi)抗IGS1多肽抗體、或抗IGS1多肽-RAMP復(fù)合物抗體可用于治療精神病學(xué)的和CNS紊亂，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。動(dòng)物本發(fā)明的另一方面涉及基于非人動(dòng)物的系統(tǒng)，其用作因IGS1反常表達(dá)或活性異常而致的紊亂模型?；诜侨藙?dòng)物的模型系統(tǒng)也可用于進(jìn)一步表征IGS1基因的活性。此系統(tǒng)可用作為鑒定化合物而設(shè)計(jì)的篩選策略之一部分，其中所述化合物能治療基于IGS1的紊亂，尤其是上述疾病。特別地，該系統(tǒng)可用作為鑒定化合物而設(shè)計(jì)的篩選策略之一部分，其中所述化合物能治療基于IGS1之精神病學(xué)的和CNS紊亂，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
以這種方式，基于動(dòng)物的模型可用于鑒定藥物化合物、療法以及干預(yù)法，它們可有效治療反常IGS1表達(dá)或活性異常而致的紊亂。此外，此類(lèi)動(dòng)物模型可用于確定受試動(dòng)物的LD50和ED50。這些數(shù)據(jù)可用于確定潛在的IGS1紊亂治療的體內(nèi)有效性。
基于IGS1紊亂的基于動(dòng)物的模型系統(tǒng)可包括非重組動(dòng)物和重組基因工程的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其中所述紊亂是基于反常的IGS1表達(dá)或活性異常。
IGS1紊亂的動(dòng)物的模型包括例如遺傳模型。顯示基于IGS1紊亂樣癥狀的動(dòng)物模型可通過(guò)使用例如，將如上所述的那些IGS1序列與本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)行基因工程設(shè)計(jì)。例如，可將IGS1序列導(dǎo)入目標(biāo)動(dòng)物的基因組，并使之過(guò)表達(dá)和/或錯(cuò)表達(dá)，或者，如果存在內(nèi)源的IGS1序列時(shí)，它們可被過(guò)表達(dá)、錯(cuò)表達(dá)或另外地它們可被破壞，以使IGS1基因的表達(dá)不足或失活。
為了過(guò)表達(dá)或錯(cuò)表達(dá)IGS1基因序列，可將IGS1基因序列的編碼部分與調(diào)節(jié)序列連接，后者能驅(qū)動(dòng)高水平的基因表達(dá)，或在通常不表達(dá)該基因的目標(biāo)動(dòng)物類(lèi)型的細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)該基因。此類(lèi)調(diào)節(jié)區(qū)將為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，且無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)即可利用。
對(duì)于內(nèi)源的IGS1基因序列的低表達(dá)，可分離并基因工程設(shè)計(jì)這樣的序列，使其重新導(dǎo)入目標(biāo)動(dòng)物的基因組后，可失活或“敲除”內(nèi)源IGS1基因的等位基因。優(yōu)選地，基因工程的IGS1基因序列通過(guò)基因打靶導(dǎo)入，使內(nèi)源的IGS1序列在基因工程的IGS1基因序列整合入動(dòng)物基因組后被破壞。
可用來(lái)產(chǎn)生IGS1相關(guān)紊亂之動(dòng)物模型的任一類(lèi)動(dòng)物包括，但不限于，小鼠、大鼠、兔子、松鼠、豚鼠、豬、小豬、山羊以及非人靈長(zhǎng)類(lèi)的動(dòng)物，例如狒狒、猴子和黑猩猩。
可用本領(lǐng)域公知的任一技術(shù)將IGS1轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的起始系。此類(lèi)技術(shù)包括，但不限于，原核顯微注射(Hoppe，P.C.和Wagner，T.E.，1989，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,873,191)；逆病毒介導(dǎo)的胚系基因轉(zhuǎn)移(van der Putten等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)826148-6152，1985)；胚胎干細(xì)胞的基因打靶(Thompson等人，細(xì)胞(Cell)56313-321，1989，)；胚胎的電穿孔(Lo，分子細(xì)胞生物學(xué)(Mol.Cell.Biol.)31803-1814，1983)；以及精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano等人，細(xì)胞57717-723，1989)等。此類(lèi)技術(shù)的綜述見(jiàn)Gordon，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，國(guó)際細(xì)胞學(xué)評(píng)論(Intl.Rev.Cytol.)115171-229，1989。
本發(fā)明提供所有細(xì)胞內(nèi)均攜帶IGS1轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，以及一些細(xì)胞(而非所有細(xì)胞)內(nèi)攜帶該轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，即鑲嵌動(dòng)物。(見(jiàn)例如，Jakobovits描述的技術(shù)，當(dāng)前生物學(xué)(Curr.Biol.)4；761-763，1994)。轉(zhuǎn)基因可作為單一轉(zhuǎn)基因整合或作為串聯(lián)體整合，例如頭-頭串聯(lián)或頭-尾串聯(lián)。通過(guò)例如下述Lasko等人的方法(Lasko，M.等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)896232-6236，1992)，該轉(zhuǎn)基因可被選擇性導(dǎo)入特定的細(xì)胞類(lèi)型并活化。
此類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性活化所需調(diào)節(jié)序列依賴(lài)于特定的目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型，并且這一點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。
當(dāng)希望IGS1轉(zhuǎn)基因被整合于內(nèi)源IGS1基因的染色體位點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選基因打靶。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)欲應(yīng)用此技術(shù)時(shí)，設(shè)計(jì)用作整合目的之載體，其中所述載體含有與目標(biāo)內(nèi)源IGS1基因同源的一些核苷酸序列(例如小鼠IGS1基因的核苷酸序列)，通過(guò)與染色體序列的同源重組，導(dǎo)入并破壞內(nèi)源IGS1基因或IGS1基因的等位基因的核苷酸序列之功能。通過(guò)例如下述Gu等人(Gu，H.等人，科學(xué)265103-106，1994)的方法，該轉(zhuǎn)基因也可被選擇性導(dǎo)入特定的細(xì)胞類(lèi)型，這樣僅在該細(xì)胞類(lèi)型中失活目標(biāo)內(nèi)源基因。此類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性失活所需調(diào)節(jié)序列依賴(lài)于特定的目標(biāo)細(xì)胞類(lèi)型，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯然的。
