專利名稱：納米藥物載體、還原響應(yīng)的納米藥物顆粒與納米藥物顆粒制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種納米藥物載體、還原響應(yīng)的納米藥物顆粒與納米藥物顆粒制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
納米藥物載體通常是指可以負(fù)載一種或多種藥物的具有納米級(jí)尺寸的體系。由于其具有量子尺寸效應(yīng)、兼有比表面積大、易于表面修飾等優(yōu)點(diǎn)，因此在藥物傳輸、控釋方面具有諸多優(yōu)越性。通常納米藥物載體有脂質(zhì)體、聚合物膠束、樹枝狀聚合物、碳納米管、量子點(diǎn)等多種形式?，F(xiàn)有的納米藥物載體仍然存在許多不足，如生物相容性不好、在血液循環(huán)中泄露較嚴(yán)重、不能很好的實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸、在靶點(diǎn)部位藥物釋放困難、不能同時(shí)負(fù)載多種小分子藥物、基因和蛋白等，這些缺點(diǎn)的存在很大程度上限制了納米載體的廣泛應(yīng)用。藥物在靶點(diǎn)部位釋放是藥物發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，如果藥物到達(dá)靶點(diǎn)部位后不能很好的釋放，則會(huì)使藥物無法發(fā)揮藥效。因此，刺激響應(yīng)釋放的共價(jià)體系受到廣泛的關(guān)注，其中pH響應(yīng)和酶響應(yīng)研究最為廣泛，而還原敏感體系則鮮有研究。

發(fā)明內(nèi)容
基于此，有必要提供一種能夠還原條件下使藥物在靶點(diǎn)部位較好釋放的納米藥物載體。進(jìn)一步，提供一種使用該納米藥物載體的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒。還提供一種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑及其制備方法?！N納米藥物載體，包括多糖形成的主鏈和形成在所述主鏈上的由聚乙烯亞胺形成的側(cè)鏈。
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在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述多糖選自葡聚糖、果膠、普魯蘭多糖、羥乙基纖維素、改性殼聚糖及環(huán)糊精中的一種。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述聚乙烯亞胺的分子量為60(Γ2000。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述多糖與所述聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為1:0.Γ0.6ο 一種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，包括阿霉素及上述納米藥物載體，其中，所述聚乙烯亞胺與所述阿霉素形成疏水內(nèi)核，所述多糖包覆在所述疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼。在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括包裹于所述親水外殼內(nèi)部的紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種與所述納米藥物載體的質(zhì)量比為0.05^0.4:0.ΟΓΟ.2:1。在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括吸附于所述聚乙烯亞胺上的基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種。
在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種、所述納米藥物載體與所述基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種的質(zhì)量比為
0.05 0.4:0.ΟΓΟ.2:1:0.θΓθ.2。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述基因物質(zhì)選自抑癌基因、自殺基因、小分子干擾核糖核酸、信使核糖核酸及反義核酸中的至少一種。在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的粒徑為100納米 200納米。一種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，包括超純水及分散于所述超純水中的上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為lmg/mL。一種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法，包括如下步驟:將多糖、對(duì)硝基氯甲酸苯酯及4-二甲氨基吡啶溶于二甲基亞砜與吡啶的混合液中，冰浴反應(yīng)4小時(shí)，沉淀、離心收集、真空干燥，得到對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖；將所述對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖溶于超純水中，滴入聚乙烯亞胺，反應(yīng)12小時(shí) 24小時(shí)，透析凍干得到納米藥物載體，所述納米藥物載體為以多糖為主鏈，聚乙烯亞胺為側(cè)鏈接枝在所述多糖上；將阿霉素與二硫代二丙酸酐溶于N，N- 二甲基甲酰胺中得到混合物，反應(yīng)12小時(shí) 24小時(shí)，向反應(yīng)后的混合物中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行活化4小時(shí)，然后加入所述納米藥物載體，反應(yīng)24小時(shí)，透析得到濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括加入紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種的步驟，所述步驟為:將紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種溶于二甲基亞砜中得到藥物混合液，將所述藥物混合液與所述濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑混合后進(jìn)行超聲處理10分鐘，透析f 2天；其中，所述紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種與所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的質(zhì)量比為0.