專利名稱：一種來源于羊草的與抗旱相關的關鍵酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，是關于一種與精胺和亞精胺合成有關的調節(jié)酶及其編 碼的基因與應用，尤其是涉及一種源于羊草并與干旱相關的SAMDC家族的關鍵酶及其編碼 基因，及該基因在培育抗旱農作物、生態(tài)林草及能源植物中的應用。
背景技術：
干旱是中國北方常見的自然災害，是影響植物生長和農作物產量的最主要的環(huán)境 因子，同時也嚴重影響了中國北方的草原生態(tài)環(huán)境。中國每年農作物受旱面積約3-4億畝， 損失糧食500-600億斤，干旱已成為我國農業(yè)生產的嚴重制約因素。因此，利用轉基因技術 改良作物的耐旱性，提高農作物和各種經濟植物對干旱的適應能力，是當前現(xiàn)代農業(yè)技術 領域的研究熱點，同時也是我國及世界農業(yè)亟需解決的重大課題。植物對干旱脅迫的抵抗 和忍耐能力稱為抗旱性，抗旱性是植物在長期演化過程中形成的對不良環(huán)境的適應性。多 年來，人們對植物響應干旱脅迫的機制進行了大量研究，積累了豐富的資料。隨著分子生物 學的發(fā)展，人們能夠在基因組成、表達調控及信號傳導等分子水平上認識植物對干旱的耐 逆性機理，為利用基因工程手段改良植物的抗旱性能提供了可靠的理論基礎和先進的技術 手段。由于植物抗旱機制的復雜性，利用傳統(tǒng)育種方法提高植物的抗旱性十分困難。轉 基因方法為植物抗旱育種提供了有效途徑，但高效抗旱基因的分離和功能驗證成為植物抗 旱基因工程的瓶頸因素。在精胺和亞精胺合成途徑中，SAMDC (硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶)是 一個關鍵酶，而精胺和亞精胺與植物的抗旱性密切相關。SAMDC酶活性的提高可導致植物體 內精胺和亞精胺含量增加，后者的升高能增強植物對干旱等多種逆境的適應能力。精胺和 亞精胺在植物體內還具有調控基因的表達、影響DNA、RNA和蛋白質的生物合成，細胞分裂、 分化等多種生物學功能。與此同時，精胺和亞精胺能抑制磷脂雙分子層的運動、能提高類囊 體膜在受脅迫時的穩(wěn)定性進而增強植物的抗旱性。當植物受到干旱脅迫時，腐胺含量增加， 過量的腐胺轉化為精胺、亞精胺，進而通過抑制衰老來提高植物對干旱等逆境的抗性。同 時，精胺和亞精胺又可反饋調節(jié)腐胺的含量，從而使植物在脅迫后恢復正常的代謝和表型。因此，通過調控SAMDC的活性進而改變代謝過程中精胺、亞精胺含量，便植物的抗 旱性等多種抗逆性得綜合改良，將為實施植物抗旱基因工程提供新的選擇途徑，對提高農 作物和經濟作物及能源植物的抗旱性具有重要應用價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種與植物抗旱相關的蛋白。本發(fā)明提供的蛋白是羊草亞精胺和精胺合成途徑中的限速酶硫腺苷甲硫氨酸脫 羧酶，名稱為 LcSAMDCI 來源于羊草 Leymus chinensis (Trin.) Tzvel.，是如下 1)或 2)1)由序列1所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；
2)將序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加且與植物多胺合成相關的由1)衍生的蛋白質。序列表中序列1由392個氨基酸殘基組成，自氨基末端第5位-第339位氨基酸 殘基為SAM_deCarb0X的保守結構域，自氨基末端第68位-第70位氨基酸殘基為酶原剪切 位點序列，自氨基末端第247位-第318位氨基酸殘基為PEST位點序列。為了便于LcSAMDCl的純化，可在由序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質的氨基 端或羧基端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tag II8WSHPQFEKc-my c10EQKLISEEDL上述幻中的LcSAMDCl可人工合成，亦可先合成其編碼基因，再進行生物表達得 到。上述2~)中的LcSAMDCl的編碼基因可通過將序列2的自5'末端第555-1733位堿基所 示的DNA序列中缺失編碼一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，進行一個或幾個堿基對的錯義 突變，和/或在該序列5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列獲得。