一旦產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)測(cè)定重組IGS1基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。最初的篩選可通過(guò)Southern印跡分析或PCR技術(shù)來(lái)分析動(dòng)物組織，以測(cè)定是否轉(zhuǎn)基因的整合已發(fā)生。也可使用如下技術(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中IGS1轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平，其中技術(shù)包括，但不限于，對(duì)來(lái)自動(dòng)物組織樣品的Northern印跡分析、原位雜交分析及RT-PCR。表達(dá)目標(biāo)基因的組織樣品也可使用抗體免疫細(xì)胞化學(xué)評(píng)估，其中抗體對(duì)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因目標(biāo)產(chǎn)物是特異的。然后對(duì)以易于檢測(cè)到的水平表達(dá)IGS1基因mRNA或IGS1轉(zhuǎn)基因肽(用直接抗目標(biāo)基因產(chǎn)物表位的抗體通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè))的IGS1轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行進(jìn)一步的評(píng)估，以鑒定顯示特征性基于IGS1紊亂癥狀的那些動(dòng)物。
一旦產(chǎn)生IGS1轉(zhuǎn)基因的起始動(dòng)物(即那些在目標(biāo)細(xì)胞或組織中表達(dá)IGS1蛋白質(zhì)的動(dòng)物，并且優(yōu)選地，顯示基于IGS1紊亂癥狀的那些動(dòng)物)，可對(duì)它們進(jìn)行繁殖、近交繁殖、雜交繁殖或雜交育種，以產(chǎn)生特定動(dòng)物群體。此類(lèi)繁殖策略的實(shí)例包括，但不限于將具有多于一個(gè)整合位點(diǎn)的起始動(dòng)物雜交繁殖，以建立分離品系；將分離品系近交繁殖，以產(chǎn)生復(fù)合的IGS1轉(zhuǎn)基因?qū)W，因?yàn)槊總€(gè)IGS1轉(zhuǎn)基因的加合表達(dá)作用，其可高水平表達(dá)目標(biāo)IGS1轉(zhuǎn)基因；雜合子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交，以在特定整合位點(diǎn)產(chǎn)生純合動(dòng)物，目的在于提高表達(dá)并無(wú)需通過(guò)DNA分析來(lái)篩選動(dòng)物；將分離的純合子品系雜交，以產(chǎn)生復(fù)合的雜合子或純合子品系；繁殖具有不同近交繁殖遺傳背景的動(dòng)物，以檢驗(yàn)改變等位基因?qū)GS1轉(zhuǎn)基因的表達(dá)及對(duì)產(chǎn)生IGS1樣癥狀的影響。一種方法是將IGS1轉(zhuǎn)基因的起始動(dòng)物與野生型品系雜交，以產(chǎn)生顯示如上所述的那些IGS1相關(guān)的紊亂樣癥狀之F1代。然后將F1代近交，以開(kāi)發(fā)一種純合子品系，如果發(fā)現(xiàn)純合子的目標(biāo)基因轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可存活。疫苗本發(fā)明的另一方面涉及誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法，其包括施與(例如通過(guò)接種)哺乳動(dòng)物IGS1多肽或其片段，如果需要的話(huà)，與RAMP多肽一同施與，足以產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞免疫反應(yīng)，以保護(hù)所述的動(dòng)物免于尤其是上述疾病之一。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的方法，其包括通過(guò)載體遞送IGS1多肽，其中載體可于體內(nèi)表達(dá)IGS1多核苷酸，以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，保護(hù)所述的動(dòng)物免于疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步的方面涉及免疫/疫苗制劑(組合物)，其導(dǎo)入哺乳動(dòng)物宿主后，可在哺乳動(dòng)物內(nèi)誘導(dǎo)對(duì)IGS1多肽的免疫反應(yīng)，其中組合物包含IGS1多肽或IGS1基因。此類(lèi)免疫/疫苗制劑(組合物)可為治療性免疫/疫苗制劑或預(yù)防性免疫/疫苗制劑。疫苗制劑可進(jìn)一步包含合適的載體。因?yàn)镮GS1多肽在胃中可被降解，故優(yōu)選地腸胃外施用(包括皮下注射、肌內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、真皮內(nèi)注射等)。適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，其可包含抗氧化劑、緩沖液、抑菌劑和可使制劑與受者的血液等滲的溶質(zhì)；以及水性和非水性無(wú)菌懸液，其可包含懸浮因子或增稠因子。制劑可以單位劑量或多劑量存在于容器中，例如密封安瓿和小玻璃瓶，并且可在冷凍干燥條件下儲(chǔ)存，在使用前只需加入無(wú)菌液體載體。疫苗制劑也可包含佐劑系統(tǒng)，以促進(jìn)制劑的免疫原性，例如本領(lǐng)域公知的水包油系統(tǒng)和其它系統(tǒng)。劑量依賴(lài)于疫苗的比活性，并且很容易通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)測(cè)定。篩選測(cè)定本發(fā)明的IGS1多肽可用作化合物的篩選方法，其中化合物與該受體結(jié)合，并且活化(激動(dòng)劑)或抑制(拮抗劑)本發(fā)明之受體多肽的活化。這樣，本發(fā)明的多肽也可用于評(píng)估在例如，細(xì)胞、無(wú)細(xì)胞制備物、化學(xué)文庫(kù)以及天然產(chǎn)物混合物中，小分子底物與配體的結(jié)合。這些底物和配體可以是天然的底物和配體，或者是結(jié)構(gòu)或功能的模擬物。
IGS1多肽負(fù)責(zé)生物功能，包括病理學(xué)方面。據(jù)此希望找到化合物和藥物，其一方面刺激IGS1，并且另一方面其可抑制IGS1的功能。通常，激動(dòng)劑用于對(duì)尤其是上述疾病情況的治療和預(yù)防目的。特別地，激動(dòng)劑用于對(duì)精神病學(xué)的和CNS紊亂的治療和預(yù)防目的，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
拮抗劑可用于對(duì)尤其是上述疾病情況的一系列治療和預(yù)防目的。特別地，拮抗劑用于對(duì)精神病學(xué)的和CNS紊亂的治療和預(yù)防目的，尤其是運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙、運(yùn)動(dòng)失調(diào)或疾病，例如抽搐、震顫、圖雷特氏綜合征、帕金森氏疾病、亨廷頓疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、張力障礙和痙攣。
通常，此篩選步驟包括產(chǎn)生合適的細(xì)胞，其在表面表達(dá)本發(fā)明的受體多肽，并且如果必要的話(huà)，與RAMP在其表面共表達(dá)。此類(lèi)細(xì)胞包括來(lái)自哺乳動(dòng)物、酵母、果蠅屬或大腸桿菌的細(xì)胞。然后，將表達(dá)該受體的細(xì)胞(或含有表達(dá)受體的細(xì)胞膜)與試驗(yàn)化合物接觸，以觀察結(jié)合，或功能反應(yīng)的刺激或抑制。
一種篩選技術(shù)包括在系統(tǒng)中使用表達(dá)本發(fā)明的受體之細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞)，其中系統(tǒng)可測(cè)量胞外pH、胞內(nèi)pH或受體活化引起的胞內(nèi)鈣變化。在此技術(shù)中，化合物與表達(dá)本發(fā)明的受體多肽的細(xì)胞接觸，然后測(cè)定第二信使反應(yīng)，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、pH改變或鈣水平的改變，以確定潛在的化合物是否活化或抑制了該受體。
另一種方法涉及受體抑制劑的篩選，它通過(guò)測(cè)定受體介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)而進(jìn)行，例如cAMP累積和/或腺苷酸環(huán)化酶活性。此方法包括用本發(fā)明的受體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，以在細(xì)胞表面表達(dá)該受體。然后當(dāng)存在潛在的拮抗劑時(shí)，將細(xì)胞暴露于本發(fā)明的受體之激動(dòng)劑。如果潛在的拮抗劑與受體結(jié)合，這樣會(huì)抑制受體的結(jié)合，調(diào)節(jié)激動(dòng)劑介導(dǎo)的信號(hào)。
