4A)，pH 8. 0 (圖4B)，pH7. 5 (圖4C)和pH7. 0 (圖4D)的Tris緩沖液。這些數(shù)據(jù)表明，在pH8. 0 下通過CZE進行HNS分離得到較好的電荷分離，且可分辨的同工型峰的數(shù)量最大。這些數(shù) 據(jù)還表明，對于人類HNS，幾乎完全沒有分離，因為在pH7. 0左右達到堿性較強的同工型的 pi(圖 4D)
[0214] 基于這些初步發(fā)現(xiàn)，進行另外的研究以評估在HNS表征期間pH較小變化的CZE測 定容忍度。使用與如上所述相同的CZE條件，使用平衡至7. 89、8. 0或8. 11的pH的25mM Tris緩沖液通過CZE來分析純化的重組HNS蛋白質(zhì)（圖5B)。如所示，pH8. 0左右的較小 波動仍然產(chǎn)生穩(wěn)定的峰分離（圖5B)以及14個不同電荷同工型的明顯解析（圖5A)。所述 數(shù)據(jù)強烈表明，使用CZE來確定HNS電荷分布是既穩(wěn)定又靈敏的方法。此外，這些發(fā)現(xiàn)還表 明，在25mMTris緩沖液中至少7. 89-8. 11的pH范圍可以用于人類HNS的CZE表征。
[0215] 毛細管組成和長度對峰分離的影響
[0216] 為確定毛細管組成和長度對HNS峰分離的影響，使用如上所述的純化的重組HNS 蛋白質(zhì)，在裝備有光電二極管陣列檢測器和來自AgilentTechnologies(Wilmington，DE， USA)的ChemStation軟件的Agilent? 7100儀器上進行CZE。長度為72或104cm的聚乙 烯醇（PVA)或裸露熔融石英毛細管柱（104cmx50ymid)用1.ONNaOH沖洗1小時，水沖 洗5分鐘，并且然后用pH8. 0的25mMTris沖洗10分鐘。通過在50mbar壓力下加壓注射 2sec將樣品引入毛細管的陽極末端。電壓為+30kV，產(chǎn)生約8iiA的電流。毛細管溫度為 30C。檢測波長為200nm且?guī)?nm。不使用參考波長。以<0.006min(0.062sec響應(yīng)時 間）（40Hz)的峰寬收集數(shù)據(jù)。注射之間，毛細管用水沖洗0. 5min，用0.INNaOH沖洗3min， 并且用水沖洗0. 5min。
[0217] 初步實驗顯示，與裸露熔融石英毛細管柱不同，聚乙烯醇（PVA)涂布的毛細管柱 導(dǎo)致14個個別電荷同工型中的每一個的分離水平降低和解析度較差。表明，分離由于蛋白 質(zhì)和管柱的PVA涂層之間的相互作用而延遲，表明對于人類HNS糖形分離，帶負電荷的蛋白 質(zhì)和毛細管壁之間的斥力可能對于最佳分離是必不可少的。通常最好使用短的毛細管柱并 且優(yōu)化緩沖液和緩沖添加劑。對于HNS，這種做法是不可能的。因此，評估毛細管長度以幫 助優(yōu)化HNS同工型分離。采用在儀器卡匣中適配的毛細管的最長長度104cm。盡管毛細管 長度較長，但是由于穩(wěn)定的電滲流（E0F)，分離在16min內(nèi)完成。圖6示出在72cm和104cm 毛細管上的分離之間的歸一化比較。雖然操作時間從約6min增加至14min，但是較長的毛 細管上解析度提高，盡管場強度降低。
[0218] 實施例3.可重復(fù)件和精確度
[0219] 對于本實施例，檢查上述CZE方法在表征HNS時的可重復(fù)性和精確度，以評估產(chǎn)品 開發(fā)過程中其用于定量分析和表征重組HNS的天然電荷的異質(zhì)性的可能性。對于本實施 例，通過測量CZE性能（作為迀移時間和相對峰面積的函數(shù)）和本方法分辨重組HNS的相 似和不同制造小批之間的糖形分布的細微變化的能力來測定可重復(fù)性和精確度。
[0220] 使用重組人類HNS的共同制造小批（小批A)，評估相對峰面積和迀移時間的試驗 間和日間重復(fù)性。三重復(fù)試驗的試驗間重復(fù)性如圖8所示。因為不管通過時間，有必要比 較不同批次的糖形群體，所以計算來自為期四個月的7個三重復(fù)獨立測量操作的相對和絕 對迀移時間（圖9)，并顯示在表4中。
[0221] 表4.相對和絕對迀移時間
[0222]
[0223] MT(迀移時間）；RMT(相對迀移時間）