ΟΓΟ.2:1。在其中一個(gè)實(shí)施例中，還包括加入基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種的步驟，所述步驟為基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種加入所述濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中，于37°C孵育30分鐘；其中，所述基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種與所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的質(zhì)量比為0.ΟΓΟ.2:1。上述納米藥物載體為以多糖為主鏈，聚乙烯亞胺為側(cè)鏈接枝在多糖上。這種特性使得使用該納米藥物載體負(fù)載藥物時(shí)，藥物通過二硫鍵(-SS-)與該納米藥物載體連接，二硫鍵在還原環(huán)境的細(xì)胞內(nèi)斷鍵而將藥物較好地釋放于靶點(diǎn)部位。


圖1為一實(shí)施方式的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為一實(shí)施方式的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的還原環(huán)境和非還原環(huán)境下的狀態(tài)圖；圖3為一實(shí)施方式的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法流程圖；圖4為圖3所示的還原響應(yīng)的納 米藥物顆粒制劑的制備方法示意圖；圖5為實(shí)施例1的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的粒徑分布圖6為實(shí)施例1的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的TEM圖；圖7為實(shí)施例1的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的阿霉素分別在還原劑環(huán)境和無還原劑環(huán)境下的釋放曲線；圖8(a) 圖8(d)為實(shí)施例1的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的的共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做詳細(xì)的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細(xì)節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實(shí)施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進(jìn)，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實(shí)施的限制。一實(shí)施方式的納米藥物載體，以多糖為主鏈，以聚乙烯亞胺(PEI)為側(cè)鏈接枝在多糖主鏈上，表示為多糖-PEI。將該納米藥物載體通過化學(xué)鍵連接藥物，得到的納米藥物具有還原響應(yīng)。還原響應(yīng)是指在還原劑存在的環(huán)境下，將該納米藥物載體與藥物的連接的化學(xué)鍵發(fā)生斷鍵而解離；在沒有還原劑存在的環(huán)境下，化學(xué)鍵不會(huì)發(fā)生斷鍵。多糖為天然多糖。天然多糖具有生物相容性好、安全可靠、來源廣泛、價(jià)格低廉、可生物降解、易于修飾等眾多優(yōu)點(diǎn)，是一類具有很好應(yīng)用前景的生物可降解聚合物。優(yōu)選地,多糖選自葡聚糖(Dextran)、果膠(Pectin)、普魯蘭多糖(Pulullan)、輕乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose)、改性殼聚糖及環(huán)糊精(Cyclodextrin)中的一種。這幾種多糖均為水溶性多糖，利于制備水溶性制劑。聚乙烯亞胺用于實(shí)現(xiàn)藥物快速從溶酶體逃逸到細(xì)胞質(zhì)，使藥物免受溶酶體內(nèi)各種酶及酸性環(huán)境的破壞，利于藥效發(fā)揮。優(yōu)選地，聚乙烯亞胺的分子量為600 2000。分子量為600 2000的聚乙烯亞胺的毒
性較小。多糖與聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為1:0.Γο.6ο使用該納米藥物載體負(fù)載藥物，藥物通過二硫鍵(-SS-)與該納米藥物載體連接。血液循環(huán)系統(tǒng)中，還原劑谷胱甘肽(GSH)很微量，濃度很低，這種情況下納米藥物載體負(fù)載的藥物很穩(wěn)定；到達(dá)靶點(diǎn)部位，進(jìn)入細(xì)胞后，GSH含量比較高，約是血液中的1000倍，二硫鍵被打斷，藥物釋放于靶向部位。使用上述納米藥物載體負(fù)載藥物，可實(shí)現(xiàn)在血液循環(huán)中藥物基本無釋放，到達(dá)腫瘤部位后通過快速內(nèi)吞、溶酶體逃逸到達(dá)細(xì)胞質(zhì),然后通過還原響應(yīng)刺激快速釋放藥物,使藥物在靶點(diǎn)部位較好釋放，發(fā)揮藥效。上述納米藥物載體在血液循環(huán)中不會(huì)快速泄露，不會(huì)產(chǎn)生明顯毒副作用；可實(shí)現(xiàn)溶酶體逃逸，保護(hù)藥物活性，使藥物到達(dá)靶向部位時(shí)具有較高的活性；具有還原響應(yīng)性，可在細(xì)胞漿還原條件下，實(shí)現(xiàn)藥物的快速釋放；可同時(shí)負(fù)載蛋白、基因等多種物質(zhì)，進(jìn)行協(xié)調(diào)傳遞；可同時(shí)負(fù)載兩種不同的疏水藥物，進(jìn)行協(xié)同治療。