另一種檢測(cè)本發(fā)明的受體之激動(dòng)劑或拮抗劑的方法是在美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,482,835中描述的基于酵母的技術(shù)。
測(cè)定可只需測(cè)試候選化合物的結(jié)合，其中與帶有受體之細(xì)胞的粘附可通過(guò)與候選化合物直接或間接結(jié)合的標(biāo)記而檢測(cè)，或者測(cè)定中涉及到與標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)物競(jìng)爭(zhēng)。進(jìn)一步地，使用適于對(duì)表面攜帶受體之細(xì)胞的檢測(cè)系統(tǒng)，這些測(cè)定可測(cè)試候選化合物是否通過(guò)活化受體導(dǎo)致信號(hào)產(chǎn)生。通常在公知的激動(dòng)劑存在時(shí)，測(cè)定活化作用的抑制劑，并且在候選化合物存在時(shí)，觀察激動(dòng)劑對(duì)活化作用的影響。
進(jìn)一步地，測(cè)定可只需包含以下步驟將候選化合物與含有IGS1多肽的溶液混合以形成混合物，測(cè)定混合物中IGS1活性，并將混合物的IGS1活性與標(biāo)準(zhǔn)比較。
IGS1 cDNA、蛋白質(zhì)以及該蛋白質(zhì)的抗體也可用于構(gòu)型測(cè)定，用于檢測(cè)添加的化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)IGS1 mRNA和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的影響。例如通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，用單克隆和多克隆抗體構(gòu)建ELISA，以測(cè)定IGS1蛋白質(zhì)的分泌水平或細(xì)胞相關(guān)水平，并且它可用于從經(jīng)適當(dāng)操作的細(xì)胞或組織中發(fā)現(xiàn)這樣的藥劑，其可抑制或增強(qiáng)IGS1的產(chǎn)生(也分別稱(chēng)為拮抗劑和激動(dòng)劑)。進(jìn)行篩選測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法為本領(lǐng)域周知。
潛在的IGS1拮抗劑的實(shí)例包括抗體或，在有些時(shí)候，為寡核苷酸或與IGS1的配體密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，例如配體的片段或小分子，其與受體結(jié)合但不引起反應(yīng)，導(dǎo)致受體活性被抑制。
這樣在另一方面，本發(fā)明涉及篩選試劑盒，其用于鑒定IGS1多肽的激動(dòng)劑、拮抗劑、配體、受體、底物、酶等；或者用于鑒定降低或增強(qiáng)IGS1多肽產(chǎn)生的化合物，其包括(a)IGS1多肽，優(yōu)選地SEQ ID NO2的多肽；(b)表達(dá)IGS1多肽的重組細(xì)胞，優(yōu)選地表達(dá)SEQ ID NO2的重組細(xì)胞；(c)表達(dá)IGS1多肽的細(xì)胞膜，優(yōu)選地表達(dá)SEQ ID NO2的細(xì)胞膜；或(d)針對(duì)IGS1多肽的抗體，優(yōu)選地SEQ ID NO2的抗體。
應(yīng)當(dāng)理解在任一此類(lèi)試劑盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可包括其基本成分。預(yù)防和治療方法本發(fā)明提供了治療與IGS1活性過(guò)量或不足有關(guān)的反常情況的方法。
如果IGS1活性過(guò)度，可采用一些方法。一種方法包括將如上所述的抑制劑化合物(拮抗劑)與藥學(xué)可接受的載體一起以有效量施與受試者，通過(guò)阻斷配體與IGS1的結(jié)合，或通過(guò)抑制與RAMP多肽或第二信號(hào)的相互作用，從而抑制活化作用，由此緩解反常情況。
在另一種方法中，可施用IGS1多肽的可溶形式，其仍可與內(nèi)源的IGS1競(jìng)爭(zhēng)地結(jié)合配體。此類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)物的一般實(shí)施方案包括IGS1多肽片段。
還有另一種方法，編碼內(nèi)源IGS1的基因之表達(dá)可用表達(dá)-阻斷技術(shù)抑制。公知的此類(lèi)技術(shù)涉及反義序列的使用，該反義序列或在內(nèi)部產(chǎn)生，或單獨(dú)施用。見(jiàn)例如，O’Connor，神經(jīng)化學(xué)雜志(J Neurochem)(1991)56560寡脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑(Oligodeoxynucleotidesas Antisense Inhibitors of Gene Expression)，CRC Press，Boca Raton，美國(guó)弗羅里達(dá)(1988)。另外，可提供能與基因形成三股螺旋的寡核苷酸。見(jiàn)例如，Lee等人，核酸研究(1979)63073；Cooney等人，科學(xué)(1988)241456；Derven等人，科學(xué)，(1991)2511360。這些寡聚物本身是可施用的，或者可在體內(nèi)表達(dá)相關(guān)的寡聚物。合成的反義或三鏈寡核苷酸可含有經(jīng)修飾的堿基或經(jīng)修飾的主鏈。后者的實(shí)例包括甲基磷酸酯、硫代磷酸酯或肽核酸主鏈。在反義或三鏈寡核苷酸中摻入此類(lèi)主鏈，以保護(hù)不受核酸酶的降解，并且為本領(lǐng)域周知。合成的具有這些或其它經(jīng)修飾主鏈的反義或三鏈分子也形成了本發(fā)明的一部分。
此外，可使用對(duì)IGS1 mRNA序列特異的核酶阻止IGS1多肽的表達(dá)。核酶是具有酶活性的RNA，其可為天然的或合成的(見(jiàn)例如Usman，N.等人，結(jié)構(gòu)生物學(xué)最新觀點(diǎn)(Curr.Opin.Struct.Biol.)(1996)6(4)，527-33)。合成的核酶可設(shè)計(jì)為在所選位點(diǎn)特異地切割I(lǐng)GS1 mRNA，由此阻止IGS1mRNA翻譯為功能多肽?？捎锰烊坏暮颂橇姿嶂麈満吞烊粔A基合成核酶，正如通常在RNA分子中所見(jiàn)。另外，可用非天然的主鏈合成核酶，以提供免受核酸酶降解的保護(hù)，例如2’-O-甲基RNA，并且可含有經(jīng)修飾的堿基。
為治療與IGS1和其活性低表達(dá)相關(guān)的反常情況，也可采用一些方法。一種方法包括將活化IGS1的化合物(即上述的激動(dòng)劑)與藥學(xué)可接受的載體組合以治療有效量施與受試者，以因此減輕反常情況。另外，可使用基因治療，以實(shí)現(xiàn)受試者體內(nèi)的相關(guān)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源IGS1。例如，如上所討論的，本發(fā)明的多核苷酸可被基因工程設(shè)計(jì)，以便在復(fù)制缺陷的逆病毒載體中表達(dá)。然后可分離該逆病毒表達(dá)構(gòu)建體并將其導(dǎo)入包裝細(xì)胞，其中包裝細(xì)胞用含有編碼本發(fā)明多肽的RNA的逆病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得包裝細(xì)胞現(xiàn)在可產(chǎn)生含有目標(biāo)基因的感染性病毒粒子。這些生產(chǎn)者細(xì)胞可施與受試者用于體內(nèi)構(gòu)建細(xì)胞，并在體內(nèi)表達(dá)多肽。基因治療的綜述見(jiàn)人分子遺傳學(xué)(Human Molecular Genetics)一書(shū)中第20章，基因治療和其它基于分子遺傳的治療方法(Chapter 20，Gene Therapy andother Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches)(并且此處引用作為參考)，Strachan T.和Read A.P.，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996).