[0224] 雖然絕對迀移時間（tj均小于或等于1 %，但是優(yōu)選相對迀移時間（RMT) (tyt^) 作為報告的參數(shù)。由于峰寬度窄，并且迀移時間相差只有約l〇sec，因此RMT更好的保證正 確的峰識別。RMT在0. 3-0. 5%的范圍內(nèi)。相對峰面積（峰面積百分比）的精確度示于表 3中。相對面積的相對標準偏差（RSD)對于同工型3-12為0. 6%至2. 8%，對于同工型1 和2為4.0%至5%，以及對于同工型13和14為7. 4%至23. 2%。數(shù)據(jù)表明同工型1-2和 13-14的較高的RSD百分比可能是由于其較低的相對面積。還通過繪制14個HNS同工型中 的每一個的總峰面積％對數(shù)據(jù)進行評價，對于日間比較數(shù)據(jù)，還進行計算并顯示在表5中。 圖9顯示在四個月時間內(nèi)，總峰面積或14個同工型中的每一個幾乎沒有變化。總之，這些 數(shù)據(jù)有力地表明，按照上述方法和條件使用CZE，可以用來以精確的和可再現(xiàn)的方式準確地 表征HNS糖形。
[0225] 表5.相對峰面積（％ )的精確度
[0226]
[0227] a根據(jù)n= 7分析來計算RSD。在4個月的時間內(nèi)，每個分析都在不同的日子進行。 大多數(shù)分析使用新鮮的緩沖液制劑，并在3種不同的毛細管中進行。
[0228]實施例4.用于鑒宙制誥奪化的HNS的CZE表征
[0229] 還進行研究以評估用于使用CZE來進行定量HNS表征的方法，如在人類重組HNS 制造期間鑒定糖形和非均質(zhì)的天然電荷結(jié)構(gòu)。定量、可再現(xiàn)的表征數(shù)據(jù)的產(chǎn)生可用于監(jiān)測 /優(yōu)化生產(chǎn)方法，以及根據(jù)FDA指導(dǎo)方針來規(guī)范商業(yè)產(chǎn)品的生產(chǎn)。
[0230] 小批間變化的表征
[0231] 對于本實施例，研究上述的CZE方法用于表征HNS，以評估其用于定量分析和表征 同一制造過程的不同小批之間重組HNS的天然電荷異質(zhì)性的可能性。
[0232] 純化的重組HNS酶使用相同的下游制造過程在兩個獨立的制造操作中產(chǎn)生。在 裝備有光電二極管陣列檢測器和來自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的 ChemStation軟件的Agilent?7100儀器上進行毛細管區(qū)帶電泳。裸露恪融石英毛細管柱 (104cmx50ymid，L= 104cm)用1.ONNaOH沖洗1小時，用水沖洗5分鐘，并且然后用平 衡至pH8. 0的25mMTris緩沖液沖洗10分鐘。通過在50mbar壓力下加壓注射2sec將樣 品引入毛細管的陽極末端。電壓為+30kV，產(chǎn)生約8iiA的電流。毛細管溫度為30°C。檢測 波長為200nm且?guī)?nm。不使用參考波長。以〈0? 006min(0. 062sec響應(yīng)時間）（40Hz) 峰寬收集數(shù)據(jù)。注射之間，毛細管用水沖洗〇. 5min，用0.INNaOH沖洗3min，并且用水沖洗 0. 5min〇
[0233] 圖10A示出每個制造小批的覆蓋電泳圖（小批1和小批2)。數(shù)據(jù)表明，雖然相同 數(shù)量的天然電荷同工型峰存在于這兩個制造小批中，但是峰分布或"制造足跡"中存在細微 差異。通過計算每個制造小批的相對峰面積（表示為總面積百分比）進一步描繪這些差異 (圖10B)。比較小批1和小批2的相對峰面積數(shù)據(jù)以表征參考小批189 (圖7)，并顯示在表 6中。
[0234] 表6?不同HNS小批的相對峰面積（％ )的比較
[0235]
[0236]
[0237] 參考小批（HNS制造小批189)、小批1和2 (使用相同下游純化產(chǎn)生的人類重組HNS 的兩個不同制造小批）
[0238] 通過使用IEF-SDSPAGE和CZE檢查獨立的HNS小批的電荷同工型檢測水平的差 異來測試使用CZE進行HNS表征的分析能力。對于所述實驗，測試四個不同的HNS制造小 批，每個小批是使用相同的下游純化方法來制造的。在裝備有光電二極管陣列檢測器和來 自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation軟件的Agilent? 7100 儀器上進行毛細管區(qū)帶電泳。裸露恪融石英毛細管柱（104cmx50ymid，L= 104cm)用 1.ONNaOH沖洗1小時，用水沖洗5分鐘，并且然后用平衡至pH8. 0的25mMTris緩沖液沖 洗10分鐘。通過在50mbar壓力下加壓注射2sec將樣品引入毛細管的陽極末端。電壓為 +30kV，產(chǎn)生約8yA的電流。毛細管溫度為30°C。檢測波長為200nm且?guī)?nm。不使 用參考波長。以〈〇. 〇〇6min(0. 062sec響應(yīng)時間）（40Hz)峰寬收集數(shù)據(jù)。注射之間，毛細管 用水沖洗0. 5min，用0.INNaOH沖洗3min，并且用水沖洗0. 5min。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的標準分子生物學(xué)技術(shù)進行IEF-SDSPAGE。