因此，該納米藥物載體是一種性能優(yōu)良的納米藥物載體。一實(shí)施方式的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒， 包括阿霉素(DOX)及上述納米藥物載體。其中，阿霉素與上述納米藥物載體的質(zhì)量比為0.3:1。請(qǐng)參閱圖1，阿霉素通過二硫鍵(-SS-)與上述納米藥物載體連接，聚乙烯亞胺與阿霉素形成疏水內(nèi)核，多糖包覆在疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼。優(yōu)選地，還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的粒徑為100納米 200納米。優(yōu)選地，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒還包括包裹于親水外殼內(nèi)部的紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種。這幾種藥物為疏水性藥物。紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬是具有治療癌癥療效的物質(zhì)，紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種通過疏水作用包裹于親水外殼的內(nèi)部，可以實(shí)現(xiàn)多種藥物協(xié)調(diào)治療。阿霉素與紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種及納米藥物載體的質(zhì)量比為
0.05^0.4:0.θΓθ.2:1。該多糖-藥物共價(jià)納米體系帶有很強(qiáng)的正電荷，可同時(shí)包載蛋白質(zhì)分子、基因等物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)協(xié)同傳遞。優(yōu)選地，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒還包括吸附于聚乙烯亞胺上的基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種?；蛭镔|(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種通過靜電吸引吸附于聚乙烯亞胺上，包裹于親水外殼的內(nèi)部。圖1表示包括基因物質(zhì)的納米藥物顆粒的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，基因物質(zhì)選自抑癌基因、自殺基因、小分子干擾核糖核酸(SiRNA)、信使核糖核酸(mRNA)及反義核酸中的至少一種。蛋白質(zhì)分子為牛血清蛋白 (BSA)、雞卵白蛋白(OVA)或其他具有治療效果的蛋白分子。優(yōu)選地，阿霉素與紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種、納米藥物載體與基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種的質(zhì)量比為0.05^0.4:0.ΟΓΟ.2:1:0.θΓθ.2。請(qǐng)參閱圖2，在還原劑谷胱甘肽(GSH)存在的環(huán)境下，該納米藥物顆粒的二硫鍵斷裂，使還原響應(yīng)的納米藥物顆粒解離，從而將藥物阿霉素和基因物質(zhì)釋放。而在沒有還原劑谷胱甘肽(GSH)的環(huán)境下，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的結(jié)構(gòu)保持完整，藥物活性得到最大程度的保持。因此，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒中的多糖與阿霉素形成多糖-藥物共價(jià)納米體系，可實(shí)現(xiàn)在血液循環(huán)中藥物基本無釋放，到達(dá)腫瘤部位后通過快速內(nèi)吞、溶酶體逃逸到達(dá)細(xì)胞質(zhì)，然后通過還原響應(yīng)刺激使還原響應(yīng)的納米藥物顆粒解離而快速釋放藥物，能夠使藥物在靶點(diǎn)部位較好釋放，發(fā)揮藥效。該多糖-藥物共價(jià)納米體系是前藥膠束結(jié)構(gòu)，可同時(shí)包載其他小分子疏水藥物，實(shí)現(xiàn)多種藥物協(xié)同治療。一實(shí)施方式的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，包括超純水及分散于超純水中的上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為lmg/mL。經(jīng)測定,該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的Zeta電位大小為+30mV +50mV,說明該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑性質(zhì)較為穩(wěn)定。使用該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑進(jìn)行治療，可實(shí)現(xiàn)在血液循環(huán)中藥物基本無釋放，到達(dá)腫瘤部位后通過還原響應(yīng)刺激快速釋放藥物，使藥物在靶點(diǎn)部位較好釋放，治療效果好。并且，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑可實(shí)現(xiàn)多種藥物的協(xié)調(diào)治療和基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子的協(xié)調(diào)傳遞，療效好。請(qǐng)參閱圖3，一實(shí)施方式的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法，包括如下步驟:步驟SllO:將多糖、對(duì)硝基氯甲酸苯酯及4-二甲氨基吡啶溶于二甲基亞砜與吡啶的混合液中，冰浴反應(yīng)4小時(shí)，沉淀、離心收集、真空干燥，得到對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖。多糖選自葡聚糖、果膠、普魯蘭多糖、羥乙基纖維素、改性殼聚糖及環(huán)糊精中的一種。二甲基亞砜與吡啶的混合液中，二甲基亞砜與吡啶的體積比為1:1。