上述任一治療方法可用于任一需要此類(lèi)治療的受試者，包括例如，哺乳動(dòng)物如狗、貓、牛、馬、兔、猴以及最優(yōu)選地，人。
制劑及施用肽，例如IGS1多肽的可溶形式，以及激動(dòng)劑和拮抗劑肽或小分子，可與合適的藥物載體組合而形成制劑。此類(lèi)制劑包括治療有效量的多肽或化合物，以及藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。制劑應(yīng)該為適于施用的模式，并且在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及藥學(xué)包裝和試劑盒，它們含有用一種或多種本發(fā)明的上述組合物之成分填充的一個(gè)或多個(gè)容器。
本發(fā)明的多肽和其它化合物可單獨(dú)使用，或與其它化合物，如治療化合物結(jié)合。
對(duì)藥物組合物進(jìn)行系統(tǒng)施用的優(yōu)選形式包括注射，一般通過(guò)靜脈內(nèi)注射。也可用其它注射途徑，例如皮下注射、肌內(nèi)注射或腹腔內(nèi)注射。用于系統(tǒng)施用的其它途徑包括使用滲透劑(如膽汁鹽或夫西地酸或其它去污劑)經(jīng)粘膜和經(jīng)皮膚施用。此外，如果存在合適的腸制劑或膠囊制劑，也可口服施用。
所需的劑量范圍依賴(lài)于對(duì)肽或化合物的選擇、施用途徑、制劑的性質(zhì)、受試者情況的性質(zhì)和主治開(kāi)業(yè)醫(yī)生的決定。合適的劑量范圍為0.1-100μg/kg受試者。但鑒于許多化合物是可得到的，以及不同的施用途徑具有不同的有效性，可以預(yù)計(jì)所需劑量存在大的差異。例如，可以預(yù)計(jì)口服施用與靜脈內(nèi)注射比較，前者需要較高的劑量。這些劑量水平間的差異可用標(biāo)準(zhǔn)的日常經(jīng)驗(yàn)調(diào)整優(yōu)化，這一點(diǎn)為本領(lǐng)域周知。
用于治療的多肽也可在受試者體內(nèi)內(nèi)源地產(chǎn)生，在治療形式上通常稱(chēng)為如上所述的“基因治療”。這樣例如，來(lái)自受試者的細(xì)胞可用多核苷酸(如DNA或RNA)基因工程改造，以離體編碼多肽，以及例如，通過(guò)逆病毒質(zhì)粒載體的使用。然后將細(xì)胞導(dǎo)入受試者。
下列實(shí)施例只用于進(jìn)一步較詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，因此這些實(shí)施例無(wú)論如何不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.編碼新的G蛋白偶聯(lián)受體之cDNA克隆實(shí)施例1a.基因組片段的同源PCR克隆，其中基因組片段編碼新的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。
基于PCR的同源克隆策略用于分離部分基因組DNA序列，其中所述基因組DNA序列編碼新的G蛋白偶聯(lián)受體。分別在神經(jīng)緊張素受體基因家族跨膜結(jié)構(gòu)域1(TM1)的保守區(qū)內(nèi)以及跨膜結(jié)構(gòu)域3與胞內(nèi)環(huán)n02(TM3/12)交界處設(shè)計(jì)下列正向(F11)和反向(R13)簡(jiǎn)并PCR引物F11(TM1)5’-CATCTTCGTCGTCGGCAC(A，C，G orT)G(C or T)(A，C，G or T)GG(A，C，G or T)AA-3’(SEQ ID NO3)R13(TM3/12)5’-GGGTGGCAGATGGCCA(A or G)(A or G)(C or T)A(A，C，G orT)c(G or T)(C or T)TC-3’(SEQ ID NO4)
此外，設(shè)計(jì)了一條3’封閉的寡引物(HNTR1F1STOP)HNTR1F1STOP5’-ACGGTGGGCAACACGGTGACGGCGTT-3’-3’-dA(SEQ ID NO5)3’封閉引物對(duì)人神經(jīng)緊張素受體(NTR1)cDNA TM1編碼區(qū)中是特異的，并且與簡(jiǎn)并正向引物部分重疊(和競(jìng)爭(zhēng))。它的3’-末端用3’-脫氧腺苷基團(tuán)封閉，以阻止聚合酶催化的延伸(Eurogentec，Belgium catalogueOL-0401-0302)。
于60μl體積中進(jìn)行PCR反應(yīng)，其中含有100ng人基因組DNA(Clontech)、6μl 10×PCR緩沖液II(100mM Tris-HCl pH8.3；500mMKCl，Perkin Elmer)、3.μl 25mM MgCl2、0.36μl dNTP(每種dNTP25mM)、1.5單位AmpliTaqTM聚合酶(Perkin Elmer)、每條簡(jiǎn)并的正向和反向引物各30pmole，以及3’封閉引物100pmole。反應(yīng)管于94℃加熱2分鐘，然后進(jìn)行20個(gè)循環(huán)的變性(94℃，30秒)、退火(55℃，1分鐘，每次減少-0.25℃/循環(huán))和延伸(72℃，1分鐘)，接下來(lái)進(jìn)行另一輪20個(gè)循環(huán)的變性(94℃，30秒)、退火(50℃，1分鐘)和延伸(72℃，1分鐘)。最后于72℃5分鐘加熱反應(yīng)管。2％瓊脂糖凝膠對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物的大小進(jìn)行分離并用溴化乙錠染色。用Qiaex-IITM純化試劑盒(QiagenInc.)純化凝膠上預(yù)期大小(±300bp)的片段，并按照供應(yīng)商(pGEM-T試劑盒Promega)推薦步驟連接至pGEM-T質(zhì)粒。這樣產(chǎn)生的重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌SURETM2細(xì)菌(Stratagene)。
將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于含氨芐青霉素(100μg/ml)、IPTG(0.5mM)和X-gal(50μg/ml)的LB瓊脂平板。菌落轉(zhuǎn)移至Hybond N+膜(Amersham)上并根據(jù)Buluwela等人的微波爐步驟(核酸研究17，452頁(yè)；1989)變性和固定DNA。轉(zhuǎn)移集落用改良Church緩沖液(0.5M磷酸鹽、7％SDS、10mM EDTA)65℃預(yù)雜交2小時(shí)，然后在含有等摩爾32P-標(biāo)記的人神經(jīng)緊張素受體1和2 cDNA探針(NTR1/2)之2×106cpm/ml的同一緩沖液中65℃過(guò)夜雜交。根據(jù)供應(yīng)商提供的指導(dǎo)，用Prime-It II kitTM(Stratagene)通過(guò)隨機(jī)引物法將[α-32P]dCTP摻入，進(jìn)行cDNA探針的放射性標(biāo)記，使其比活性＞109cpm/μg，其中所述cDNA探針含有人NTR1和NTR2的全部編碼序列。在高嚴(yán)緊條件下洗雜交濾膜(用2×SSC/0.1％SDS室溫下洗2×30分鐘，然后用0.1×SSC、0.1％SDS于65℃洗2次，每次40分鐘)，并且放射自顯影過(guò)夜。選擇一些高嚴(yán)緊洗膜后顯示無(wú)雜交信號(hào)的隨機(jī)白色集落用于DNA序列分析。
用ABI Prism BigDye終止末端循環(huán)測(cè)序反應(yīng)試劑盒(PE-ABI)進(jìn)行DNA測(cè)序反應(yīng)。通過(guò)EtOH/NaOAc沉淀來(lái)純化循環(huán)測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)物并上樣于ABI 373自動(dòng)測(cè)序儀。鑒定到了兩個(gè)幾乎一樣的克隆(HNT642和HNT768)，其似乎編碼GPCR家族中一個(gè)新成員的部分。我們稱(chēng)該新的GPCR為IGS1。
表3所用的寡引物總覽
實(shí)施例1b.含有完整IGS1編碼序列的cDNA片段之克隆通過(guò)cDNA末端的快速擴(kuò)增法(RACE分析)獲得IGS1 cDNA的完整編碼序列。用Marathon-ReadyTM人腦cDNA(Clontech n07400-1)進(jìn)行5’和3’RACE PCR，所用引物為MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech K1802-1)提供的接頭引物1(AP1SEQ ID NO6)和基于克隆HNT642和HNT768之DNA序列(圖1)的IGS1特異性引物IP11261(3’RACE；SEQ ID NO9)，以及IP11262和IP11263(5’RACE；分別為SEQ ID NO10和11)。接下來(lái)用接頭引物2(AP2；SEQ ID NO7)和IGS1特異性巢式引物IP11260(3’RACE；SEQ ID NO8)，以及IP11515和IP11516(5’RACE；分別為SEQ ID NO13和14)進(jìn)行巢式RACE PCR。根據(jù)Clontech所提供的Marathon-ReadyTMcDNA用戶(hù)手冊(cè)中的指導(dǎo)進(jìn)行初次和巢式PCR RACE反應(yīng)。用1％瓊脂糖凝膠分離巢式PCR RACE產(chǎn)物并用EtBr染色。將凝膠印跡至Hybond N+膜上，并與克隆HNT642之32P-標(biāo)記的插入片段于Church雜交緩沖液65℃過(guò)夜雜交。