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述蛋白的編碼基因具體可為如下1)-5)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第555-1733位所示的基因；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2的自5'末端第1-1890位所示的基因；3)其核苷酸序列是序列表中的序列2的基因；4)在嚴格條件下可與1)或幻或幻限定的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；5)與1)或2)或3)限定的基因具有90%以上的同源性且編碼編碼所述蛋白的基 因。序列表中的序列2由1905個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第 555-1733位堿基，編碼氨基酸序列是序列表中序列1的LcSAMDCl蛋白。上述嚴格條件可為在0. IX SSPE (或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件 下雜交并洗膜。含上述編碼基因的轉基因細胞系、重組載體以及重組菌株也屬于本發(fā)明的保護范 圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含有LcSAMDCl基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體及可用于植物基因槍法轉化的載體等，如pBI121、pBinl9、 PCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1301_UbiN、pCAMBIA1300 或其它衍生植物表達載體。 帶有本發(fā)明的LcSAMDCl的植物表達載體可通過Ri質粒、Ti質粒、植物病毒載體、電導、直接 DNA轉化、顯微注射、農桿菌介導等生物學方法轉化到植物細胞或組織中。被轉化的植物宿 主既可以是高粱、水稻、玉米，甘蔗等單子葉植物，也可以是擬南芥、煙草、大豆、番茄、楊樹、 苜宿等雙子葉植物。使用LcSAMDCl基因構建重組表達載體時，可在其轉錄起始位點前加上任何一種 增強型、組成型、組織特異型或誘導型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛 素基因WDiquitin啟動子(pW3i)、脅迫誘導型啟動子Rd29A等，它們可單獨使用或和其它 的植物啟動子結合使用；另外，使用本發(fā)明所述的基因構建植物表達載體時，也可使用增強 子，包括翻譯增強子和轉錄增強子，這些增強子所增強區(qū)域可以是ATG起始閱讀框或鄰接 區(qū)域起始閱讀框等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以確保整個序列的正確翻譯。所述翻 譯調控信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域 可來自轉錄起始區(qū)域或結構基因。為了便于鑒定及篩選轉基因植物細胞或植物，可以對所用植物表達載體進行加 工，例如加入能在植物中表達可產生顏色變化的酶或者發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光 素酶基因)、抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物)或者抗化學試劑標記基因 (抗除莠劑基因)等。所述重組載體具體是在載體pYES2的多克隆位點間插入上述基因得到的重組表 達載體。擴增上述基因的全長或任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的另一目的在于提供一種培育亞精胺合成量增加的轉基因酵母的方法。本發(fā)明提供的培育亞精胺合成量增加的轉基因酵母的方法，是將上述的基因轉入 目的酵母中，得到轉基因酵母，所述轉基因酵母的亞精胺合成量高于所述目的酵母。上述的 基因是通過上述的重組載體導入所述目的酵母中的。上述目的酵母為酵母突變體Y0L052C。實驗證明，LcSAMDCl可以調控植物亞精胺和精胺的合成，受干旱脅迫誘導，可以參 與羊草對干旱脅迫的響應，提高植物的抗旱性。LcSAMDCl及其編碼基因對于培育抗旱性提 高的羊草及其他植物新品種具有重要實用價值，可用于農牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理及能源植物 所需的抗旱新品種的培育與鑒定，具有較高的應用價值。本發(fā)明在農業(yè)、畜牧業(yè)及綠色清潔 能源等領域具有廣闊的應用前景。