[0239] 圖11示出與表征過的HNS制造參考標準（RS)相比較的每個制造小批的覆蓋電泳 圖（小批1、2、3和4)。數(shù)據(jù)表明，雖然相同數(shù)量的天然電荷同工型峰存在于這兩個制造小 批中，但是峰分布或"制造足跡"方面存在差異。通過計算每個制造小批的相對峰面積（表 示為總面積百分比）進一步定量確定這些差異并且在表7中示出。
[0240] 表7?不同HNS小批的相對峰面積（％ )的比較
[0241]
[0242]
[0243]HNSRS(HNS制造小批189)、小批1、2、3和4(使用相同下游純化產(chǎn)生的人類重組 HNS的四個不同制造小批）
[0244] 使用標準IEF-SDSPAGE未觀察到使用CZE顯示的HNS天然電荷分布的差異，標準 IEF-SDSPAGE測定的解析度較差并且具有主觀性（數(shù)據(jù)未顯示）。總之，這些數(shù)據(jù)表明在 HNS表征中使用CZE允許制造小批之間的差異精確量化。因此，這強烈表明，鑒于在表征HNS 電荷同工型時CZE的峰分離和解析度特性，所述方法能夠辨別非均質(zhì)HNS群體中的在其它 的分析方法中可能不會容易地辨別出的細微差異。
[0245] 在制造階段過程中的HNS表征
[0246] 還檢測同一制造過程的不同階段過程中測定HNS天然電荷同工型的變化的能力。 純化的重組HNS酶在兩個獨立的制造操作中產(chǎn)生。在下游純化開始前和在制造過程完成時 收集樣品。在裝備有光電二極管陣列檢測器和來自AgilentTechnologies(Wilmington， DE，USA)的ChemStation軟件的Agilent? 7100儀器上進行毛細管區(qū)帶電泳。裸露恪融石 英毛細管柱（104cmx50ymid，L= 104cm)用1.ONNaOH沖洗1小時，用水沖洗5分鐘， 并且然后用平衡至pH8. 0的25mMTris緩沖液沖洗10分鐘。通過在50mbar壓力下加壓 注射2sec將樣品引入毛細管的陽極末端。電壓為+30kV，產(chǎn)生約8iiA的電流。毛細管溫度 為30°C。檢測波長為200nm且?guī)?nm。不使用參考波長。以<0.006min(0.062sec響應(yīng) 時間）（40Hz)峰寬收集數(shù)據(jù)。注射之間，毛細管用水沖洗0. 5min，用0.INNaOH沖洗3min， 并且用水沖洗0. 5min。
[0247] 圖12A和B示出在下游純化之前（A)及之后⑶的制造小批的覆蓋電泳圖（小批 1和小批2)。數(shù)據(jù)表明制造過程的不同階段過程中的HNS的天然電荷分布的差異。這表明 CZE可以用于監(jiān)測制造期間和最終產(chǎn)品中的HNS異質(zhì)性的變化。這還表明，CZE作為功能性 讀數(shù)，其可用于優(yōu)化和改進制造步驟以控制成品的HNS電荷分布。
[0248] 由不同制造過程產(chǎn)生的HNS的表征
[0249] 還檢測與不同制造過程相關(guān)聯(lián)的電荷分布的差異。對于本實驗，使用兩種不同的 下游制造過程來生產(chǎn)純化的重組HNS酶，其中使用替代緩沖組合物。在裝備有光電二極管 陣列檢測器和來自AgilentTechnologies(Wilmington，DE，USA)的ChemStation軟件的 Agilent?7100儀器上進行毛細管區(qū)帶電泳。裸露恪融石英毛細管柱（104cmx50ymid，L =104cm)用1.ONNaOH沖洗1小時，用水沖洗5分鐘，并且然后用平衡至pH8. 0的25mM Tris緩沖液沖洗10分鐘。通過在50mbar壓力下加壓注射2sec將樣品引入毛細管的陽極 末端。電壓為+30kV，產(chǎn)生約8yA的電流。毛細管溫度為30°C。檢測波長為200nm且?guī)?為8nm。不使用參考波長。以〈0. 006min(0. 062sec響應(yīng)時間）（40Hz)峰寬收集數(shù)據(jù)。注射 之間，毛細管用水沖洗0. 5min，用0.INNaOH沖洗3min，并且用水沖洗0. 5min。