AP2/IP11515和AP2/IP11516 5’RACE巢式PCR反應(yīng)的Southern印跡分析均顯示一些陽(yáng)性條帶(±200bp、±250bp、±330bp、±360bp、±400bp和±700bp)。從凝膠上純化這些條帶中的每一條帶并克隆入pGEM-T質(zhì)粒載體(在克隆前混合IP11515和IP11516巢式5’RACE反應(yīng)的單獨(dú)PCR片段)。對(duì)來(lái)自每個(gè)片段的3-4個(gè)隨機(jī)集落進(jìn)行測(cè)序(＝克隆HNT1393-1412)(圖1)。
巢式AP2/IP11260 3’-RACE PCR反應(yīng)顯示一些條帶。從凝膠上純化可與IGS1探針雜交之3’巢式RACE PCR的最大片段(±1,550bp)，并連接至pGEM-T(Promega)，用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌SURE II細(xì)胞。用克隆HNT642之32p-標(biāo)記的插入片段進(jìn)行集落雜交，鑒定來(lái)自該連接反應(yīng)的IGS1特異的轉(zhuǎn)化子。如前所述與探針進(jìn)行集落印跡雜交，并且在高嚴(yán)緊條件下洗(0.1×SSC 0.1％SDS 65℃洗30分鐘)。對(duì)3’RACE巢式PCR文庫(kù)的雜交篩選產(chǎn)生了3個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)它們中的兩個(gè)進(jìn)行測(cè)序(HNT1413-1414)。
在兩個(gè)附加的實(shí)驗(yàn)中，按照供應(yīng)商(Clontech PT1156-1)所提供手冊(cè)中的步驟，從Marathon-ReadyTM人腦cDNA(Clontech)獲得另外三個(gè)3’RACE cDNA克隆(HB4686、HB4687和HB4688)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)來(lái)自初級(jí)3’RACE反應(yīng)的產(chǎn)物(用IGS1特異性引物IIP11261和接頭引物AP1獲得)用半巢式引物對(duì)IP11260/IP11261(分別為SEQ ID NO8和16)再擴(kuò)增。這樣產(chǎn)生了預(yù)想的±1400bp片段，將其從凝膠上純化并克隆入pGEM-T質(zhì)粒載體，產(chǎn)生克隆HB4686和HB4687。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)初級(jí)3’RACE PCR反應(yīng)產(chǎn)物(用IGS1特異性引物IP11684(SEQ ID NO15)和接頭引物AP1獲得)用巢式引物對(duì)IP11260/IP11261再擴(kuò)增。從這個(gè)反應(yīng)中產(chǎn)生了一條±1400bp片段，將其純化并克隆入pGEM-T質(zhì)粒載體，產(chǎn)生克隆HB4688。
對(duì)所有分離的IGS1 cDNA克隆全長(zhǎng)測(cè)序，并可組裝為單一的毗連序列群(圖1)。此處以IGS1 DNA(SEQ ID NO1)給出鄰接的cDNA序列部分，其中鄰接的cDNA序列是對(duì)至少四個(gè)獨(dú)立的cDNA克隆進(jìn)行測(cè)定所確定的。對(duì)此毗連序列群的翻譯顯示出一個(gè)長(zhǎng)的開(kāi)放讀碼框，其可預(yù)測(cè)為含有508個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)顯示出與GPCR蛋白質(zhì)(IGS1PROT；SEQ ID NO2)具有好的同源性。將IGS1毗連序列群的DNA序列與已表達(dá)序列標(biāo)志數(shù)據(jù)庫(kù)(dbest)進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的同源性研究(Blastn；Altschul S.F.等人，，核酸研究，253389-3402)，顯示存在EST20889(登記號(hào)AA318717)和EST登記號(hào)AI672141，它們均與IGS1毗連序列群的3’末端重疊，但位于IGS1開(kāi)放讀碼框外(圖1)。實(shí)施例1c.分離含有全長(zhǎng)IGS1編碼序列之鄰接的cDNA片段通過(guò)對(duì)克隆HNT1398和HNT1413模板進(jìn)行重疊-PCR產(chǎn)生鄰接的IGS1 cDNA克隆。在獨(dú)立的反應(yīng)中(50μl)分別用引物IP12264/IP11264(分別為SEQ ID NO18和12)和IP11260/IP11262(分別為SEQ ID NO8和17)對(duì)100ng HNT1398質(zhì)粒DNA和100ng HNT1413質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(用ExpandTMHigh Fidelity PCR系統(tǒng)[Boehringer]變性[94℃，30秒]、退火[60℃，30秒]和延伸[72℃，1分鐘]反應(yīng)30個(gè)循環(huán))。將每個(gè)PCR反應(yīng)產(chǎn)物取1μl合并，并用引物對(duì)IP12264/IP12261在同樣條件下再擴(kuò)增。該重疊-PCR產(chǎn)生了一條±1730bp的條帶，將其從凝膠上純化并連接入pGEM-T質(zhì)粒載體。重組質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5αF’細(xì)菌。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板。從一些隨機(jī)集落中制備質(zhì)粒DNA，并通過(guò)限制性消化確定插入片段的大小。對(duì)含有±1730bp插入片段的三個(gè)克隆測(cè)序。克隆HB4693的序列與共有的IGS1 cDNA序列完全相同(見(jiàn)圖1)。帶有質(zhì)粒HB4693的菌株在再次鋪于含氨芐青霉素(100μg/ml)的LB瓊脂平板后，進(jìn)行再克隆并保藏于Innogenetics菌種目錄(ICCG#4297)和位于Baarn的真菌菌種保藏中心(CBS)，荷蘭(保藏號(hào)CBS102049)。對(duì)從再克隆的分離株制備的質(zhì)粒DNA再次測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)與以前測(cè)得的共有序列相同。
注意我們后來(lái)發(fā)現(xiàn)引物IP12262序列不包括在克隆HNT1413的插入序列中，并因此從HNT1413模板不能產(chǎn)生擴(kuò)增子。由此我們推斷通過(guò)HNT1413質(zhì)粒DNA(作為攜帶污染而存在于重疊PCR反應(yīng)管)與HNT1398模板產(chǎn)生的擴(kuò)增子之間的直接重疊，導(dǎo)致了重疊片段的成功擴(kuò)增。實(shí)施例2.IGS1的NORTHERN和“MTE陣列”分析實(shí)施例2a.pcDNA3.1(+)hu IGS1表達(dá)載體的構(gòu)建5μg pcDNA3.1(+)(Invitrogen)用Hind III酶切(37℃，3小時(shí))，存在dNTP(0.25mM f.c.)時(shí)用T4聚合酶補(bǔ)平，并且進(jìn)行凝膠分析。將線(xiàn)性化的DNA從凝膠上洗脫(使用Qiagen的Qiaex II提取試劑盒)并溶于40μlH2O。該DNA用Not I消化，并再次進(jìn)行凝膠分析。用Qiaex II凝膠提取試劑盒從凝膠上洗脫所獲得的5364bp載體片段，并溶于40μlH2O。取5μl于凝膠上分析，以檢查大小、量和純度。
5μg pGEM-T hu IGS1質(zhì)粒(ICCG#4297)用Nae I/Not I消化(37℃，3小時(shí))后，可得到人IGS1編碼序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示消化產(chǎn)生了400bp、1629bp和2702bp的三個(gè)片段。從凝膠上洗脫1629bp的片段(Qiaex II)，并重新溶于40μl H2O。取5μl于凝膠上分析。
