專利名稱：重組血小板膠原受體糖蛋白vi及其藥用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖蛋白VI(GPVI)、其分離、純化以及重組生產(chǎn)方法。特別是，本發(fā)明涉及GPVI，優(yōu)選地重組GPVI的用途，其用于治療與血液凝固紊亂直接或間接相關(guān)的紊亂和病理事件(如血栓和心血管疾病)。胞外重組蛋白質(zhì)也可用于建立篩選鑒定法，以找到膜結(jié)合GPVI潛在的抑制劑，目的在于抑制血小板與膠原的相互作用。血小板在體內(nèi)生存期間，位于血小板表面的GPVI被修飾，因此其可用作血小板年齡曲線的標記。
糖蛋白VI為62/65kDa(分別為非還原的/還原的)血小板膜糖蛋白，其與Fcγ共同亞基一同形成復(fù)合體。GPVI亞基包含膠原結(jié)合位點，F(xiàn)cγ亞基負責(zé)信號傳遞。該復(fù)合體形成了血小板表面的主要膠原受體之一，對應(yīng)答膠原所致血小板活化是關(guān)鍵的。膠原上的識別序列由(GlyProHyp)n序列組成。具有GPVI遺傳缺陷的患者公知來自日本。他們有輕度的出血問題，并且他們的血小板對膠原只有弱反應(yīng)，可能是通過其它受體進行的。對起源于GPVI的信號傳遞級聯(lián)放大已有許多了解，其非常類似于那些免疫受體，包括T-細胞受體、B-細胞受體和天然殺傷細胞受體。這些級聯(lián)包括src家族酪氨酸激酶，如Fyn、Lyn以及p72SYK和許多其它的酪氨酸激酶、磷酸酶、銜接蛋白質(zhì)(如LAT)。這些級聯(lián)的一個主要目標是活化磷脂酶Cγ2，其將磷脂斷裂開，產(chǎn)生第二信使二酰甘油和IP3。GPVI被認為參與了血小板整合蛋白α2β1的活化，其在血小板與受損血管壁的粘附中起主要作用?！扒贸盕cγ亞基的小鼠具有仍顯示可與膠原反應(yīng)的血小板，暗示休眠狀態(tài)的α2β1也可被GPVI/Fcγ復(fù)合體調(diào)節(jié)。血小板膠原受體GPVI與p58KAR家族的天然殺傷激活受體以及FcαR緊密相關(guān)。
休眠的、循環(huán)血小板在血管損傷處的粘附和活化是導(dǎo)致血栓形成過程的第一步，其可轉(zhuǎn)換為止血栓。膠原是血管壁負責(zé)血小板活化的主要成分之一。存在許多類型的膠原，在內(nèi)皮下層發(fā)現(xiàn)了其中7種。在血小板上已確定了一些不同的膠原受體，但目前認為主要的膠原受體為整合蛋白α2β1和非整合蛋白GPVI。雖然對α2β1的特性有充分了解，并且?guī)啄昵熬蛯蓚€亞基進行了克隆及序列測定，但對GPVI的結(jié)構(gòu)仍然不清楚，盡管對其一些特性已經(jīng)確定。大約二十年前已確定GPVI是一個主要的血小板糖蛋白，其分子量在60-65kDa范圍內(nèi)，具酸性pI。它作為推定的膠原受體的角色是通過在日本鑒定的一位輕度出血紊亂患者而建立，該患者的血小板顯示對膠原反應(yīng)的特異性缺陷，并且缺乏這個受體。該患者也產(chǎn)生了針對缺陷受體的自身抗體，它們被用來進一步表征該分子的特性。最近確定了GPVI與共同的Fcγ亞基非共價地結(jié)合，后者作為復(fù)合體的信號傳遞部分而起作用。也闡明了膠原上的GPVI識別序列為位于膠原三聯(lián)螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)的重復(fù)Gly-Pro-Hyp三聯(lián)體，并且基于此結(jié)構(gòu)合成的肽可用作特異的GPVI導(dǎo)向的激動劑。GPVI/Fcγ復(fù)合體通過免疫受體樣機制，將信號傳遞至血小板內(nèi)部，該機制包括p72sYK的活化和通過激酶/磷酸酶/銜接蛋白質(zhì)相互作用的級聯(lián)，導(dǎo)致PLCγ2的活化，且因此釋放顆粒和血小板聚集。進一步表征該分子特性的步驟是證實來自響尾蛇屬(Crotalus)durissus terrificus熱帶響尾蛇的蛇C-型凝集素convulxin可以活化血小板，其通過多聚體的相互作用，使GPVI聚集而活化血小板。convulxin顯示出特異地結(jié)合GPVI，提供了一種與已建立的方法相結(jié)合純化該受體的方法。
因此，從現(xiàn)有技術(shù)很清楚在許多治療領(lǐng)域GPVI似乎是一種很讓人感興趣的化合物，尤其是關(guān)于直接或間接涉及依賴膠原-血小板相互作用的血液凝固事件的應(yīng)用。因此本發(fā)明的目的是以重組體形式提供GPVI，并且顯示它作為直接治療目標或者作為篩選短化合物之工具的有效性，其中的短化合物特別是那些有能力抑制或阻斷天然血小板-膠原相互作用的已化學(xué)合成的或者可化學(xué)合成的化合物。
本發(fā)明也涉及GPVI蛋白質(zhì)的部分或片段，其保持了它們與膠原結(jié)合的生物活性。
本發(fā)明成功地純化了足量的GPVI用于初步的表征和肽序列的測定。該序列用于設(shè)計PCR引物，以確定在DNA文庫中的陽性序列。這個DNA序列然后用作探針，從該文庫中分離接近全長的eDNA序列，并且從血小板cDNA文庫中用RACE法獲得缺失的5’序列。
本發(fā)明也成功地顯示了重組GPVI作為治療上可應(yīng)用的化合物的用途，將它施與例如具有損傷血小板的患者，以結(jié)合膠原，這樣防止了具有膜結(jié)合GPVI的血小板與所述的膠原結(jié)合。