[0250] 圖13A示出每個制造的HNS樣品的覆蓋電泳圖（制造方法# 1和制造方法#2)。數(shù) 據(jù)表明，HNS制造過程中較小偏差會導(dǎo)致天然電荷分布的可觀察到的差異。具體來說，制造 方法1產(chǎn)生不同的同工型群體，在圖13A中具有兩個額外的負電荷峰（表示為"X"和"Y"）； 并且當根據(jù)計算出的相對峰面積（表示為總面積百分比）繪制時在圖13B中作為"pkx"和 "pky"。通過比較每個不同的制造樣品（Man.Pro. 1和Man.Pro. 2)的計算相對峰面積來表 達這些可量化的差異，以表征參考制造小批189 (圖7)，并顯示在表8中。
[0251] 表8.由不同制造過程產(chǎn)生的HNS的相對峰面積（％ )的比較
[0252]
[0253] 參考制造過程（Ref.Man.)、制造過程#1 (Man.Pro. 1)和制造過程#2 (Man.Pro. 2)
[0254]實施例5.重組HNS的聚糖分布
[0255] 為確定觀察到的電荷異質(zhì)性的基礎(chǔ)是否歸因于糖基化，對分別使用釋放唾液酸和 磷酸的酶神經(jīng)氨酸酶和/或磷酸酶預(yù)處理的樣品進行CZE(圖14)。用兩種酶的組合進行處 理顯著減少電泳圖的復(fù)雜性，其中主峰和若干次要峰都迀移接近EOF標志物，預(yù)計這是歸 因于負電荷的去除。
[0256] 接下來，產(chǎn)生重組HNS的簡要聚糖圖。對于本實驗，在0. 5 %SDS存在下在100°C下 使HNS蛋白質(zhì)變性3-4min，隨后用N-糖苷酶F(prozyme，SanLeandro,CA)使聚糖酶促釋 放。將HNS樣品在0. 9%NP40存在下在37°C下與N-糖苷酶F(30mU/3yL) -起孵育4-6h， 隨后第二次加入N-糖苷酶F，并且再在37°C下孵育17-19h。使用裝備有CarboPacPA-1保 護柱的CarboPacPA-1分析柱（Dionex，Sunnyvale，CA)通過高效陰離子交換色譜連同脈沖 電流檢測（HPAE-PAD)來進行釋放聚糖的分離。將聚糖于12mM乙酸鈉/100mMNaOH中施加 到管柱，隨后用45min內(nèi)lOOmMNaOH中12-300mM的乙酸鈉梯度（6. 4mM/min)洗脫。使用 lmL/min的流速，并且管柱為環(huán)境室溫。聚糖以電荷特征遞增的順序洗脫，并且分類為七個 不同的峰群。對于人類重組HNS，峰群1由所有不帶電荷的聚糖組成，并且峰群2、3和5分 別由單唾液酸化、雙唾液酸化和三唾液酸化聚糖組成。存在于峰群4和7中的碳水化合物 結(jié)構(gòu)分別是具有單M6P基團和雙M6P基團的聚糖。峰群6由含有唾液酸和M6P兩者的混合 聚糖組成。在聚糖圖中另外的較小峰的存在可能是由于唾液酸和/或磷酸殘基的不完全去 除。這些研究結(jié)果強烈表明，通過CZE所看到的天然電荷異質(zhì)性的基礎(chǔ)是由于唾液酸和M6P 含量的差異。
[0257] 還進行實驗以評估使用不同的制造方法生產(chǎn)的HNS的兩個不同小批，所述實驗先 前顯示具有不同的天然電荷同工型分布（圖15A)。對于本實驗，進行聚糖分析以確認觀察 到的電荷同工型分布的差異是由于唾液酸和M6P含量的差異。對于本實驗，在0. 5%SDS存 在下在100°C下使來自兩個不同制造過程（過程#1和過程#2)的HNS蛋白質(zhì)變性3-4min， 隨后用N-糖苷酶F(Prozyme，SanLeandro,CA)進行聚糖的酶促釋放。在0. 9%NP40存在 下將HNS樣品與N-糖苷酶F(30mU/3yL)在37°C下一起孵育4-6h，隨后第二次加入N-糖苷 酶F，并且再在37°C下孵育17-19h。使用裝備有CarboPacPA-1保護柱的CarboPacPA-1 分析柱（Dionex，Sunnyvale，CA)，通過高效陰離子交換色譜連同脈沖電流檢測（HPAE-PAD) 來進行釋放聚糖的分離。聚糖于12mM乙酸鈉/lOOmMNaOH中施加到管柱，隨后用45分鐘 內(nèi)lOOmMNaOH中12-300mM的乙酸鈉梯度（6. 4mM/min)洗脫。使用lmL/min的流速，并且 管柱為環(huán)境室溫。圖15表明，在酶促消化后觀察到的同工型電荷分布（圖15B、C和D)對 于過程1和過程2樣品兩者是相似的。這表明，通過CZE所看到的在初始天然電荷同工型 分布中觀察到的任何變化是由于唾液酸和M6P含量的差異。
【主權(quán)項】