多糖、對(duì)硝基氯甲酸苯酯、4-二甲氨基吡啶與二甲基亞砜與吡啶的混合液的固液比為 Ig:0.7g:0.05g:40mL。對(duì)多糖進(jìn)行活化，生 成對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖，以便于后續(xù)反應(yīng)，使聚乙烯亞胺接枝于多糖上。步驟S120:將對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖溶于超純水中，滴入聚乙烯亞胺，反應(yīng)12小時(shí) 24小時(shí)，透析凍干得到納米藥物載體，納米藥物載體為以多糖為主鏈，聚乙烯亞胺為側(cè)鏈接枝在多糖上。對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖、超純水與聚乙烯亞胺的固液比為0.5g:40mL:5g。步驟S130:將阿霉素與二硫代二丙酸酐溶于溶劑中得到混合物，反應(yīng)12小時(shí) 24小時(shí)，向反應(yīng)后的混合物中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行活化4小時(shí)，然后加入納米藥物載體，反應(yīng)24小時(shí)，透析得到濃度為lmg/mL的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。溶劑選自乙醚、丙酮、乙醇、甲醇、四氫呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、N-甲基吡咯烷酮的一種或兩種以上的任意混合。阿霉素、二硫代二丙酸酐與溶劑的固液比為0.15g:0.05g:30mL。阿霉素、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的質(zhì)量比為5:4:6。加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行活化的目的是活化改性后的阿霉素的羧基，從而跟聚乙烯亞胺的氨基反應(yīng)。阿霉素與納米藥物載體的質(zhì)量比為0.3:1。用截留分子量為3500的透析袋、用超純水透析f 2天，充分除去有機(jī)溶劑、雜質(zhì)及游離的阿霉素后，得到濃度為lmg/mL的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。請(qǐng)參閱圖4，上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法用聚乙烯亞胺(PEI)對(duì)多糖進(jìn)行改性，聚乙烯亞胺接枝于多糖上形成納米藥物載體，然后通過二硫鍵(-SS-)與抗腫瘤藥物阿霉素(DOX)連接，表示為(多糖-PEI (-SS-D0X))，在水中自組裝形成粒徑均一、性質(zhì)穩(wěn)定的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒。該納米藥物顆粒溶于超純水中，得到濃度為lmg/mL的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。該粒徑均一、性質(zhì)穩(wěn)定的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒中，聚乙烯亞胺與阿霉素形成疏水內(nèi)核，多糖包覆在疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼。上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和。
優(yōu)選地,上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法還包括加入紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種的步驟。該步驟具體為:將紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種溶于二甲基亞砜中得到藥物混合液，將藥物混合液與濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑混合后進(jìn)行超聲處理10分鐘，使紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種通過疏水作用包裹于納米藥物載體的親水外殼內(nèi)部，然后用超純水透析f 2天，除去游離的藥物、雜質(zhì)及有機(jī)溶劑，得到可以進(jìn)行多種藥物協(xié)同的治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。其中，紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種與還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的質(zhì)量比為0.θΓθ.2:1。優(yōu)選用截留分子量3500的透析袋進(jìn)行透析，以得到純凈度較高的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。優(yōu)選地，上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法還包括加入基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種的步驟。該步驟具體為:將基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種加入上述濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中，于37°C孵育30分鐘，使基因物質(zhì)或蛋白質(zhì)分子中的至少一種通過靜電作用吸附于疏水內(nèi)核上，得到可以將基因物質(zhì)與蛋白質(zhì)分子中的至少一種協(xié)同傳遞，協(xié)同治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，圖4表示了基因物質(zhì)吸附的狀態(tài)。其中，基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種與還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的質(zhì)量比為0.θΓθ.2:1。以下為具體實(shí)施例。實(shí)施例1