重組的GPVI可溶性胞外域包含膠原結(jié)合位點，并且能抑制由膠原引起的血小板活化。因此它能應(yīng)用于對如下疾病的治療，包括膠原引起的血小板活化增加(如動脈粥樣硬化斑破裂)，疾病如不穩(wěn)定型心絞痛，或應(yīng)用在外科處理過程中(如經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)(PTCA))，其中通過氣囊導(dǎo)管充氣重開動脈，引起血管壁的嚴重損傷，而且大量的血小板活化，往往導(dǎo)致后來血管的再閉合。與目前的處理方法相比較，重組GPVI片段的優(yōu)點是它們在更早的階段通過阻止或減少血小板活化而起作用，而不是通過抑制血小板活化后的事件(如GPIIb-IIIa拮抗劑引起的凝集)。這樣，釋放少量的血小板顆粒內(nèi)含物(包括生長因子和趨化因子)，它們不僅參與傷口修復(fù)，而且參與通過平滑肌遷移的血管壁重塑以及吸引已知有助于動脈粥樣硬化的巨噬細胞(如單核細胞)。也可使用人源化小鼠抗GPVI單克隆抗體的Fab片段，其以相似的作用阻斷血小板表面的GPVI，具有與上面相似的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明的重組GPVI也可用于膠原的結(jié)合測定，用來篩選能抑制該相互作用的小分子(例如組合文庫)和用來開發(fā)治療用化合物，所述化合物為膠原-血小板相互作用的抑制劑。通過合適的衍生化，將這些化合物制備為口服的。再者，主要目的是制備這樣的化合物，其可減少GPVI-膠原相互作用和減少在血小板與膠原接觸處的血小板活化。在本發(fā)明中使用的諸如此類的篩選技術(shù)在現(xiàn)有技術(shù)中已充分建立。通過這樣的篩選測定，本發(fā)明可發(fā)現(xiàn)及開發(fā)新靶，其可作為膠原拮抗劑抑制血小板表面天然的膜結(jié)合GPVI。這些靶可以是小的化學(xué)分子，然后可以是進一步發(fā)明的基礎(chǔ)。
GPVI和識別GPVI特定域的試劑另一個主要應(yīng)用是作為血小板年齡和功能的標記。通常認為年幼的血小板比老的血小板更富有活性和功能。年幼的血小板與對GPVI特異的蛇毒液C-型凝集素convulxin結(jié)合，并且被活化，并且隨著血小板老化，結(jié)合及活化程度均降低。這是因為GPVI蛋白水解的變化或構(gòu)象的變化，或是因為在循環(huán)中血小板的活化或損傷導(dǎo)致它與Fcγ的結(jié)合改變。這是一個測定患者和在醫(yī)學(xué)對照期間正常人體內(nèi)血小板年齡及功能曲線的有用參數(shù)。在許多影響骨髓或免疫系統(tǒng)的疾病中血小板年齡曲線會改變，并且如果能得到用于測定它的較好方法，它可以是一個重要的診斷標準。例如，患者患有增加的血小板更新的疾病將會顯示較多的年幼血小板；而進行化療或輻射治療的患者顯示穩(wěn)定的衰老群體。這樣，這個年齡曲線可用于對治療的精確監(jiān)測。在正常健康人群中，對年齡曲線分布及它作為健康改變預(yù)測信號的角色知之甚少，不知道GPVI的變化是否是因為血小板部分參與了止血事件，也不知道在廣泛的心血管疾病患者體內(nèi)，其變化是否會更顯著。目前，噻唑橙用于檢測含mRNA的年幼循環(huán)血小板，該mRNA不久就衰變，限制了該方法只能用于最年幼的血小板?？捎糜诖藴y定的試劑包括GPVI-特異性蛇毒液蛋白質(zhì)(如convulxin)、或識別GPVI之N-末端區(qū)的單克隆或多克隆抗體、或識別N-末端區(qū)水解后暴露出的新位點或構(gòu)象的單克隆抗體、或存在于完整分子而不存在于已老化血小板的特異構(gòu)象(或反之亦然)、或選擇特異地識別完整GPVI或其修飾形式的小的化學(xué)分子。這些試劑可用熒光素標志標記、或與熒光素標記的二級抗體或親和試劑一起，用于流式細胞術(shù)以測定血小板結(jié)合曲線。另外，在后一階段，可采用基于自動測量血小板曲線的低勞動強度的測量技術(shù)。使用流式細胞術(shù)的細胞分選法或磁珠，能分離年幼的和老的血小板，以檢測參與從循環(huán)中去除老的血小板的因子。識別GPVI特異形式的試劑是這類研究的一個關(guān)鍵。
因此，本發(fā)明的目的是提供編碼糖蛋白VI或其生物活性片段的DNA，特別是圖2的序列。
本發(fā)明進一步的目的提供編碼糖蛋白VI的DNA，其中糖蛋白VI包含

圖1a和1b的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一個目的是提供藥物組合物，其包含重組GPVI及藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑，以及其在生產(chǎn)用于血栓和心血管事件和涉及血小板-膠原相互作用紊亂的治療領(lǐng)域的藥物中的用途。
本發(fā)明的另一個目的是重組GPVI的用途，其可用在檢測血小板-膠原相互作用的特異性抑制劑的篩選工具中。
本發(fā)明的另一個目的是GPVI作為血小板年齡和血小板暴露于心血管疾病的標記的用途。
可能的醫(yī)學(xué)指征及應(yīng)用分別是例如，不穩(wěn)定型胸部心絞痛、PTCA、在這個領(lǐng)域中斯滕特固定模的使用、冠狀血管手術(shù)、血管的一般手術(shù)、可損壞大血管的手術(shù)(如髖關(guān)節(jié)手術(shù))。而且，包括所有的指征，其涉及血管壁和凝固系統(tǒng)相互作用之紊亂引起的血栓事件，具有形成血栓癥并堵塞血管的高風(fēng)險性。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明的GPVI蛋白質(zhì)及其片段在藥學(xué)組合物及其結(jié)合物中適于作為藥學(xué)有效化合物。