1. 一種分析乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)蛋白質(zhì)的方法，其包括通過毛細管區(qū)帶電泳來 表征HNS蛋白質(zhì)的電荷分布。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表征步驟包括通過毛細管區(qū)帶電泳分離指示電 荷變體不存在或存在的峰群的步驟。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述電荷分布包括至少14個峰群。4. 如權(quán)利要求2或3所述的方法，其中所述電荷變體與改變量的唾液酸和/或M6P基 團的不存在、存在相關(guān)聯(lián)。5. 如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述電荷變體與改變量的單唾液酸化、雙唾液酸化、 三唾液酸化聚糖、單M6P、雙M6P基團及其組合的不存在、存在相關(guān)聯(lián)。6. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述表征步驟包括定量地確定每個峰群 的相對迀移時間和/或相對峰面積。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其中每個峰群的所述相對迀移時間是相對于電滲流 (EOF)標志物來確定的。8. 如權(quán)利要求6或7所述的方法，其中通過與總峰面積比較的峰面積百分比來計算每 個峰群的所述相對峰面積。9. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法還包括確定所述HNS蛋白質(zhì)的 質(zhì)量。10. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述HNS蛋白質(zhì)是由哺乳動物細胞產(chǎn) 生。11. 如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述哺乳動物細胞是人類細胞。12. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述HNS蛋白質(zhì)是大規(guī)模生產(chǎn)。13. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述方法包括與參照相比，確定所述 HNS蛋白質(zhì)的電荷分布是否存在變化。14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述參照是由不同批次生產(chǎn)的HNS蛋白質(zhì)的電荷 分布。15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述方法還包括評估批次間電荷變化性的步驟。16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其中所述評估批次間電荷變化性的步驟包括比較每個 由不同批次生產(chǎn)的HNS蛋白質(zhì)的相對峰面積相對于峰群的趨勢圖。17. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述毛細管區(qū)帶電泳是在使得較長的 迀移時間對應(yīng)于增加負電荷的物質(zhì)的條件下進行。18. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中使用包含Tris的緩沖系統(tǒng)進行所述毛 細管區(qū)帶電泳。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述緩沖系統(tǒng)包含濃度在約20-30mM范圍內(nèi)的 Tris020. 如權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述緩沖系統(tǒng)包含濃度為約25mM的Tris。21. 如權(quán)利要求18-20中任一項所述的方法，其中所述緩沖系統(tǒng)具有在約7. 8-8. 2范圍 內(nèi)的pH。22. 如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述緩沖系統(tǒng)具有約8的pH。23. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中使用長度在56-112. 