圖1為經20% PEG處理的羊草幼苗總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；圖2為3’ RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；圖3為5’ RACE產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；圖4為PCR擴增LcSAMDCl全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；圖5為LcSAMDCl的保守結構域的位置示意圖；圖6為LcSAMDCl的ORF及其功能位點示意圖；圖7為LcSAMDCl與其它植物的SAMDC蛋白氨基酸序列的同源性分析結果；圖8為LcSAMDCl的系統(tǒng)進化樹；
圖9為LcSAMDCl基因在干旱處理條件下的表達模式(半定量RT-PCR)；圖10為LcSAMDCl基因在干旱處理條件下的表達模式(實時定量PCR)；圖11為不含亞精胺的培養(yǎng)基中a、b和c三種酵母株系的生長情況；圖12為含亞精胺的培養(yǎng)基中b和c兩種酵母株系的生長情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、羊草硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因LcSAMDCl全長cDNA序列的獲得一、羊草硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因LcSAMDCl 3’端序列的克隆1、植物材料處理及總RNA的提取以羊草(吉生一號，吉林省吉生羊草良種站，遺傳資源來源披露登記表見表2)幼 苗為材料，PEG處理6小時后提取總RNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。 所提取的RNA有兩條明顯的電泳條帶，從上到下依次為^S RNA和18SRNA，表明獲得了純度 較高、較完整的總RNA。2、羊草硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因LcSAMDCl 3’端序列的克隆根據已公開的植物SAMDC的氨基酸殘基序列尋找保守區(qū)域，根據保守區(qū)域序列設 計引物，具體的引物序列如下
Lcl 5' -GAGGGCTACGAGAAGCGCCTCGAGATC-3‘以上述步驟1提取的經干旱處理的羊草幼苗的總RNA為模板，用ft~imeSCriptTMlSt Strand cDNA Synthesized Kit試劑盒(Takara公司)并參照試劑盒說明書的要求， 反轉合成其第一鏈cDNA。反應體系及反應條件如下01igO-dT(10pmOl/y 1)1μ 1， Total RNA ( ( 1 μ g) 2 μ 1, dNTP Mixture (10mmol/l each) 1. 0 μ 1,5 XBuffer 4. 0μ 1, RNaseInhibitor (40U/ μ 1)0. 5μ 1, PrimeScript RTase (200U/ μ 1)0. 5μ 1, RNase-free distilled waterll μ 1 ;65°C 5min，42°C 45min，70°C 15min。將合成的第一鏈 cDNA C存 于-20°C備用。以獲得的第一鏈cDNA為模板，引物Lcl與引物01igodT_adaptor5' -GATTTCTGTC CGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ‘配對進行PCR擴增；PCR反應體系為cDNA模板、Lcl引物 與OligodT-adaptor各 1 μ 1, IOXBuffer 2. 5 μ l,dNTP Mixture (10mmol/l each) 2 μ 1, Taq 酶 0. 25 μ 1，ddH20 12. 25 μ 1 ；反應條件為先 94°C預變性 5min ；然后 94°C 30s, 65°C 30s， 72°C 90s，共；35個循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。反應結束后，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖2所示。其 中，泳道M為DL2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準， 泳道1為3’ RACE PCR擴增產物，結果表明，經PCR擴增獲得了長度約為1300bp的目的片 段。回收并純化3’ RACE產物，將其連接到PMD-18T載體(Takara公司)上，連接產物轉化 大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞(北京全式金生物技術有限公司)，篩選陽性克隆進行菌液PCR 鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序，對測序結果進行BLAST分析。結果表明，該片段的長 度為1321bp，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序列3所示，與植物中已知的SAMDC類基因 的序列具有較高的同源性，表明該片段可能為羊草LcSAMDCl編碼基因的3’端序列。