根據(jù)本發(fā)明的藥物制劑任選地可包含額外的活性成分，像抗凝劑(如蛭素或肝素)，或血栓溶解劑(如纖溶酶原激活物或hementin)，或其它血小板受體拮抗劑(如GPIIb-IIIa拮抗劑，像abciximab或eptifbatide)，或ADP-受體拮抗劑(如clopidogrel)。
根據(jù)本發(fā)明的新蛋白質(zhì)及其生物活性片段分別可與任一非毒性的、有機酸或無機酸形成藥學(xué)可接受的鹽。無機酸例如鹽酸、溴化氫、硫酸或磷酸以及酸性金屬鹽，如正磷酸單氫鈉和硫酸氫鉀。有機酸的實例為單、二、三羧酸，如乙酸、乙醇酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、延胡索酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、抗壞血酸、馬來酸、羥基馬來酸、苯甲酸、羥基苯甲酸、苯乙酸、苯丙烯酸、水楊酸和磺酸(如甲磺酸)。羧基末端氨基酸部分的鹽包括與任一合適的無機或有機堿形成的非毒性羧酸鹽。這些鹽包括例如，堿金屬(如鈉和鉀)、堿土金屬(如鈣和鎂)、IIIA組的輕金屬，包括鋁，以及有機伯、仲、叔胺，如三烷基胺，包括三乙胺、普魯卡因、二芐胺、1-亞乙基胺(1-ethenamine)、N，N′-二芐乙烯二胺、二羥基二乙胺(dihydroabietylamine)和N-烷基哌啶。
此處所用術(shù)語“藥學(xué)可接受的載體”指惰性、非毒性固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)，不與活性化合物或病人發(fā)生不利反應(yīng)。合適的、優(yōu)選的液體載體為本領(lǐng)域公知，如無菌水、鹽水、含水葡萄糖、糖溶液、乙醇、乙二醇和油，包括來源于石油、動物、蔬菜或合成的油，例如花生油、大豆油和礦物油。
根據(jù)本發(fā)明的制劑可以單位劑量施用，其包括常規(guī)的非毒性藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑、佐劑及載體，通常腸胃外施用。
術(shù)語“腸胃外的”此處包括皮下、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)及氣管內(nèi)注射和輸液技術(shù)。其它施用途徑如經(jīng)口施用和局部涂藥也是適用的。腸胃外的組合物和結(jié)合物最優(yōu)選的是以大丸劑形式(bolus)或根據(jù)公知的步驟連續(xù)輸入的形式靜脈內(nèi)施用。經(jīng)口施用的片劑和膠囊包含常規(guī)的賦形劑，如結(jié)合劑、填充劑、稀釋劑、成片劑、潤滑劑、崩解劑及濕潤劑。根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法包被片劑。
口服液體制備物可為水性或油性懸液、溶液、乳劑、糖漿或酏劑形式，也可以干產(chǎn)物呈現(xiàn)，臨用前用水或其它合適的載體重建。這樣的液體制備物可包含常規(guī)的添加劑，如懸浮劑、乳化劑、非水性載體及防腐劑。
局部涂藥可為水性或油性懸液、溶液、乳劑、膠凍劑或者優(yōu)選地乳膏。
根據(jù)本發(fā)明的單位劑量可包含根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)之每日需要量，或由多個亞劑量構(gòu)成所需劑量。對給定的患者(哺乳類動物，包括人)最佳治療可接受劑量及劑量率依賴于許多因素，例如所使用的特定活性物質(zhì)的活性、患者年齡、體重、綜合健康狀況、性別、飲食、施用時間及途徑、清除率、治療目的，即治療或預(yù)防，以及欲治療的血栓疾病的性質(zhì)、抗血小板或抗凝活性。
在用作抗凝劑的組合物和結(jié)合物中，本發(fā)明的肽對所治療的患者(體內(nèi))之藥學(xué)有效日劑量約在0.01至100mg/kg體重之間，優(yōu)選地在0.1至10mg/kg體重之間。根據(jù)應(yīng)用的形式，單一劑量可包含0.5至10mg的膠原抑制劑。為達到對體外血的抗凝固效果，本發(fā)明肽的藥學(xué)有效量在0.2至150mg/l之間，優(yōu)選地在1mg至20mg/l體外血之間。
附圖簡述圖1GPVI的蛋白質(zhì)序列(單字母代碼)1a前導(dǎo)序列1b成熟蛋白質(zhì)開放讀碼框339個氨基酸星號糖基化位點雙下劃線跨膜結(jié)構(gòu)域下劃線已測序的肽圖2GPVI核苷酸序列，其覆蓋開放讀碼框1017bp，加上3′和5′區(qū)，總共1249bp。
發(fā)明詳述為了用PCR擴增GPVI cDNA之一部分，選擇了兩個序列用于合成DNA引物，其中這兩個序列為顯示遺傳密碼的最小簡并性的7個氨基酸。由于對這兩個肽在蛋白質(zhì)中的定位全然不知，對它們中的每一個均制備了兩條簡并引物，一條有義，一條反義。用這些引物擴增人骨髓文庫。有義5’TYA THC CNG CNA TGA ARMG 3’引物(編碼序列PAMKRSL)與反義5’TTR TAN ARN GCR AAY TGR TC 3’引物(對應(yīng)于DQFALYK)聯(lián)合使用，擴增了221bp的DNA片段。除了所選擇的肽外，擴增的DNA編碼LysC/AspN肽DQLELVATGVFAKPSLSAQPGPAVSS，清楚地將該序列連接至GPVI的cDNA。