5cm之間的范圍內(nèi) 的毛細管進行所述毛細管區(qū)帶電泳。24. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其中所述毛細管具有約72cm或104cm的有 效長度。25. -種制造方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項所述的方法通過毛細管區(qū)帶電 泳分析大規(guī)模制造的乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)蛋白質(zhì)的步驟。26. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述制造方法包括基于所述電荷分布的分析來調(diào) 節(jié)制造條件的步驟。27. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述分析步驟在釋放一定批量之前進行。28. -種藥物組合物，其包含基本上純的乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)蛋白質(zhì)，所述基本 上純的乙酰肝素N-硫酸酯酶（HNS)蛋白質(zhì)如通過毛細管區(qū)帶電泳所確定表征為電荷分布 包括至少14個指示所述HNS蛋白質(zhì)的電荷變體的峰群。29. 如權(quán)利要求28所述的藥物組合物，其中所述HNS蛋白質(zhì)的所述電荷變體與改變量 的唾液酸和/或M6P基團的不存在、存在相關(guān)聯(lián)。30. 如權(quán)利要求29所述的藥物組合物，其中所述電荷變體與改變量的單唾液酸化、雙 唾液酸化、三唾液酸化聚糖、單M6P、雙M6P基團及其組合的不存在、存在相關(guān)聯(lián)。31. 如權(quán)利要求28-30中任一項所述的藥物組合物，其中所述HNS蛋白質(zhì)是由哺乳動物 細胞產(chǎn)生。32. 如權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其中所述哺乳動物細胞是人類細胞。33. 如權(quán)利要求28-32中任一項所述的藥物組合物，其中所述HNS蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO: 1至少70%相同的氨基酸序列34. 如權(quán)利要求28-33中任一項所述的藥物組合物，其中所述HNS蛋白質(zhì)具有與SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。35. 如權(quán)利要求28-34中任一項所述的藥物組合物，其中使用包含濃度在約20-30mM范 圍內(nèi)的Tris以及pH在約7. 5-8. 5范圍內(nèi)的緩沖系統(tǒng)進行所述毛細管區(qū)帶電泳。36. 如權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其中所述緩沖系統(tǒng)包含濃度為約25mM的Tris， 并且具有約8. 0的pH。37. -種治療A型圣菲力浦綜合征的方法，其包括向需要治療的受試者施用如權(quán)利要 求28-36中任一項所述的藥物組合物的步驟。
【專利摘要】本發(fā)明特別提供用于在制造期間表征重組乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的方法。本發(fā)明使用毛細管區(qū)帶電泳來確定重組HNS的電荷分布、同工型分布和/或聚糖分布；并且代表酶的批次一致性、儲存穩(wěn)定性、生物半衰期、藥代動力學(xué)、藥效學(xué)和生物活性的質(zhì)量特征。特別是，這種表征方法可能有利于優(yōu)化條件并且確保用于使用酶替代療法治療診斷為圣菲力浦綜合征的患者的HNS的制造一致性。
【IPC分類】C12N9/24, C07K1/26
【公開號】CN105051056
【申請?zhí)枴緾N201480013609
【發(fā)明人】D·S·羅斯曼
【申請人】夏爾人類遺傳性治療公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2014年3月13日
【公告號】CA2902629A1, US20140294800, WO2014160456A1