二、羊草硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因LcSAMDCl 5’端序列的克隆根據上述步驟一獲得的LcSAMDCl基因3，端cDNA序列設計引物Lc2 5 ‘ -AACTTCTTCGTTCGCGGCAAAGCTC-3 ‘，以步驟一提取的經干旱處理的羊草幼苗的總 RNA為模板，采用!Iomega公司的5’ RACE試劑盒并參照試劑盒說明書，反轉錄合成其第 一鏈 cDNA。反應體系及條件如下1 μ 1 RNA, 1 μ 1 5' -CDS primer A, 1 μ ISMART II A oligo，lyl DTT (20mM)，1 μ 1 dNTP Mix (IOmM)，1 μ 1 MMLVReverseTranscriptase, 2 μ 1 5X First-Strand Buffer, 2 μ 1 sterile H2O ；70°C 2min，冰上 2min，42°C 1. 5h，72°C 7min。以獲得的第一鏈cDNA為模板，引物Lc2與引物UPM(Promega公司Long(0. 4 μ Μ) 5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ‘，Short (2 μ Μ) 5 ' -CTAATACGACTCACTATAGGGC-3 ‘)配對進行 PCR 擴增；PCR 反應體系為1 μ 1 50Χ Advantage 2Polymerase Mix,34.5 μ 1 PCR-Grade Water,5 μ 1 IOXAdvantage 2PCR Buffer,1 μ 1 dNTP Mix(IOmM)，1 μ 1 50Χ Advantage 2PolymeraseMix,5 μ 1UPM,1 μ 1 弓L Lc2 ，2. 5 μ IcDNA 模板；反應條件為先 94°C 30s，然后 68°C 30s, 70°C 60s，共；35 個循環(huán)； 最后70°C延伸IOmin0反應結束后，對PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。其 中，泳道M為DL2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術有限公司)的DNA分子量標準， 泳道1為5’ RACE PCR擴增產物，結果表明，經PCR擴增獲得了長度約為1600bp的目的片 段?；厥詹⒓兓?’ RACE產物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5ci 感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序，對測序結果 進行BLAST分析。結果表明，該片段的長度為1577bp，其脫氧核糖核苷酸序列如序列表中序 列4所示，與植物中已知的SAMDC類基因的5’端序列具有較高的同源性，表明該片段可能 為羊草SAMDC編碼基因的5’端序列。三、羊草硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因LcSAMDCl全長cDNA序列的獲得及PCR檢測利用上述步驟一和步驟二獲得的長度為1321bp和1577bp片段之間的重疊區(qū)，借 助Contig軟件拼接得到的LcSAMDCl基因的全長cDNA序列，其脫氧核糖核苷酸序列如序列 表中序列2所示。序列表中序列2由1905個堿基組成，自5’端第555位-第1733位為其 編碼序列，編碼具有序列表中序列1所示的氨基酸殘基序列的蛋白質。序列表中序列1由 392個氨基酸殘基組成。根據LcSAMDCl基因全長cDNA序列設計如下引物1:5' -GCCGCACGCTAACTCGTTCCACAAG-3‘，2:5' -TCTCCAAACAGTACGCTCATTGTGG-3‘。以上述步驟一提取的經干旱處理的羊草幼苗的總RNA經反轉錄合成的第一鏈 cDNA為模板，用本步驟的引物1和2進行PCR擴增。對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠 電泳檢測，結果如圖4所示。