用221bp的DNA片段篩選來自骨髓文庫的600,000pfu，產(chǎn)生4個陽性pfu。有三個具1350bp的插入片段，其被限制性酶Sal I或EcoR I切割或未切割且屬于IgG超家族。第四個經(jīng)Sal I消化，具有4.6kb插入片段，并且當用EcoR I處理時，分別產(chǎn)生2300bp和1300bp兩個片段。其DNA編碼10肽序列，后者源于GPVI的氨基酸序列，但終止于氨基酸末端前。沒有找到起始的甲硫氨酸或前導(dǎo)序列，但存在超過2000bp的以前已測序的非讀碼框DNA，其以Alu序列終止、DNA。用位于已通過肽序列確證的GPVI序列部分的引物，對血小板多聚A RNA進行5’末端RACE實驗。在后退至已確定的GPVI序列之前，發(fā)現(xiàn)了一個348bp的片段，其包括第四個克隆中的278bp序列和70bp的新序列(從1987bp開始)對應(yīng)于14個氨基酸(包括第一個甲硫氨酸)。這樣可測序得到cDNA，總共包含1249bp，為起始密碼子上游5’序列25bp，開放讀碼框1017bp，編碼包括前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)，共339個氨基酸，以及包含終止密碼子的3’區(qū)207bp。
從人骨髓cDNA文庫克隆，并測序編碼血小板GPVI的cDNA以提供缺失的5’端序列，方法是用RACE法及血小板mRNA。1017bp的開放讀碼框編碼339個氨基酸以及非翻譯的3’區(qū)。氨基酸序列的疏水性分析顯示存在兩個推定的跨膜域，一個為推定的20個氨基酸的信號序列，一個為位于成熟蛋白質(zhì)的247和265殘基之間的19個氨基酸域。序列及其氨基酸翻譯如圖2及圖1所示。與檢索GenBank找到的最相似分子之氨基酸序列比較清楚地顯示出它屬于免疫球蛋白超家族，并且胞外區(qū)包含兩個Ig C2-域的環(huán)，其由兩個二硫橋形成。它是一個跨膜蛋白一類分子，其氨基末端在外且跨膜一次。最密切相關(guān)的分子屬于天然殺傷受體類，其包含抑制及活化類型。GPVI清楚地屬于活化亞類，不僅通過其功能，而且因為其不像抑制類型，在它的胞質(zhì)區(qū)不包含ITIM序列。它也不包含任一可能參與磷酸化作用的酪氨酸殘基。在此域中有一些蘇氨酸和絲氨酸殘基，但是它們不與任一激酶共有序列標準相匹配。像NK受體的活化類，GPVI包含一個精氨酸殘基作為跨膜區(qū)的第三個氨基酸，其參加與Fcγ亞基的復(fù)合體形成。胞質(zhì)區(qū)包含51個氨基酸，與此家族其它成員的胞質(zhì)域僅顯示小的相似性(在緊靠膜下區(qū))。這暗示了GPVI的這個結(jié)構(gòu)域可能與胞質(zhì)分子的不同類型相關(guān)，而不與其它家族成員相關(guān)。GPVI只包含單一的推定N-糖基化位點，在Asn69。但是此結(jié)構(gòu)域(其緊挨著膜，在Ig區(qū)結(jié)束的β片層之后)富含蘇氨酸和絲氨酸殘基，其可提供O-糖基化位點，如在GPIbα和GPV中發(fā)現(xiàn)的一樣。此O-糖基化位點的主要功能似乎是提供從血小板表面充分延伸的受體結(jié)構(gòu)，從而促進其龐大的配基間的相互作用。由于GPVI早期作為唾液酸糖蛋白建立的，理論的氨基酸分子量(37kDa)與凝膠電泳所測定的分子量(65kDa)之間的差異可能是因為這個糖基化作用。
天然殺傷受體的這兩域類型的結(jié)構(gòu)已通過X射線結(jié)晶學(xué)研究建立，顯示這兩個Ig域與帶有肽的HLA抗原之受體位點(位于肘部外側(cè))形成銳角。HLA肽結(jié)合位點結(jié)構(gòu)與膠原結(jié)構(gòu)的直接比較立即暗示出為什么這些受體有共同起源，因為HLA結(jié)合位點及其包含肽的多重α螺旋結(jié)構(gòu)與膠原的三聯(lián)螺旋結(jié)構(gòu)非常相似。天然殺傷受體據(jù)推論通過兩個受體的二聚體化發(fā)揮作用，所述受體識別正被天然殺傷細胞考察的細胞上兩個分開的HLA位點?？赡艽硕垠w化是活化或去活化機制的一部分，這取決于受體類型。在是GPVI的情況下，也存在兩個GPVI分子與一個Fcγ相結(jié)合的可能性，因為Fcγ二聚體的每一個單體均具有識別序列。但還不知道該化學(xué)計量，基于膠原的結(jié)構(gòu)和通過GPVI和convulxin發(fā)揮作用的膠原樣肽的結(jié)構(gòu)，似乎信號的強度與聚集在一起的GPVI/Fcγ復(fù)合體的數(shù)量相關(guān)。屬于此Ig家族的其它血小板受體包括ICAM-2(CD102)和PECAM(CD31)。
在描述中提及的、與申請專利的本發(fā)明不直接相關(guān)的所有微生物、細胞系、表達系統(tǒng)、表達宿主、質(zhì)粒、啟動子、抗性標記、復(fù)制起點、限制性位點或者載體的其它片段或部分通?？赏ㄟ^商業(yè)或其它途徑得到。只要沒有給出其它暗示，它們只用作實例，并且對本發(fā)明而言不是必需的，并且分別可被其它適合的工具和生物材料替代。
根據(jù)本發(fā)明必需的技術(shù)在下面及上面進行詳述。其它未詳述的技術(shù)對應(yīng)于公知的標準方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員對此熟知，或者在所引用的參考文獻及專利申請和標準文獻中較詳細地進行了描述(如Sambrook等人，1989，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港(Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor)；Harlow，Lane，1988，抗體實驗室手冊，冷泉港(AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor))。