向Ready-To-Go連接酶管(T4DNA連接酶，Amersham PharmaciaBiotech)加入1μlHind III消化的pcDNA3.1(+)載體、3μl插入片段和16μlH2O，于室溫溫育1小時(shí)。用2μl的連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化經(jīng)化學(xué)處理的感受態(tài)DH5αF’細(xì)菌。將200μl轉(zhuǎn)化的細(xì)菌鋪于LB平板(100μg氨芐青霉素/ml)，于37℃過(guò)夜生長(zhǎng)。挑選16個(gè)隨機(jī)克隆，并培養(yǎng)于3ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。用BioRobotTM9600核酸純化系統(tǒng)(Qiagen)制備質(zhì)粒DNA，并通過(guò)Not I、Pst I和Sph I限制性酶進(jìn)行限制性分析。對(duì)來(lái)自一個(gè)具有正確限制性酶切模式之集落的DNA部分測(cè)序，以證實(shí)插入位點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)具有預(yù)計(jì)的序列。部分測(cè)序的克隆保藏于Innogenetics菌種目錄(ICCG#4350)，并從保藏菌株制備大量的DNA(MegaPrep，Qiagen500試劑盒)。該大規(guī)模的DNA制備物(3μg/μl，共500μl)的序列分析證實(shí)了預(yù)計(jì)的序列。實(shí)施例2b.MTE(多組織表達(dá))陣列分析25ng人IGS1 DNA(來(lái)自peDNA3.1 huIGS1[ICCG#4350]的1093bpAat II插入片段)用(α-32P)-dCTP標(biāo)記。用Micro Bio-Spin P-30柱(BioRad)純化該標(biāo)記探針。16×106cpm標(biāo)記的huIGS1 cDNA探針與30μg的C0t-1、150μg的切斷鯡精DNA和50μl 20×SSC混合成總體積200μl，于95℃加熱5分鐘，然后于68℃溫育30分鐘。將該混合物加入5ml Express Hyb溶液，并均勻分布在人多組織表達(dá)(MTE)陣列(Clontech#7775-1)上。該陣列于68℃過(guò)夜雜交。用2×SSC/1％SDS 65℃洗印跡4次20分鐘，然后用0.1×SSC/0.5％SDS 55℃洗2次20分鐘。該印跡用X線(xiàn)膠片放射自顯影。
IGS1探針在MTE陣列上的雜交顯示只有尾狀核和豆?fàn)詈司邚?qiáng)信號(hào)(圖2)。實(shí)施例2c.Northern印跡分析25ng人IGS1 DNA(來(lái)自peDNA3.1 huIGS1[ICCG#4350]的1093bpAat II插入片段)用(α-32P)-dCTP標(biāo)記。用Micro Bio-Spin P-30柱(BioRad)純化該標(biāo)記探針。8×106cpm標(biāo)記的huIGS1 cDNA探針于95℃變性5分鐘，并將其加入5ml Express Hyb溶液，并均勻分布在人腦MTN Blots II或IV(分別為Clontech#7755-1和#7769-1)上。該印跡于68℃過(guò)夜雜交。用2×SSC/0.05％SDS室溫洗印跡4次10分鐘，然后用0.1×SSC/0.1％SDS 50℃洗2次40分鐘。該印跡用X線(xiàn)膠片放射自顯影。
IGS1探針與來(lái)自不同人腦區(qū)RNA的Northern印跡雜交顯示位于豆?fàn)詈撕臀矤詈说膬蓷l約4,400和9,000核苷酸(nt)的強(qiáng)帶(圖3)。較低的帶為尾狀核，稍密集，而另一個(gè)為豆?fàn)詈说那闆r。于背側(cè)丘腦也可見(jiàn)到4,400和9,000nt的帶，但兩者均很弱。此外于黑質(zhì)可檢測(cè)到一條很弱的9,000nt轉(zhuǎn)錄物，但沒(méi)有4,400nt的帶。最后于小腦、髓質(zhì)和杏仁體觀察到極弱的9,000nt帶。于背側(cè)丘腦和黑質(zhì)不能觀察到4,400nt的帶。這些結(jié)果與MTE分析結(jié)果相吻合，其根據(jù)是于尾狀核和豆?fàn)詈擞^察到IGS1的最強(qiáng)表達(dá)。但未預(yù)料到會(huì)存在2個(gè)轉(zhuǎn)錄物。雖然4,400nt帶最可能對(duì)應(yīng)于IGS1 mRNA，但對(duì)9,000nt帶的來(lái)源還不清楚。因?yàn)镮GS1基因不包含內(nèi)含子(至少在編碼區(qū)沒(méi)有)，故9,000nt轉(zhuǎn)錄物可能不是未剪接或其它剪接的轉(zhuǎn)錄物。它可能是具有另外的多聚腺苷化作用位點(diǎn)的IGS1轉(zhuǎn)錄物，或者它只是一種交叉雜交的類(lèi)。我們假定只可檢測(cè)到一條很弱的9,000nt轉(zhuǎn)錄物而未檢測(cè)到4,400nt轉(zhuǎn)錄物的情況時(shí)，這是因?yàn)?,000nt轉(zhuǎn)錄物較4,400nt轉(zhuǎn)錄物稍強(qiáng)，以及這條較低帶因此剛好在Northern測(cè)定的檢測(cè)限之下。
通過(guò)大鼠腦的IGS1原位雜交分析進(jìn)一步證實(shí)了這些結(jié)果，其在與上述同樣的解剖區(qū)中檢測(cè)到了IGS1的表達(dá)。實(shí)施例3.篩選推定的IGS1配體實(shí)施例1a.構(gòu)建IGS1轉(zhuǎn)染的CHOG 16-細(xì)胞為鑒定IGS1的配體，用IGS1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞。由于IGS1的G蛋白耦聯(lián)機(jī)制未知，故使用了特定的CHO細(xì)胞株，其表達(dá)G-蛋白G 16(CHOG 16，Molecular Devices)，是GPCR公知的“普遍性接合體”(Milligan G.，等人(1996)藥物科學(xué)趨勢(shì)(TrendsPharmacol.Sci.)17235-7)。
所用材料包括IGS1-pREP9載體；SuperFect Transfection Reagent(Qiagen)；生長(zhǎng)培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(Gibco BRL)，補(bǔ)充10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、潮霉素B 400μg/ml；選擇培養(yǎng)基CHO-S-SFM II(Gibco BRL)，補(bǔ)充10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、潮霉素B 400μg/ml和Geneticin 500μg/ml；RNeasy微試劑盒(Qiagen)、DNase I(Ambion，2U/μl)、SuperScript II(Gibco BRL)、SuperScript II200U(Gibco BRL)、AmpliTaq(PerkinElmer)通過(guò)Xho I/Nhe I位點(diǎn)將IGS1編碼序列從pcDNA3.1huIGS1[ICCG#4350]克隆入pREP9(Invitrogen)。按供應(yīng)商所述用SuperFect(Qiagen)轉(zhuǎn)染CHOGα16細(xì)胞。在T25燒瓶中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，棄去培養(yǎng)基并換上選擇培養(yǎng)基。于選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)匯片后，將多克隆于T25燒瓶傳代兩次。細(xì)胞通過(guò)有限稀釋接種，以獲得單克隆。
通過(guò)RT-PCR選擇單克隆。對(duì)14個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)試。根據(jù)所提供的方法，用RNeasy微試劑盒(Qiagen)從單克隆(來(lái)自24孔板的1個(gè)匯片孔)分離RNA。DNase I(Ambion，2U/μl)處理RNA，每個(gè)樣品用1U。用SuperScript II(Gibco BRL)對(duì)一半的RNA樣品進(jìn)行RT-PCR。RNA和oligo-dT16(0.6μM)于65℃ 10分鐘進(jìn)行引物退火，然后置于15℃。加入第一鏈緩沖液(Gibco BRL)，及dNTP各0.43mM、DTT10mM、20U RNasin(Promega，40U/μl)和SuperScript II200U(GibcoBRL，200U/μl)至終體積30μl，然后于42℃溫育1小時(shí)。