其中，泳道M為DL2000DNA分子量標準(北京全式金生物技術 有限公司)的DNA分子量標準，泳道1為PCR擴增產物。結果表明，經PCR擴增獲得了長度 約為1900bp的片段?；厥詹⒓兓摦a物，將其連接到PMD-18T載體上，連接產物轉化大腸 桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序。 測序結果表明，該PCR擴增產物與上述拼接得到的序列(序列2的自5’端第1-1905位) 在擴增部分完全相同，擴增部分的片段的核苷酸序列如序列2的自5’端第1-1890位所示，7自5’端第555位-第1733位為其編碼序列)，表明所克隆的3’ RACE片段和5’ RACE片段 屬于同一基因，將該基因命名為LcSAMDCI，將其編碼的蛋白命名為LcSAMDCl。實施例2、LcSAMDCl及其編碼蛋白的生物信息學分析—、LcSAMDCl基因的序列分析及其編碼蛋白的結構功能預測利用DNAMAN和OMIGA軟件對實施例1獲得的LcSAMDCl的全長cDNA序列進行生 物信息學分析，該序列全長19(^bp，自5，端第555位-第1733位為0RF，編碼由392個氨 基酸殘基組成的蛋白質LcSAMDCl，LcSAMDCl的結構示意圖如圖5所示。推測其分子量為 42. 881kDa，等電點 pi 值 4. 617。用在線 Blast 工具(http//blast, ncbi. nlm. nih. gov/ Blast, cgi)分析LcSAMDCl的結構域，結果表明，該蛋白含有一個典型的SAM_decarbox結構 域，即序列表中序列1自氨基端第5位-第339位氨基酸殘基，如圖5，該結構域由334個氨 基酸殘基組成，表明該蛋白是SAMDC家族中的一員。分析結果還表明，LcSAMDCl蛋白的氨 基端存在一個典型的酶原剪切位點，即圖6中實線方框中的SYVLSESSLF序列，羧基端存在 一個蛋白降解的PEST位點，即圖6中的虛線方框中的TIHVTPEDGFSYASYEV序列。上述分析 結果表明LcSAMDCl是一種硫腺苷甲硫氨酸脫羧酶，屬于SAMDC家族。二、LcSAMDCl與植物中其它已克隆的SAMDC類蛋白編碼氨基酸序列的同源性及系 統(tǒng)進化樹分析利用DNAMAN軟件對LcSAMDCl與植物中其它已克隆的SAMDC氨基酸序列(GeneBank登陸號為TaSAMDC AAD17232，NtSAMDC AAB88854, VvSAMDC CAD98785, TmSAMDC ABJ15728, OsSAMDC CAA69074, GmSAMDC AAL89723, IbSAMDC AAF71199, SISAMDC ABQ42184,MsSAMDCAB077440,ZmSAMDC CAA69075)進行同源性分析和系統(tǒng)進化樹分析，同源 性分析結果如圖7所示。結果表明，LcSAMDCl與單子葉植物小麥、水稻、玉米和甘蔗SAMDC 的同源性分別為95%,86^^84%和76% ；而與雙子葉植物擬南芥、大豆和葡萄等的SAMDC 的同源性在53%和56%之間，表明LcSAMDC與單子葉植物SAMDC的同源性較高，而與雙子 葉植物SAMDC的同源性較低。SAMDC類蛋白在進化過程中出現(xiàn)了較大的差異，但在每一類植 物中該蛋白相對比較保守，如圖8。實施例3、LcSAMDCl在干旱條件下的表達模式分析將正常生長8周的羊草幼苗進行不同時間(0、1、3、6、12、M小時)的干旱(20% 聚乙二醇6000)處理。分別提取上述處理羊草幼苗的總RNA，分別通過RT-PCR(引物為 LcSAMDCl 15' -AGGCATACGACTGCAACAACG-3‘ ；2:5' -ACGC-AGCAAACCACCTAGAGCT-3‘； 內參Actin :1:5' -TGGACTCTG-GTGATGGTGTGAG-3‘ ；2 5' -GTGCTAAGGGAGGCAAGGATG-3‘， 反應條件為94 "C 4min ；94 "C 30s, 60 "C 30s, 72 "C 30s, 25 個循環(huán))和實 時定量 PCR(引物為LcSAMDCl :1 :5 ‘ -CAACATTGTGGAGCAGGAGC-3 ‘ ；2 5 ‘ -CAGAAAATCATCGCATCACT-CG-3 ‘內參 Actin 1 :5 ‘ -CCCATGCTATC-CTTCGTCTCGACCT-3 ‘；2 5' -TCGTAGCTCTTCTCCACGGAGGAGC-3 ‘，反應條件為95°C IOs ；95°C 5s,60°C 20s, 72°C 30s, 40個循環(huán))方法分析LcSAMDCl基因在干旱條件下的表達模式，結果如圖9、10所 示。結果表明，LcSAMDCl雖具有一定的組成型表達，但其轉錄水平明顯受干旱誘導，隨著脅 迫時間的延長，LcSAMDCl基因的相對表達量迅速增加，到12h達到最大值。實施例4、LcSAMDCl的功能驗證一、LcSAMDCl 轉入酵母菌