實施例實施例1材料—蛋白質(zhì)A-Sepharose，過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-小鼠和抗-兔抗體、牛血清白蛋白、響尾蛇屬(Crotalus)durissusterrifcus毒液、麥胚凝集素(WGA)、氯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺酯活化的交聯(lián)4％珠狀瓊脂糖和Triton X-114來自Sigma ChemicalCo.(圣路易斯，MO)，辛?；?N-甲基-葡糖胺(ONMG)和壬?；?N-甲基-葡糖胺(NNMG)來自O(shè)xyl Chemie(Bobingen，德國)。
實施例2從血小板分離GPVI-如以前所述從血小板分離膜糖蛋白質(zhì)。簡而言之，洗血小板(來自40個血沉的棕黃層)并且在蛋白酶抑制劑存在時于2％Triton X-114中裂解。分離Triton X-114和水相，去污劑相上樣于麥胚凝集素與Sepharose 4B偶聯(lián)的柱上。用10mMTris HCl，pH 7.4、30mM NaCl、0.2％辛?；?N-甲基葡糖胺(ONMG)和2％N-乙酰葡萄糖胺洗脫血小板糖蛋白。透析和濃縮后，糖蛋白溶液上樣于柱上，該柱為convulxin與p-硝基氯甲酸N-羥基琥珀酰亞胺基酯的交聯(lián)4％珠狀瓊脂糖(1mg/ml)連接。用四倍體積的10mM TrisHCl，pH 7.4、30mM NaCl、0.2％壬?；?N-甲基葡糖胺(NNMG)洗，然后用四倍體積的10mM Tris HCl，pH 7.4、30mM NaCl和2％NNMG洗。用0.08％SDS(溶于10mM Tris HCl，pH 7.4)洗脫GPVI。將溶液濃縮并上樣至8.5％聚丙烯酰胺的制備型凝膠，使用Model 491 PreCell(BioRad，CA)。按照廠商的指導(dǎo)，在非還原條件下進行制備電泳。GPVI在65kDa處作為單一條帶洗脫。級分混合，用Centricon-30(Amicon，Beverly，MA)濃縮并重懸于10mM Tris HCl，pH 7.4和0.1％ONMG。
實施例3GPVI的氨基酸分析—用內(nèi)切蛋白酶LysC和AspN(Boehringer Mannheim，德國)消化GPVI。通過反相HPLC分離產(chǎn)生的10肽，用Applied Biosystem模式477A脈沖-液相蛋白質(zhì)測序儀進行測序，其帶有120A型聯(lián)機乙內(nèi)酰苯硫脲氨基酸分析器。
實施例4從λgt11 cDNA文庫中擴增編碼部分GPVI的221bp片段—來自人骨髓文庫(Clonetech，Palo Alto，CA)的樣本(1010pfu)(噬斑形成單位)用四條簡并引物中的兩組合擴增。最終引物濃度為2μM，dNTP濃度為200μM，每100μl的反應(yīng)使用2U AmpliTaqGold(Perkin Elmer，Rotkreuz，瑞士)。PCR條件為37℃，5個循環(huán)，然后44℃，30個循環(huán)。正向19mer 5′TYATHCCNGCNATGAARMG3′及反向20mer 5′TTRTANARNGCRAAYTGRTC 3′擴增了221bp片段，其被亞克隆至BluescriptKS+(Stratagene，LaJolla，CA)，用T7 Sequence試劑盒(Amersham，瑞士)測序。
實施例5用221bp GPVI探針篩選λgt11 cDNA文庫-從質(zhì)粒上切下該221bp片段，洗凈并用High Prime Labelling試劑盒(Boehringer Mannheim， 瑞士)標記α32P-ATP(20MBq/50μl，Hartmann Analytik，Braunschweig，德國)。按照廠商的說明書篩選人骨髓文庫。陽性噬菌體生長，分離其DNA，并且用EcoR I或Sal I位點亞克隆至BlueScript并測序。用RACE的ABS系統(tǒng)進行測序，如前所述制備血小板poly A RNA(Power等人，細胞因子(Cytokine)7，479-482，1995)。用5μg poly A RNA、引物 5′TGAATGAGACGGTCAGTTCAGC 3′(20μM)、dNTP(1mM)、RNAsin(40U)、1×AMV緩沖液和20U AMV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄(30μl)，45℃，20分鐘，然后52℃，20分鐘。反應(yīng)混合液用2μl6N NaOH于65℃處理30分鐘，用2μl6N乙酸中和，Centricon 30(Amicon)濃縮。根據(jù)Aptes和Siebert的方法(生物技術(shù)(BioTechniques)15890-893，1993)將錨連接至第一鏈DNA。用與錨互補的引物和引物5′TTGTACAGAGCAAATTGGTC 3′(35個循環(huán)，55℃)，然后用引物5′GACCAGAGGCTTCCGTTCTG 3′(30個循環(huán)，53℃)進行巢式PCR。通過瓊脂糖電泳將最高的條帶(350bp)與較低的條帶分離開，亞克隆至BlueScript，測序。