用IGS1特異性?xún)?nèi)引物、AmpliTaq(PerkinElmer)進(jìn)行25μl的PCR。首先進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR。為了證實(shí)陽(yáng)性單克隆并獲得最佳的一個(gè)單克隆，用較少的循環(huán)及較高的退火溫度進(jìn)行另一輪PCR。每次PCR反應(yīng)用2μl第一鏈cDNA(來(lái)自30μl)。
6個(gè)最佳單克隆于T25燒瓶中生長(zhǎng)匯片并于含有10％DMSO的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中冷凍。實(shí)施例3b.測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣用Fluorometric Imaging Plate Reader(FLIPR)測(cè)定對(duì)推定配體的反應(yīng)所引起的細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移，從而對(duì)CHOG 16-IGS1細(xì)胞進(jìn)行功能篩選。
對(duì)細(xì)胞的制備，使用了下列材料潔凈、平底、黑色孔96孔板(Costar)；生長(zhǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充10％胎牛血清(Gibco)的含有Glutamax(Gibco)的Nut-Mix F-12(HAM)；培養(yǎng)箱5％CO2，37℃(Nuaire)。
在實(shí)驗(yàn)前24小時(shí)或48小時(shí)接種細(xì)胞至黑色壁微孔板。欲培養(yǎng)48小時(shí)的細(xì)胞密度為0.8×10-4個(gè)細(xì)胞/孔以及欲培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞密度為2.2×10-4個(gè)細(xì)胞/孔。所有步驟在無(wú)菌條件下進(jìn)行。
對(duì)染料上樣，使用了下列材料2mM染料貯存液1mg Fluo-4(Molecular Probes)溶于443μl低水(low-water)DMSO(Sigma)(液體保存在-20℃)；20％普羅尼克酸(pluronic acid)溶液于37℃，將400mg普羅尼克酸(Sigma)溶于2ml低水DMSO(Sigma)(室溫保存)；染料/普羅尼克酸混合液使用前，將等體積的染料貯存液與20％普羅尼克酸混合(染料與普羅尼克酸的終濃度分別為1mM和10％)；4-(二丙基氨磺酰基)苯甲酸，250mM貯存液710mg 4-(二丙基氨磺?；?苯甲酸(Sigma)溶于5ml 1N NaOH，并與5ml補(bǔ)充了20mM HEPES的無(wú)酚紅Hank’s BSS(Gibco)混合；上樣緩沖液10.5ml補(bǔ)充了20mM HEPES的無(wú)酚紅Hank’s BSS(Gibco)，105μl 4-(二丙基氨磺?；?苯甲酸，210μl1M HEPES；洗滌緩沖液補(bǔ)充了20mM HEPES的無(wú)酚紅Hank’s BSS(Gibco)和2.5mM 4-(二丙基氨磺?；?苯甲酸。
2mM染料貯存液與等體積的20％(w/v)普羅尼克酸混合后，立即加至上樣緩沖液中。在不破壞匯片細(xì)胞層的情況下，吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基。每孔用Multidrop(Labsystems)分加100μl上樣緩沖液。細(xì)胞于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘。為計(jì)算背景熒光，一些孔不進(jìn)行染料上樣。染料上樣后，用洗滌緩沖液洗細(xì)胞三次(自動(dòng)的Denley細(xì)胞洗滌儀)，以使基礎(chǔ)熒光降至背景之上20,000-50,000計(jì)數(shù)。加入100μl洗滌緩沖液，并于37℃培養(yǎng)至開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。
用補(bǔ)充了20mM HEPES(Gibco)和0.1％BSA(Sigma)的無(wú)酚紅Hank’s BSS(Gibco)稀釋被篩選化合物。按生產(chǎn)商(Molecular Devices)所述用FLIPR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣。建立的FLIPR參數(shù)為曝光0.4秒，濾波器1，50μl液體加入，移液器高度125μl，擴(kuò)散速度40μl/秒無(wú)混合。

序列表<110>SOLVAY PHARMACEUTICALS B.V.<120>新人G-蛋白偶聯(lián)受體<130>SPW99.04<140><141><160>18<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1659<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(36)..(1559)<400>1gcctgcaacc tgtcycacgc cctctggctg ttgcc atg acg tcc acc tgc acc 53Met Thr Ser Thr Cys Thr1 5aac agc acg cgc gag agt aac agc agc cac acg tgc atg ccc ctc tcc101Asn Ser Thr Arg Glu Ser Asn Ser Ser His Thr Cys Met Pro Leu Ser10 15 20aaa atg ccc atc agc ctg gcc cac ggc atc atc cgc tca acc gtg ctg149Lys Met Pro Ile Ser Leu Ala His Gly Ile Ile Arg Ser Thr Val Leu25 30 35gtt atc ttc ctc gcc gcc tct ttc gtc ggc aac ata gtg ctg gcg cta197Val Ile Phe Leu Ala Ala Ser Phe Val Gly Asn Ile Val Leu Ala Leu40 45 50gtg ttg cag cgc aag ccg cag ctg ctg cag gtg acc aac cgt ttt atc245Val Leu Gln Arg Lys Pro Gln Leu Leu Gln Val Thr Asn Arg Phe Ile55 60 65 70ttt aac ctc ctc gtc acc gac ctg ctg cag att tcg ctc gtg gcc ccc293Phe Asn Leu Leu Val Thr Asp Leu Leu Gln Ile Ser Leu Val Ala Pro75 80 85tgg gtg gtg gcc acc tct gtg cct ctc ttc tgg ccc ctc aac agc cac341Trp Val Val Ala Thr Ser Val Pro Leu Phe Trp Pro Leu Asn Ser His90 95 100ttc tgc acg gcc ctg gtt agc ctc acc cac ctg ttc gcc ttc gcc agc389Phe Cys Thr Ala Leu Val Ser Leu Thr His Leu Phe Ala Phe Ala Ser105 110 115gtc aac acc att gtc ttg gtg tca gtg gat cgc tac ttg tcc atc atc437Val Asn Thr Ile Val Leu Val Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ile120 125 130cac cct ctc tcc tac ccg tcc aag atg acc cag cgc cgc ggt tac ctg485His Pro Leu Ser Tyr Pro Ser Lys Met Thr Gln Arg Arg Gly Tyr Leu135 140 145 150ctc ctc tat ggc acc tgg att gtg gcc atc ctg cag agc act cct cca533Leu Leu Tyr Gly Thr Trp Ile Val Ala Ile Leu Gln Ser Thr Pro Pro155 160 165ctc tac ggc tgg ggc cag gct gcc ttt gat gag cgc aat gct ctc tgc581Leu Tyr Gly Trp Gly Gln Ala Ala Phe Asp Glu Arg Asn Ala Leu Cys170 175 180tcc atg atc tgg ggg gcc agc ccc agc tac act att ctc agc gtg gtg629Ser Met Ile Trp Gly Ala Ser Pro Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Val Val185 190 195tcc ttc atc gtc att cca ctg att gtc atg att gcc tgc 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1.