一種金屬絡合物用作自噬溶酶體標記物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種金屬絡合物作為標記物檢測自噬溶酶體的方法。此發(fā)明制得的金屬化合物可用為自噬溶酶體標記物，用于檢測自噬過程、藥物篩選、細胞實驗和組織成像等。
【專利說明】一種金屬絡合物用作自噬溶酶體標記物

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測試劑領域，是一種用于檢測自噬溶酶體的標記物。

【背景技術】
[0002] 本發(fā)明涉及一種由有機化合物配體與金屬離子組成的絡合物及其作為自噬溶酶 體標記物。此發(fā)明制得的金屬化合物可作為自噬溶酶體標記物，用于檢測自噬過程，特別是 關于溶酶體疾病，例如檢測和監(jiān)測溶酶體累積疾病進程、監(jiān)測藥物效果或用于治療疾?。淮?發(fā)明也是關于毒性篩選方法，特別是對于潛在藥物和可疑有毒物質的方法和高通量篩選； 也可以用于基于熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的實驗和組織成像。
[0003] 細胞自噬是哺乳動物細胞溶酶體降解的主要途徑，對維持細胞的自我平衡、發(fā)展 和能量平衡非常重要。細胞自噬過程的中斷與神經(jīng)退化性紊亂、癌癥、心臟病和感染等疾病 密切相關。通過研究細胞自噬及其復雜的分子誘導機制，探索自噬在細胞發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮 的作用，為疾病治療提供了新的途徑。通過調節(jié)細胞自噬活性的治療已經(jīng)成為當代腫瘤治 療和帕金森等疾病治療領域的新靶點和研究熱點。無論科研單位還是制藥公司對藥物誘導 細胞自噬在疾病治療中的應用表現(xiàn)出極大興趣，期望通過研究自噬和死亡的關系和分子機 理，進而利用細胞自噬的調節(jié)作用，使其在疾病治療中發(fā)揮作用。
[0004] 基于細胞的檢測由于它們的高生理的相關性，在制藥工業(yè)中越來越受歡迎。其它 優(yōu)點包括他們預測化合物的用途的能力，評估分子相互作用，確定毒性，區(qū)分細胞類型與特 異性藥物效果，并確定藥物滲透?；诩毎膶嶒炇鞘冀K相關的藥物發(fā)現(xiàn)渠道，因為它們能 夠提供從目標特性到毒理學終端階段的數(shù)據(jù)。當前行業(yè)發(fā)展趨勢要求，使用細胞實驗進行 藥物篩選時容易進行監(jiān)測，且能夠非侵入性的報道數(shù)據(jù)。對新藥開發(fā)而言，其根本途徑是提 高效率，降低成本，在更短的時間上市場。為早期階段失敗的化合物提供豐富的信息和準確 的數(shù)據(jù)對早期階段的決策是必需的。這些數(shù)據(jù)可能會來自篩選化合物的結果中，即篩選相 關的生態(tài)系統(tǒng)，而不是經(jīng)典生化分析。這些篩選系統(tǒng)通常整合在先進的成像平臺，如高通量 篩選（HCS)工作站。產(chǎn)業(yè)化熒光顯微鏡將導致高通量HCS影像平臺的發(fā)展。當加上熒光報 告技術，HCS提供了信息豐富的藥物篩選，以及新類型的藥物靶標。因此，開發(fā)一種快速有 效的自噬探針對于監(jiān)測細胞自噬過程和診斷相關疾病是非常必要的。
[0005] 熒光標記的抗體雖然適用于分析細胞表面和透化細胞，但因為它們難以透過細 胞，所以很少用于活細胞。近年來，發(fā)展可透過細胞的小分子熒光標記物逐漸興起?？山邮?的用于細胞成像和分析的小分子熒光標記物需要最低限度的干擾，通用、穩(wěn)定、易于使用、 非破壞性的成像設備檢測。從組織學的角度來看傳統(tǒng)標記物的一個問題是需要輔助因子或 需要固定或染色，僅在靜態(tài)的死細胞條件下給出結果。操作所需的額外的步驟可能是耗時 和昂貴的，并且在固定和染色的情況下缺乏生物學相關性。從分析來看，標記物應該能夠在 活細胞中能夠實時反應實驗結果。而對于藥物篩選而言，簡單易用是關鍵。
[0006] 雖然過往已有各種熒光標記物被報道用于活細胞分析，例如JC-1染料可以動態(tài) 的監(jiān)控線粒體膜電位的變化，但對于自噬溶酶體還缺乏滿意的標記物用于跟蹤細胞內(nèi)細胞 器的動態(tài)變化以及相關的藥物篩選。目前廣泛使用的自噬標記物是GFP-LC3,它是一種GFP 蛋白和LC3標記物的融合物。GFP-LC3作為自噬溶酶體熒光標記物，在自噬作用初期是非常 有效的。但由于其信號會隨著降解和酸度影響而逐漸減弱，所以無法用于自噬作用后期和 較長的時間段。而且，GFP-LC3存在聚合的問題，容易給出錯誤的信號。盡管目前也有一些 關于監(jiān)測自噬作用后期的熒光標記物的報道，但都不禁理想。
[0007] 對研究細胞內(nèi)的靶向分子與作用區(qū)域的相互作用，熒光合作局域化成像是一個功 能強大的方法。在這些實驗中，不同的熒光物和發(fā)光蛋白在特定的檢測通道成像。從每個 發(fā)光物給出的空間和濃度信息在每個通道中都可自由控制?，F(xiàn)有的很多用于亞細胞分析的 標記物都無法滿足這類要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供一種高效的熒光標記物，專用于檢測自噬作用后期和陽離子誘導的自 噬作用。這種標記物是一種小分子化合物，它不同于LC3這種大分子蛋白，不存在聚合問 題。它不受酸度影響，在檢測活體細胞和固定細胞時均能給出高靈敏的信號。而且，此標記 物可以被高穿透性的近紅外和長波長激發(fā)，對于監(jiān)測細胞非常重要。
[0009] 本發(fā)明還提供一種基于此標記物的自噬溶酶體檢測的方法，包括以下步驟：1)獲 得樣品細胞；2)連接標記物到細胞的自噬溶酶體；3)通過檢測標記物以監(jiān)測細胞自噬。此 方法可以運用在如下領域：1)實時監(jiān)測細胞自噬過程；2)檢測與自噬溶酶體相關的藥物的 作用效果；3)藥物篩選。
[0010] 本發(fā)明適合的應用涉及：熒光掃描顯微鏡、流式細胞儀、共聚焦顯微鏡、熒光分析 儀、基于微孔板的細胞技術、細胞微陣列分析、組織成像等。
[0011] 發(fā)明涉及熒光標記物的制備和應用，例如SN-1的制備方法和在細胞自噬溶酶體 檢測中的應用。這些標記物是一類小分子有機化合物，通常呈中性。它們的分子結構中包 含特定的元素，如N、0、S、P等非金屬元素以及Fe、Cu、Pt、Au、Zn、Ru、Os等過渡金屬和鑭系 金屬元素。在一定的條件下，這些非金屬元素會同金屬元素作用，形成特定的化學結構，即 通常所稱的金屬絡合物。特別是對于一些特定結構的有機化合物，其本身并無任何生物學 活性；只有與特定的金屬絡合后才表現(xiàn)出與自噬溶酶體的特異性作用，例如實施實例中的 化合物SN-1。這類包含特定金屬元素的化合物能夠選擇性的標記無論是固定細胞還是活細 胞中的自噬溶酶體，并且隨著時間和自噬溶酶體量的增加在細胞器內(nèi)逐漸累積。
[0012] 本發(fā)明提供的標記物包含以下結構：