實施例6制備抗GPVIFab和F(ab′)2-用兔產(chǎn)生抗人GPVI多克隆抗血清。來自兔抗-GPVI抗血清的IgG如所述純化。根據(jù)供應(yīng)商提供的標準方法，用固定化木瓜蛋白酶(Pierce)消化IgG，產(chǎn)生Fab片段。用固定化蛋白質(zhì)A(Sigma)柱將Fab片段與未被消化的IgG和Fc片段分離。流出物轉(zhuǎn)移至透析管，用固體聚乙二醇20,000濃縮，用20mMHepes、140mM NaCl、4mM KCl，pH7.4充分透析，并且在使用前貯存在4℃。用胃蛋白酶消化IgG制備F(ab′)2片段，酶與底物比例(w/w)為1∶50，用0.5M乙酸鹽緩沖液，pH4.0，37℃反應(yīng)18小時。用稀釋的NaOH校正pH至7.4。樣品用20mM磷酸鹽緩沖液(pH7.4)透析。用蛋白質(zhì)A層析法將F(ab′)2片段與未被消化的IgG和Fc片段分離。流出物轉(zhuǎn)移至透析管，用固體聚乙二醇20,000濃縮，用20mM Hepes、140mM NaCl、4mM KCl，pH7.4充分透析，并且分裝，貯存在-20℃。洗過的血小板用Triton X-114裂解，對可溶物質(zhì)進行相的分離，然后如前所述用麥胚凝集素-Sepharose 4B親和層析，分離與Triton X-114相結(jié)合的膜糖蛋白質(zhì)。由于GPVI代表血小板膜糖蛋白庫的很小一部分，我們使用了蛇C-型凝集素convulxin的特異性分離這個受體。偶聯(lián)Sepharose 4B的Convulxin親和層析產(chǎn)生的主要產(chǎn)物為65kDa蛋白質(zhì)。但是，較高和較低Mr的未表征的物質(zhì)與GPVI共洗脫下來，不能通過對柱的充分洗脫而去除。加入用8.5％聚丙烯酰胺的制備型凝膠電泳步驟作為純化的最后一步。合并含有GPVI的級分，再次分析顯示單一條帶。測試純化的GPVI阻斷血小板通過膠原的聚集能力。將等份的GPVI溶液加入血小板懸液，可觀察到輕微的抑制效應(yīng)。但在向血小板懸液加入該混合物前，將GPVI與膠原預(yù)孵育，則可以劑量依賴方式抑制凝集。當加入新鮮的膠原時，這些血小板仍然聚集。在非還原條件下，分離的蛋白質(zhì)具有62kDa的分子量(Mr)，在還原條件下，向稍微高的分子量(65kDa)移動。由于發(fā)現(xiàn)GPVI的氨基末端被封閉，用酶LysC和LysC/AspN消化該蛋白質(zhì)分別產(chǎn)生4和6肽，從中可獲得序列。在C4柱上用反向HPLC分離這些肽，用Edman法測序。這些肽的氨基酸序列在翻譯的cDNA序列中被下劃線(圖1)。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>重組血小板膠原受體糖蛋白VI及其藥用<130>GlycoproteinVI-Merck<140><141><160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1249<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(26)..(85)<223>Leader sequence<220><221>CDS<222>(86)..(1042)<223>mature GPVI protein<400>1gagctcagga cagggctgag gaacc atg tct cca tcc ccg acc gcc ctc ttc 52Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe1 5tgt ctt ggg ctg tgt ctg ggg cgt gtg cca gcg cag agt gga ccg ctc 100Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly Arg Val Pro Ala Gln Ser Gly Pro Leu10 15 20 25ccc aag ccc tcc ctc cag gct ctg ccc agc tcc ctg gtg ccc ctg gag 148Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser Leu Val Pro Leu Glu30 35 40aag cca gtg acc ctc cgg tgc cag gga cct ccg ggc gtg gac ctg tac 196Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro Gly Val Asp Leu Tyr45 50 55cgc ctg gag aag ctg agt tcc agc agg tac cag gat cag gca gtc ctc 244Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln Asp Gln Ala Val Leu60 65 70ttc atc ccg gcc atg aag aga agt ctg gct gga cgc tac cgc tgc tcc 292Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Ser75 80 85tac cag aac gga agc ctc tgg tcc ctg ccc agc gac cag ctg gag ctc 340Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Gln Leu Glu Leu90 95 100 105gtt gcc acg gga gtt ttt gcc aaa ccc tcg ctc tca gcc cag ccc ggc 388Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu Ser Ala Gln Pro Gly110 115 120ccg gcg gtg tcg tca gga ggg gac gta acc cta cag tgt cag act cgg 436Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu Gln Cys Gln Thr Arg125 130 135tat ggc ttt gac caa ttt gct ctg tac aag gaa ggg gac cct gcg ccc 484Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu Gly Asp Pro Ala Pro140 145 150tac aag aat ccc gag aga tgg tac cgg gct agt ttc ccc atc atc acg 532Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser Phe Pro Ile Ile Thr155 160 165gtg acc gcc gcc cac agc gga acc tac cga tgc tac agc ttc tcc agc 580Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Phe Ser Ser170 175 180 185agg gac cca tac ctg tgg tcg gcc ccc agc gac ccc ctg gag ctt gtg 628Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val190 195 200gtc aca gga acc tct gtg acc ccc agc cgg tta cca aca gaa cca cct 676Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu Pro Thr Glu Pro Pro205 210 215tcc tcg gta gca gaa ttc tca gaa gcc acc gct gaa ctg acc gtc tca 724Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala Glu Leu Thr Val Ser220 225 230ttc aca aac aaa gtc ttc aca act gag act tct agg agt atc acc acc 772Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser Arg Ser Ile Thr Thr235 240 245agt cca aag gag tca gac tct cca gct ggt cct gcc cgc cag tac tac 820Set Pro Lys Glu Set Asp Set Pro Ala Gly Pro Ala Arg Gln Tyr Tyr250 255 260 265acc aag ggc aac ctg gtc cgg ata tgc ctc ggg gct gtg atc cta ata 868Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys Leu Gly Ala Val Ile Leu Ile270 275 280atc ctg gcg ggg ttt ctg gca gag gac tgg cac agc cgg agg aag cgc 916Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp Trp His Set Arg Arg Lys Arg285 290 295ctg cgg cac agg ggc agg gct gtg cag agg ccg ctt ccg ccc ctg ccg 964Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln Arg Pro Leu Pro Pro Leu Pro300 305 310ccc ctc ccg cag acc cgg aaa tca cac ggg ggt cag gat gga ggc cga 1012Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys Set His Gly Gly Gln Asp Gly Gly Arg315 320 325cag gat gtt cac agc cgc ggg tta tgt tca tgaccgctga accccaggca1062Gln Asp Val His Set Arg Gly Leu Cys Set330 335cggtcgtatc caagggaggg atcatggcat gggaggcgac tcaaagactg gcgtgtgtgg 1122agcgtggaag caggagggca gaggctacag ctgtggaaac gaggccatgc tgcctcctcc 1182tggtgttcca tcagggagcc gttcggccag tgtctgtctg tctgtctgcc tctctgtctg 1242agggcac 1249<210>2<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Ser Pro Ser Pro Thr Ala Leu Phe Cys Leu Gly Leu Cys Leu Gly1 5 10 15Arg Val Pro Ala20<210>3<211>319<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gln