一種分離的多核苷酸，其包含選自如下的核苷酸序列a)核苷酸序列，其編碼根據(jù)SEQ ID NO2的IGS1多肽；b)編碼多肽的核苷酸序列，其中所述多肽由DNA插入片段編碼，所述插入片段包含在保藏號(hào)CBS 102049，保藏于荷蘭的真菌菌種保藏中心的保藏物中，特別是對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1的核苷酸序列；c)核苷酸序列，其全長(zhǎng)至少有80％(優(yōu)選地至少90％)的序列與(a)或(b)的核苷酸序列相同；d)核苷酸序列，其與(a)或(b)或(c)的核苷酸序列互補(bǔ)。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸含有包含于SEQ IDNO1的核苷酸序列，而SEQ ID NO1編碼SEQ ID NO2之IGS1多肽。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸全長(zhǎng)包含至少80％與SEQ ID NO1的核苷酸序列相同的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3的多核苷酸，其為SEQ ID NO1的多核苷酸。
5.權(quán)利要求1-4的多核苷酸，其為DNA或RNA。
6.一種雜交探針，其包含權(quán)利要求1的多核苷酸或其至少有5個(gè)核苷酸，并且優(yōu)選地在30至50個(gè)核苷酸之間的片段。
7.DNA或RNA分子，其含有表達(dá)系統(tǒng)，其中當(dāng)所述表達(dá)系統(tǒng)位于合適的宿主細(xì)胞中時(shí)，該表達(dá)系統(tǒng)可產(chǎn)生包含氨基酸序列的IGS1多肽，其與SEQ ID NO2之多肽具有至少80％的同一性。
8.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求7的表達(dá)系統(tǒng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其為酵母細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的宿主細(xì)胞，其為動(dòng)物細(xì)胞。
11.IGS1受體的膜制備物，其來(lái)自于根據(jù)權(quán)利要求8-10的細(xì)胞。
12.一種產(chǎn)生IGS1多肽的方法，其包括在足以產(chǎn)生該多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求8的宿主，并從培養(yǎng)物中回收多肽。
13.一種產(chǎn)生可產(chǎn)生IGS1多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求7的表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使得細(xì)胞在合適的培養(yǎng)條件下可產(chǎn)生IGS1多肽。
14.IGS1多肽，其包含的氨基酸序列全長(zhǎng)至少80％與SEQ ID NO2的氨基酸序列相同。
15.權(quán)利要求14的多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。
16.一種抗體，其對(duì)權(quán)利要求14的IGS1多肽具有免疫特異性。
17.一種治療受試者的方法，其中受試者需要增強(qiáng)權(quán)利要求14之IGS1多肽受體的活性或表達(dá)，包括(a)施與受試者治療有效量的該受體之激動(dòng)劑；和/或(b)提供受試者分離的多核苷酸，其中包含全長(zhǎng)至少80％與編碼SEQID NO2之IGS1多肽的核苷酸序列相同的核苷酸序列；或包含與所述核苷酸序列互補(bǔ)的、呈可以體內(nèi)影響所述受體活性產(chǎn)生的形式的核苷酸序列。
18.一種治療受試者的方法，其中受試者需要抑制權(quán)利要求14之IGS1多肽受體的活性或表達(dá)，包括(a)施與受試者治療有效量的該受體之拮抗劑；和/或(b)向受試者施用多核苷酸，所述多核苷酸抑制編碼該受體之核苷酸序列的表達(dá)；和/或(c)施與受試者治療有效量的多肽，該多肽與所述受體競(jìng)爭(zhēng)其配體。
19.一種診斷受試者疾病或疾病易感性的方法，所述疾病涉及受試者中權(quán)利要求14之IGS1多肽的表達(dá)或活性，包括(a)于所述受試者的基因組中，確定編碼所述IGS1多肽之核苷酸序列中存在突變與否；和/或(b)對(duì)來(lái)自所述受試者的樣本，分析IGS1多肽是否表達(dá)或其表達(dá)的量。
20.一種鑒定權(quán)利要求14的IGS1多肽之激動(dòng)劑的方法，包括(a)將試驗(yàn)化合物與產(chǎn)生IGS1多肽的細(xì)胞接觸；并且(b)測(cè)定試驗(yàn)化合物是否影響通過(guò)IGS1多肽活化而產(chǎn)生的信號(hào)。
21.一種通過(guò)權(quán)利要求20的方法而鑒定的激動(dòng)劑。
22.鑒定權(quán)利要求14的IGS1多肽之拮抗劑的方法，包括(a)將激動(dòng)劑與產(chǎn)生IGS1多肽的細(xì)胞接觸；并且(b)在候選化合物存在時(shí)，測(cè)定由所述激動(dòng)劑產(chǎn)生的信號(hào)是否消失。
23.一種通過(guò)權(quán)利要求22的方法而鑒定的拮抗劑。
24.一種表達(dá)IGS1多肽的重組宿主細(xì)胞或其膜，其通過(guò)權(quán)利要求13的方法而產(chǎn)生。
25.一種建立遺傳修飾的非人動(dòng)物之方法，其包括以下步驟a)將多核苷酸的編碼部分與調(diào)節(jié)序列相連接，其中所述多核苷酸基本上由編碼具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的核苷酸序列組成，其中所述調(diào)節(jié)序列可驅(qū)動(dòng)高水平的基因表達(dá)或驅(qū)動(dòng)正常情況下在所述動(dòng)物中不表達(dá)的基因在一種細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)。b)基因工程設(shè)計(jì)多核苷酸的編碼部分，并將所述的序列重新導(dǎo)入所述動(dòng)物的基因組中，以這種方式使內(nèi)源基因之等位基因完全或部分失活，其中所述多核苷酸基本上由編碼具有SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其生物活性片段的核酸序列組成，所述內(nèi)源基因之等位基因編碼具SEQ ID NO2之氨基酸序列的蛋白質(zhì)或其生物活性片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的已鑒定的多核苷酸、由它們編碼的多肽以及此類(lèi)多核苷酸和多肽的用途,并涉及它們的產(chǎn)生。更明確地,本發(fā)明的多核苷酸和多肽涉及G－蛋白偶聯(lián)受體家族,稱(chēng)之為IGS1－家族。本發(fā)明也涉及對(duì)此類(lèi)多核苷酸和多肽之作用的抑制或活化,涉及含有該多核苷酸的載體、含有該載體的宿主細(xì)胞以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,其中IGS1基因?yàn)檫^(guò)度表達(dá)、錯(cuò)表達(dá)、表達(dá)不足或被抑制(敲除動(dòng)物)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及篩選化合物的方法,其中所述化合物能作為該G－蛋白偶聯(lián)受體家族IGS1的激動(dòng)劑或拮抗劑,以及IGS1多肽和多核苷酸以及IGS1受體家族的激動(dòng)劑或拮抗劑對(duì)精神病學(xué)的和CNS紊亂的治療中的用途。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1371390SQ00808983
公開(kāi)日2002年9月25日 申請(qǐng)日期2000年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年7月15日
發(fā)明者W·德里爾斯尼德?tīng)? G·尼斯, 張帆 申請(qǐng)人:索爾瓦藥物有限公司