【權利要求】
1. 一種使用金屬絡合物作為熒光標記物檢測自噬溶酶體的方法，該方法包括如下步 驟： 第一步、獲得樣品實驗所需的細胞； 第二步、連接熒光標記物到細胞器； 第三步、通過檢測熒光標記物以確定自噬溶酶體。
2. 根據(jù)權利要求1所述的熒光標記物，其結構式為：
其中札，R2，R3，R4，R5，R6，R 7，R8，各自獨立的選自氫、鹵素、取代的芳香族集團、取 代的雜芳香族基團、取代的芳基、取代的雜芳基或式（III)結構的取代基，凡，R2，R3，R 4， R5，R6，R7，R8，中至少一個為式（III)結構的取代基 ：
式（III)中Q為含有氮原子的基團，_為連接金屬化合物與Q的連接基團； 環(huán)A具有式（IV)、式（V)、式（VI)結構：
其中Rla，R2a，R3a，R4a，各自獨立的選自氫、鹵素、取代的芳香族集團、取代的雜芳香族 基團、取代的芳基、取代的雜芳基； 式（IV)中η為1?3的正整數(shù)； Υ 不存在，或 Υ 為鹵素、-N03、CH3C00-、CC13C00-、CF3C00-、C10 4-、BF4-、BPh4-、-CN、-ν3、 對甲基苯甲酸根、對甲基苯磺酸根、鄰硝基苯酚氧、對硝基苯酚氧、2, 4-二硝基苯酚氧、 3, 5_二硝基苯酌·氧、2, 4, 6_二硝基苯酌·氧、3, 5_二氣苯酌·氧、3, 5_二氣苯酌·氧、3, 5_二-二 氟甲基苯酚或五氟酚氧負離子； Μ為過渡金屬和鑭系金屬。
3. 根據(jù)權利要求1所述的細胞器，包括溶酶體、吞噬泡、自噬體、自噬溶酶體或它們的 組合。
4. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是作為藥物篩選的方法。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是作為檢測試劑用于細胞實驗、熒光共聚焦實 驗、高通量篩選、組織學實驗。
6. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征是制備檢測試劑盒。
【文檔編號】G01N21/64GK104152529SQ201310174229
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年5月13日 優(yōu)先權日:2013年5月13日
【發(fā)明者】武鵬 申請人:成都鑫諾醫(yī)藥科技有限公司