(I)將Ig葡聚糖、0.7g對(duì)硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4_ 二甲氨基卩比唳溶于40ml 二甲基亞砜與吡啶的混合液中(二甲基亞砜與吡啶的體積比為1:1)，冰浴反應(yīng)處，沉淀、離心收集、真空干燥，得對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖；(2)將0.5g對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亞胺，反應(yīng)過夜，用超純水透析，凍干得納米藥物載體一聚乙烯亞胺接枝葡聚糖，表示為dextran-PEI ；(3)將0.15g阿霉素與0.05g 二硫代二丙酸酐溶于30mL N，N_ 二甲基甲酰胺中得到混合物，反應(yīng)12小時(shí)，加入0.12gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0.18g 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化4小時(shí)，加入0.6g dextran-PEI，反應(yīng)24小時(shí)，用超純水透析得到還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑包括超純水及溶解于超純水中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為lmg/mL。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒包括阿霉素(DOX)及dextran-PEI,其中，dextran-PEI中的聚乙烯亞胺(PEI)與阿霉素(DOX)形成疏水內(nèi)核，葡聚糖(dextran)包覆在疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼。通過動(dòng)態(tài)光散射表征了該該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的平均粒徑為llOnm，如圖5和圖6所示。Zeta電位為+30mV。經(jīng)測定,納米藥物載體一聚乙烯亞胺接枝葡聚糖(dextran-PEI)對(duì)阿霉素包載量聞達(dá)28%。
以二硫蘇糖醇(DTT)作為還原劑，在IOmM的DTT環(huán)境下，阿霉素(DOX)可快速釋放；在沒有還原劑的環(huán)境下，阿霉素(DOX)基本無釋放，如圖7所示。將上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑進(jìn)行共聚焦實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明，還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑基本與溶酶體無共定位，如圖8 (a) 圖8 (d)所示，表明有效的溶酶體逃逸。實(shí)施例2(I)將Ig葡聚糖、0.7g對(duì)硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4_ 二甲氨基卩比唳溶于40ml 二甲基亞砜與吡啶的混合液中(二甲基亞砜與吡啶的體積比為1:1)，冰浴反應(yīng)處，沉淀、離心收集、真空干燥，得對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖；(2)將0.5g對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化葡聚糖溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亞胺，反應(yīng)過夜，用超純水透析，凍干得納米藥物載體一聚乙烯亞胺接枝葡聚糖，表示為dextran-PEI ；(3)將0.15g阿霉素與0.05g 二硫代二丙酸酐溶于30mL N，N_ 二甲基甲酰胺中得到混合物，反應(yīng)24小時(shí)，加0.12gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0.18g 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化4小時(shí)，加入0.6g dextran-PEI，反應(yīng)24小時(shí)，用超純水透析得到還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑包括超純水及溶解于超純水中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為lmg/mL。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒包括阿霉素(DOX)及dextran-PEI,其中，dextran-PEI中的聚乙烯亞胺(PEI)與阿霉素(DOX)形成疏水內(nèi)核，葡聚糖(dextran)包覆在疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼；(4)將紫杉醇溶于二甲基亞砜中得到濃度為2mg/mL的藥物混合液，將ImL藥物混合液與5mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑進(jìn)行混合后超聲處理IOmin,使紫杉醇通過疏水作用包裹于親水外殼的內(nèi)部，然后將超聲處理后的混合物放入截留分子量為3500的透析袋中，用超純水透析2天，除去游離的藥物、雜質(zhì)及有機(jī)溶劑，得到紫杉醇與阿霉素聯(lián)合治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。