Ser Gly Pro Leu Pro Lys Pro Ser Leu Gln Ala Leu Pro Ser Ser1 5 10 15Leu Val Pro Leu Glu Lys Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Pro Pro20 25 30Gly Val Asp Leu Tyr Arg Leu Glu Lys Leu Ser Ser Ser Arg Tyr Gln35 40 45Asp Gln Ala Val Leu Phe Ile Pro Ala Met Lys Arg Ser Leu Ala Gly50 55 60Arg Tyr Arg Cys Ser Tyr Gln Asn Gly Ser Leu Trp Ser Leu Pro Ser65 70 75 80Asp Gln Leu Glu Leu Val Ala Thr Gly Val Phe Ala Lys Pro Ser Leu85 90 95Ser Ala Gln Pro Gly Pro Ala Val Ser Ser Gly Gly Asp Val Thr Leu100 105 110Gln Cys Gln Thr Arg Tyr Gly Phe Asp Gln Phe Ala Leu Tyr Lys Glu115 120 125Gly Asp Pro Ala Pro Tyr Lys Asn Pro Glu Arg Trp Tyr Arg Ala Ser130 135 140Phe Pro Ile Ile Thr Val Thr Ala Ala His Ser Gly Thr Tyr Arg Cys145 150 155 160Tyr Ser Phe Ser Ser Arg Asp Pro Tyr Leu Trp Ser Ala Pro Ser Asp165 170 175Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Thr Ser Val Thr Pro Ser Arg Leu180 185 190Pro Thr Glu Pro Pro Ser Ser Val Ala Glu Phe Ser Glu Ala Thr Ala195 200 205Glu Leu Thr Val Ser Phe Thr Asn Lys Val Phe Thr Thr Glu Thr Ser210 215 220Arg Ser Ile Thr Thr Ser Pro Lys Glu Ser Asp Ser Pro Ala Gly Pro225 230 235 240Ala Arg Gln Tyr Tyr Thr Lys Gly Asn Leu Val Arg Ile Cys Leu Gly245 250 255Ala Val Ile Leu Ile Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ala Glu Asp Trp His260 265 270Ser Arg Arg Lys Arg Leu Arg His Arg Gly Arg Ala Val Gln Arg Pro275 280 285Leu Pro Pro Leu Pro Pro Leu Pro Gln Thr Arg Lys Ser His Gly Gly290 295 300Gln Asp Gly Gly Arg Gln Asp Val His Ser Arg Gly Leu Cys Ser305 310 315<160>權(quán)利要求
1.DNA，其編碼糖蛋白VI或其生物活性片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的DNA，其包含部分或全部圖2的序列。
3.DNA，其具有圖2序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的DNA，其編碼包含圖1a和1b氨基酸序列的糖蛋白VI。
5.作為藥物的重組人糖蛋白VI，其包含圖1b的氨基酸序列。
6.藥物組合物，其包含權(quán)利要求5的蛋白質(zhì)及制藥學(xué)可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
7.藥物組合物，其額外地包含藥學(xué)活性化合物。
8.重組GPVI的用途，其用于檢測血小板-膠原相互作用的特異性抑制劑的篩選工具中。
9.重組GPVI用于制造藥物的用途，所述藥物用在血栓和心血管疾病以及與血小板-膠原相互作用相關(guān)的紊亂的治療領(lǐng)域中。
10.GPVI之改變的用途，其作為血小板年齡和與血栓性和心血管疾病或事件相關(guān)的血小板的標記。
全文摘要
本發(fā)明涉及糖蛋白VI(GPVI)、其分離、純化以及重組生產(chǎn)的方法。特別是,本發(fā)明涉及GPVI,優(yōu)選地重組GPVI的用途,其用于治療與血液凝固紊亂(如血栓和心血管疾病)直接或間接相關(guān)的紊亂和病理事件。胞外重組蛋白質(zhì)也可用于建立篩選鑒定法,以找到膜結(jié)合GPVI潛在的抑制劑,目的在于分別抑制凝血細胞與膠原和血小板與膠原的結(jié)合。GPVI的變化可用于監(jiān)測血小板年齡以及暴露于血栓和心血管疾病的情況。
文檔編號G01N33/53GK1350583SQ00807292
公開日2002年5月22日 申請日期2000年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年5月7日
發(fā)明者K·J·克萊米特森 申請人:默克專利股份有限公司