將實施例1擴增得到的LcSAMDCI基因通過含有KpnI和NotlI酶切位點的引 物擴增(引物序列 1 :5 ‘ -GGTACCGCCGCACGCTAACTCGTTCCACA-3 ‘ ,2 5 ‘ -GCGGC-CGCTC TCCAAACAGTACGCTCATT-3 ‘)，將擴增得到的目的片段回收并純化，將其連接到pMD- 19T simple (TaKaRa Code :D104A)載體上，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性 克隆進行菌液PCR鑒定，提取陽性克隆的質粒進行測序。測序結果表明，擴增出的片段具有 序列2中的自5’端第1-1890位所示的核苷酸序列。提取測序結果正確的克隆中的質粒，用 KpnI和NotlI酶切后插入到通過同樣酶切的酵母誘導型表達載體pYES2(美國hvitrogen 公司)的KpnI和NotlI酶切位點間，將獲得的重組載體命名為pYES2-LcSAMDCl。將重 組載體pYES2-LcSAMDCl導入到SAMDC基因功能缺失的酵母突變體Y0L052c株系(德國 EUR0SCARF公司，商品目錄號Y01743)中，同時用轉入pYES2空載體的轉基因酵母和酵母突 變體Y0L052c株系作為負對照。以uracile為篩選標記，篩選轉pYES2_LcSAMDCl的轉基因 酵母和轉pYES2空載體的轉基因酵母。原理是Y0L052c株系是URA3缺陷型，pYES2上有 URA3，是尿嘧啶合成的關鍵酶基因，在不含uracile的培養(yǎng)基中，無pYES2的酵母菌不能生 長。將轉pYES2_LcSAMDCl的轉基因酵母、轉pYES2空載體的轉基因酵母和酵母突變 體Y0L052C株系分別在含有和不含有亞精胺的兩種SG培養(yǎng)基(SG培養(yǎng)基0.6% Yeast Nitrogen Base，2%半乳糖，補加所需各種氨基酸)中進行30°C連續(xù)培養(yǎng)4天。通過測定菌 液OD6tltl的值來監(jiān)測菌液的生長情況。結果如圖11和圖12所示。a表示轉入LcSAMDCl的轉基因酵母菌株系的生長，b 為轉入pYES2空載體作為負對照的轉基因酵母菌株系，c為酵母突變體Y0L052C株系。圖 11為不含亞精胺的培養(yǎng)基中a、b和c的生長情況，圖12為含有亞精胺的培養(yǎng)基中b和c的 生長情況。結果表明，在不含亞精胺的培養(yǎng)基中，a的菌液濃度趨于穩(wěn)定，b和c的菌液濃度 逐漸降低(圖11)，而在存在外源亞精胺的條件下，b和c亦可正常生長(圖12)。這些結 果說明LcSAMDCl能夠編碼有功能的LcSAMDCl蛋白，可互補SAMDC功能缺失的酵母突變體 株系，使其正常生長。序列表<110>中國科學院植物研究所<120> 一種來源于羊草的與抗旱相關的關鍵酶及其編碼基因與應用<160>5<210>1<211>392<212>PRT<213> 羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel.)<400>1MET Ala Ala Pro Val Ser Ala lie Gly Phe Glu Gly Tyr Glu Lys Arg151015Leu Glu lie Thr Phe Ser Glu Ala Ser lie Phe Ala Asp Pro His Gly202530Arg Gly Leu Arg Ala Leu Ser Arg Ala Gln lie Asp Ser Val Leu Asp
354045LeuAlaArgCysThrlieValSerGluLeuSerAsnLysAspPheAsp505560SerTyrValLeuSerGluSerSerLeuPhelieTyrSerGlnLyslie65707580VallieLysThrCysGlyThrThrMETLeuLeuLeuThrlieProArg859095IleLeuGluLeuAlaGluGluLeuCysMETProLeuAlaAlaValLys100105110TyrSerArgGlyMETPheliePheProGlyAlaGlnProAlaProHis115120125ArgSerPheSerGluGluValAspValLeuAsnArgTyrPheGlyGly130135140LeuLysSerGlyGlyAsnAlaTyrVallieGlyAspProAlaLysPro145150155160GlyGlnLysTrpHislieTyrTyrAlaThrGluGlnProGluGlnPro165170175METValThrLeuGluMETCysMETThrGlyLeuAspLysLysLysAla180185190SerValPhePheLysThrSerAlaAspGlyHisValSerCysAlaLys195200205GluMETThrLysLeuSerGlylieSerAsplielieProGluMETGlu210215220ValCysAspPheAspPheGluProCysGlyTyrSerMETAsnAlalie225230235240HisGlySerAlaPheSerThrlieHisValThrProGluAspGlyPhe245250255SerTyrAlaSerTyrGluValMETGlyMETAspAlaSerAlaLeuAla260265270TyrGlyAsplieValLysArgValLeuArgCysPheGlyProSerGlu275280285PheSerValAlaValThrliePheGlyGlyArgGlyHisAlaAlaThr290295300TrpGlyLysLysLeuAspAlaGluAlaTyrAspCysAsnAsnlieVal305310315320GluGlnGluLeuProCysGlyGlyValLeulieTyrGlnSerPheAla325330335AlaAsnGluGluValAlaValSerAlaGlySerProArgSerValPhe340345350
權利要求
1.一種蛋白，是如下1)或幻的蛋白質1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；2)將序列表中序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且與植物多胺合成相關的由1)衍生的蛋白質。
2.權利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)-5)中任一所述的基因1)其編碼序列是序列表中序列2的自5'末端第555-1733位所示的基因；2)其核苷酸序列是序列表中的序列2的自5'末端第1-1890位所示的基因；3)其核苷酸序列是序列表中的序列2的基因；4)在嚴格條件下可與1)或幻或幻限定的基因雜交且編碼權利要求1所述蛋白的基因；5)與1)或幻或幻限定的基因具有90%以上的同源性且編碼編碼權利要求1所述蛋 白的基因。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、轉基因細胞系或重組菌。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于所述重組載體為在載體PYES2的多 克隆位點間插入權利要求2、3所述基因得到的重組表達載體。
6.擴增權利要求2、3所述基因的全長或任一片段的引物對。
7.一種培育亞精胺合成量增加的轉基因酵母的方法，是將權利要求2或3所述的基因 轉入目的酵母中，得到轉基因酵母，所述轉基因酵母的亞精胺合成量高于所述目的酵母。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于權利要求2或3所述的基因是通過權利 要求4或5所述的重組載體導入所述目的酵母中的。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特征在于所述目的酵母為酵母突變體 Y0L052c。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種與植物抗旱相關的蛋白。本發(fā)明提供的蛋白來源于羊草Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.，是如下1)或2)1)由序列1所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；2)將序列1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物多胺合成相關的由1)衍生的蛋白質。通過調控LcSAMDC1的活性進而改變代謝過程中精胺、亞精胺含量，對提高農作物和經濟作物及能源植物的抗旱性具有重要的理論意義和應用價值，將為實施植物抗旱基因工程提供新的選擇途徑。
文檔編號C12N1/21GK102051351SQ200910236800
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月30日 優(yōu)先權日2009年10月30日
發(fā)明者劉公社, 彭獻軍, 李曉峰, 趙愛國, 陳雙燕, 齊冬梅 申請人:中國科學院植物研究所