實(shí)施例3(I)將Ig果膠、0.7g對(duì)硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4-二甲氨基卩比唳溶于40ml 二甲基亞砜與吡啶的混合液中(二甲基亞砜與吡啶的體積比為1: 1)，冰浴反應(yīng)4h，沉淀、離心收集、真空干燥，得對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化果膠；(2)將0.5g對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化果膠溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亞胺，反應(yīng)過夜，用超純水透析，凍干得納米藥物載體一聚乙烯亞胺接枝果膠，表示為Pectin-PEI ；(3)將0.15g阿霉素與0.05g 二硫代二丙酸酐溶于30mL N，N_ 二甲基甲酰胺中得到混合物，反應(yīng)20小時(shí)，加0.12gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0.18g 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽( EDC)活化4小時(shí)，加入0.6g Pectin-PEI，反應(yīng)24小時(shí)，用超純水透析得到還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑包括超純水及溶解于超純水中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為lmg/mL。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒包括阿霉素(DOX)及Pectin-PEI,其中，Pectin-PEI中的聚乙烯亞胺(PEI)與阿霉素(DOX)形成疏水內(nèi)核，果膠(Pectin)包覆在疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼；
(4)將喜樹堿溶于二甲基亞砜中得到濃度為2mg/mL的藥物混合液，將ImL藥物混合液與5mL上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑進(jìn)行混合后超聲處理IOmin,使喜樹堿通過疏水作用包裹于親水外殼的內(nèi)部，然后將超聲處理后的混合物放入截留分子量3500的透析袋中，用超純水水透析2天，除去游離的藥物、雜質(zhì)及有機(jī)溶劑，得到喜樹堿與阿霉素聯(lián)合治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。(5)小分子干擾核糖核酸(SiRNA)加入上述喜樹堿與阿霉素聯(lián)合治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中，小分子干擾核糖核酸(SiRNA)與喜樹堿的質(zhì)量比為1:1，于37°〇孵育30分鐘，使小分子干擾核糖核酸(SiRNA)通過靜電作用吸附于疏水內(nèi)核的PEI上，得到可以將小分子干擾核糖核酸(SiRNA)、喜樹堿及阿霉素協(xié)同傳遞，協(xié)同治療的的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。實(shí)施例4(1)將Ig普魯蘭多糖、0.7g對(duì)硝基氯甲酸苯酯及0.05g 4_ 二甲氨基吡啶溶于40ml 二甲基亞砜與吡啶的混合液中(二甲基亞砜與吡啶的體積比為1:1)，冰浴反應(yīng)4h，沉淀、離心收集、真空干燥，得對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化普魯蘭多糖；(2)將0.5g對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化普魯蘭多糖溶于40ml水中，滴入5g聚乙烯亞胺，反應(yīng)過夜，用超純水透析，凍干得納米藥物載體一聚乙烯亞胺接枝普魯蘭多糖，表示為Pullulan-PEI ；(3)將0.15g阿霉素與0.05g 二硫代二丙酸酐溶于30mL N，N_ 二甲基甲酰胺中得到混合物，反應(yīng)18小時(shí)，加0.12gN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、0.18g 1_(3_ 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化4小時(shí)，加入0.6g PulIulan-PEI，反應(yīng)24小時(shí)，用超純水透析得到還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，該還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑包括超純水及溶解于超純水中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為lmg/mL。還原響應(yīng)的納米藥物顆粒包括阿霉素(DOX)及Pullulan-PEI，其中，Pullulan-PEI中的聚乙烯亞胺(PEI)與阿霉素(DOX)形成疏水內(nèi)核，普魯蘭多糖(Pullulan)包覆在疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼。(4)按質(zhì)量比為5:1分別將喜樹堿和紫杉醇溶于二甲基亞砜中得到濃度為2mg/mL的藥物混合液，將ImL藥物混合液與5mL上述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑進(jìn)行混合后超聲處理lOmin，使喜樹堿和紫杉醇通過疏水作用包裹于親水外殼的內(nèi)部，然后將超聲處理后的混合物放入截留分子量3500的透析袋中，用超純水透析2天，除去游離的藥物、雜質(zhì)及有機(jī)溶劑，得到喜樹堿、紫杉醇與阿霉素聯(lián)合治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。(5)將信使核糖核酸(mRNA)和牛血清蛋白質(zhì)加入上述濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中(信使核糖核酸(mRNA)和牛血清蛋白質(zhì)的質(zhì)量之和與喜樹堿和紫杉醇的質(zhì)量之和的比值為1: 1)，于37°C孵育30分鐘，使信使核糖核酸(mRNA)和牛血清蛋白質(zhì)通過靜電作用吸附于疏水內(nèi)核的PEI上,得到可以將信使核糖核酸(mRNA)、牛血清蛋白質(zhì)、喜樹堿、紫杉醇及阿霉素協(xié)同傳遞，協(xié)同治療的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種納米藥物載體，其特征在于，包括多糖形成的主鏈和形成在所述主鏈上的由聚乙烯亞胺形成的側(cè)鏈。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米藥物載體，其特征在于，所述多糖選自葡聚糖、果膠、普魯蘭多糖、羥乙基纖維素、改性殼聚糖及環(huán)糊精中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米藥物載體，其特征在于，所述聚乙烯亞胺的分子量為600 2000。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米藥物載體，其特征在于，所述多糖與所述聚乙烯亞胺的質(zhì)量比為1:0.Γο.6ο
5.一種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，包括阿霉素及如權(quán)利要求廣4任一項(xiàng)所述的納米藥物載體，其中，所述聚乙烯亞胺與所述阿霉素形成疏水內(nèi)核，所述多糖包覆在所述疏水內(nèi)核的表面形成親水外殼。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，還包括包裹于所述親水外殼內(nèi)部的紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種與所述納米藥物載體的質(zhì)量比為0.05^0.4:0.ΟΓΟ.2:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，還包括吸附于所述聚乙烯亞胺上的基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，所述阿霉素、所述紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種、所述納米藥物載體與所述基因物質(zhì)和蛋白質(zhì)分子中的至少一種的質(zhì)量比為0.05 0.4:0.01 0.2:1:0.01 0.2。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，所述基因物質(zhì)選自抑癌基因、自殺基因、小分子干擾核糖核酸、信使核糖核酸及反義核酸中的至少一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求5所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，其特征在于，所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的粒徑為100納米 200納米。
12.—種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑，其特征在于，包括超純水及分散于所述超純水中的如權(quán)利要求5所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒，所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的濃度為 lmg/mL0
13.—種還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 將多糖、對(duì)硝基氯甲酸苯酯及4-二甲氨基吡啶溶于二甲基亞砜與吡啶的混合液中，冰浴反應(yīng)4小時(shí)，沉淀、離心收集、真空干燥，得到對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖； 將所述對(duì)硝基氯甲酸苯酯活化多糖溶于超純水中，滴入聚乙烯亞胺，反應(yīng)12小時(shí) 24小時(shí)，透析凍干得到納米藥物載體，所述納米藥物載體為以多糖為主鏈，聚乙烯亞胺為側(cè)鏈接枝在所述多糖上； 將阿霉素與二硫代二丙酸酐溶于N，N- 二甲基甲酰胺中得到混合物，反應(yīng)12小時(shí) 24小時(shí)，向反應(yīng)后的混合物中加入N-羥基琥珀酰亞胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽進(jìn)行活化4小時(shí)，然后加入所述納米藥物載體，反應(yīng)24小時(shí)，透析得到濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法，其特征在于，還包括加入紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種的步驟，所述步驟為:將紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種溶于二甲基亞砜中得到藥物混合液，將所述藥物混合液與所述濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑混合后進(jìn)行超聲處理10分鐘,透析1 2天；其中，所述紫杉醇、喜樹堿及改性順鉬中的至少一種與所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒的質(zhì)量比為0.ΟΓΟ.2:1。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑的制備方法，其特征在于，還包括加入基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種的步驟，所述步驟為基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種加入所述濃度為lmg/mL還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中，于37°C孵育30分鐘；其中，所述基因物質(zhì)及蛋白質(zhì)分子中的至少一種與所述還原響應(yīng)的納米藥物顆粒制劑中的還原響應(yīng)的 納米藥物顆粒的質(zhì)量比為0.0Γ0.2:1。
全文摘要
本發(fā)明涉及納米藥物載體、還原響應(yīng)的納米藥物顆粒與納米藥物顆粒制劑及其制備方法。該納米藥物載體包括多糖形成的主鏈和形成在所述主鏈上的由聚乙烯亞胺形成的側(cè)鏈。這種特性使得使用該納米藥物載體負(fù)載藥物時(shí)，藥物通過二硫鍵(-SS-)與該納米藥物載體連接，二硫鍵在還原環(huán)境的細(xì)胞內(nèi)斷鍵而將藥物較好地釋放于靶點(diǎn)部位。
文檔編號(hào)A61K47/40GK103110955SQ201210568220
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者蔡林濤, 劉朋, 石碧華, 岳彩霞, 王碧, 易虎強(qiáng), 劉斌, 魏偉 申請(qǐng)人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院